CHAPITRE 4 : COMPOSITION DES MILIEUX DE CULTURE

1. Généralités.
a. Choix d'un système de culture

Le choix de culture se fait selon le type de cellules sélectionné et les objectifs expérimentaux.
Il faut prendre en compte l’expérience sur cellules en culture ou la culture sert juste à la
production de cellules. De combien de cellules a-t-on besoin ? Faut-il évaluer les réponses
sur cellules individuelles ? Ou les cellules adhèrent-elles au support ? Important pour la
composition du milieu de culture ;

b. Les 4 classes de solutés

Les milieux comprennent 4 Classes de solutés dans de l’eau pure :

- Classe I : les sels (pression osmotique (très important, compatibilité avec celle des
cellules pour qu’il n’y ai pas de transport d’eau), pouvoir tampon, oligo-éléments, ions
indispensables)
- Classe II : les molécules énergétiques carbonées et azotées.
- Classe III : les facteurs trophiques (AA et vitamines) : amenés par le sérum
- Classe IV : les facteurs de croissance et d’adhérence : amenés par le sérum
+ Antibiotiques

2. Composition des milieux de culture

a. Les solutions salines (Classe I et II)

Les rôles des solutions salines dans les milieux de culture et de maintenir l’équilibre osmotique
entre les milieux intra et extracellulaires. S’il y a trop de soluté dans le milieu, cela crée un
choc hyperosmotique (cellule perd son eau) provoquant un stress et une perte d’eau des
cellules. Les solutions salines permettent aussi d’assurer l’alimentation en eau et en ions des
cellules, fournir des sources d’énergie aux cellules sous forme de carbohydrates (on utilise
majoritairement le glucose) et maintenir un pH physiologique grâce à des systèmes tampons.
Les trois solutions salines les plus utilisées sont le EBSS (Earle's Balanced Salt Solution), le
HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) et le DPBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline).
Le DPBS est une solution très simple dans laquelle il y a du phosphate, énormément de
sodium et de chlorure pour assurer l’équilibre osmotique et un peu de potassium. Cette
solution est peu coûteuse qu’on utilise pour stocker et pour laver.
Pour les cultures on utilise soit le EBSS soit le HBSS. Ce qui les différencie est la présence
en grande quantité de bicarbonate dans le EBSS. Cette solution est prévue notamment pour
réaliser des cultures en présence de gaz carbonique (le bicarbonate permet de tamponner le
CO2 qui se dissout dans la solution). Le sodium est réduit dans l’EBSS dû à ajout de
bicarbonate (NaHCO3). Dans les deux solutions il y a du calcium (car on cultive des cellules
adhérentes), du glucose et du rouge de phénol (indicateur de pH). Le EBSS est plus utilisé
que le HBSS car il est rare de réaliser des cultures sans CO 2.
 EBSS : inspiration de ce qu’il y a dans le
sang et le milieu extracellulaire
Présence de beaucoup de bicarbonates qui
va avec le CO2 permettre de tamponner le
milieux (comme le système sanguin avec le
CO2 produit par les cellules)
NaCl important dans l’équilibre osmotique
Glucose (exception parfois pas 1g/L)

HBSS : beaucoup moins de bicarbonate

mais du coup utilisé quand on veut cultiver
sans CO2
Présence du tampon phosphate

DPBS : tampon phosphate utilisé pour laver

mais pas pour cultiver les cellules

i. Le pouvoir tampon du milieu

Le tampon idéal doit pouvoir contrôler le pH du milieu au plus proche des conditions
physiologiques (7,2 à 7,6). Il ne doit pas être toxique pour les cellules, perturber leur
fonctionnement et interférer avec les mesures à réaliser.

ii. Les tampons carbonate-bicarbonate

Le tampon carbonate-bicarbonate est le tampon le plus utilisé.

C’est le système le plus proche du système de contrôle du pH
dans le sang (concentration en bicarbonate : HCO3 de 24
mmol/L, pression partielle pulmonaire en CO2 de 40 mm de
Hg pour établir un pH de 7,4). Dans les milieux de culture on
essaye ainsi de reproduire les conditions physiologiques avec
une concentration en bicarbonate NaHCO3 de 2220 mg/L, une
atmosphère à 5% CO2 et un pH de 7,4.

CO2 de la phase gazeuse se dissoute dans le milieu et va

interagir avec les hydroxydes pour former du bicarbonate. Il
y a un équilibre. Si on augmente le CO2 = acidification du
milieu, si on le baisse = alcalinisation du milieu.

Si absence ou soucis de CO2 avec bouteille vide, on n’a

pas de CO2 donc plus de OH- donc alcalinisation du milieu,
le milieu deviendra rouge très foncé
Au contraire si beaucoup de CO2 on acidifie le milieu

Le Diagramme de Umbreit est une courbe qui indique le pH

en fonction de la quantité de bicarbonate et du pourcentage
de CO2 mis dans l’incubateur. Ainsi, autour de 2 mg/mL de
NaHCO3 et un pH de 7,4, on se retrouve avec un
pourcentage de CO2 de 5%.
 iii. Les tampons phosphates

Les tampons phosphates possèdent un PKa à 6,9 à 37°C.

Ils peuvent aussi être utilisés comme tampons mais présentent des inconvénients car ils
précipitent les ions calcium et magnésium aux concentrations utiles. Ils traversent mal les
membranes plasmiques (Bon tampon pour l’extérieur des cellules mais pas l’intérieur). Ils sont
consommés par les cellules. Et donc, ils sont utilisés surtout pour le lavage des cellules mais
pas dans les milieux de culture car trop d’inconvénients.

iv. Les tampons zwitterions

Ils sont nommés ainsi car ils contiennent à la fois des groupes ionisables positifs et négatifs.
Ils ont pour avantages de posséder un PKa physiologique et un bon contrôle du pH. De plus,
ils sont stables, solubles dans l’eau et non toxiques. Et, ils forment peu de complexes avec
les cations.
Mais ils ont pour inconvénients de pouvoir modifier la perméabilité membranaire, d’induire
certaines enzymes cellulaires et de perturber le transport du calcium.
Le tampon zwitterion le plus utilisé est le l’HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-
piperazineethanesulfonic acid).
HEPES on peut aussi le rajouter en plus du pouvoir tampon du bicarbonate CO2 et permet
de mieux lutter.
L’HEPES contrôle mieux le pH dans un environnement acide que le bicarbonate. C’est pour
cela qu’il est très utile en complément du bicarbonate lorsque des cellules produisent
énormément de protons ou, lors d’une culture en suspension, il y a des cellules avec un
métabolisme important (il y a alors un risque d’acidification du milieu car poussent rapidement
et consomment beaucoup de nutriments).

Beaucoup plus centré

sur les pH
physiologiques.
 .
Dans deux systèmes : si
uniquement bicarbonate,
rapidement si on ajoute
de l’acide le pH chute et
avec NaOH on va arriver
moins rapidement à des
pH physiologique que en
ajoutant de l’HEPES
(mieux tamponné)

La deuxième figure compare le pouvoir tampon (en blanc) de la solution NaHCO 3 seul avec
la solution NaHCO3+HEPES (en noir) à l’ajout de NaOH ou de HCl. On remarque que, seul,
le pH chute (ajout de base) ou augmente (ajout d’acide) très rapidement. Or, avec l’HEPES,
le pH varie moins drastiquement. Malgré tout, il y a peu de cas où il est nécessaire d’ajouter
l’HEPES. Il y a aussi possibilité d’en ajouter lorsqu'on cultive sur HBSS sans bicarbonate
pour faire une culture sans CO2.

Récapitulation
Solution saline de Earle ⇒ 2220 mg/L de bicarbonate de Na (physiologique : 2050 mg/L à

2800 mg/L) + destinée à la culture en étuve contenant 5% de CO2, avec ou sans HEPES.

Hank’s ⇒ 350 mg/L de bicarbonate, peu de phosphate, obtention d’un pH entre 7,15 et 7,25

sans CO2 + HEPES recommandé pour contrôler le maintiuen de CO2 car en absence de

tampon changement rapide dans le milieu

D-PBS ⇒ Utilisé surtout pour le lavage cellulaire, avec ou sans calcium.

b. Classe III : les facteurs trophiques (vitamines et AA)

Les vitamines sont amenées en partie par le sérum.

Les Acides aminés sont des composants essentiels du métabolisme cellulaire : survie,
croissance et différenciation. L’exigence des cellules en AA (nature, concentration) sont très
variées et dépendent du type cellulaire et de l'espèce animale d’où provient la cellule. On
considère qu’il y a des AA “essentiels” et d’autres “non essentiels“.
10 AA sont essentiels in vivo chez l’homme (huit chez l’adulte). Eagle a établi que in vitro, 13
AA étaient essentiels à la croissance cellulaire. Il en faut plus car il y a des mécanismes in
vivo qu’on appelle interconvertabilité (à partir d’un AA grâce au bagage enzymatique on a la
capacité de former d’autres AA) des AA qui permet de synthétiser cela à partir d’autres et
qui ne peut pas se faire in vitro car conditions non adéquates.

ARG (R) HIS (H) ILE (I) LEU (L)

LYS (K) MET (M) PHE (F) THR (T)

TRP (W) VAL (V)

CYS (C) TYR (Y) GLN (Q)

La glutamine est un AA particulier car il est instable et se dégrade en ammonium et

pyroglutamate en culture.
On conserve les milieux à 4°.
Après 1 mois on perds déjà 30% de la quantité de glutamine, elle se dégrade rapidement
sous l’effet de la température dans le milieu.
Il existe une alternative plus stable à la glutamine en utilisant des dipeptides de synthèse
appelés Glutamax® I et II, qui sont thermostables. Les Glutamax sont même résistants à
l'autoclavage. Le Glutamax I correspond à la L-alanyl-L-Gln (très stable) et le Glutamax II
correspond à la L-glycyl-L-Gln. Le Glutamax I est le plus utilisé.
W = with
WO = With-out

Certains AA sont non essentiels in vitro avec des quantités moindres nécessaires : sérine,
glycine, aspartate, asparagine, glutamate, proline, alanine, cela dépend tout de même des
milieux de culture.

c. Classe IV : les facteurs de croissance et d’adhérence

Les facteurs de croissance et d’adhérence sont amenés par le sérum (objet du cours
suivant).

3. Les milieux de culture

a. Les milieux de Eagle

Le MEM (milieu minimum essentiel) : Eagle’s minimal essential medium. C’est le plus utilisé
des milieux de culture. Il contient le minimum de ce qui est nécessaire et il convient à de très
nombreux types cellulaires. Il est composé de calcium (fait pour la culture de cellules
adhérentes). Il existe plusieurs références différentes avec des compositions différentes.
On retrouve des ions, certains AA, du glucose, de la vitamine et selon la référence on peut
additionner du bicarbonate de sodium car ils n’en ont pas mis.
Exemple : bicarbonate, on peut acheter ce milieu. On peut acheter aussi des ref ou se
bicarbonate n’est pas présent de ce cas la on dit qu’il faut l’ajouter.
Dans tous ces milieux on aura du carbohydrate tel que le glucose.
Il existe une formule modifiée du MEM selon Joklick pour des cellules en suspension. Il n’y a
pas de calcium car on ne veut pas d’adhérence cellulaire. Aussi, il y a deux fois plus de
glucose car lorsque les cellules sont en suspension il y en a beaucoup plus par unité de
volume, le nombre de cellule lorsqu’elles sont en suspension est beaucoup plus important.

La glutamine est très importante notamment pour le métabolisme énergétique. C'est un AA

qui rentre directement dans le Cycle de Krebs. Il est notamment utilisé par les cellules
tumorales en culture pour l'énergie.

b. Les milieux 199

Les milieux 199 ont été formulés au départ pour la culture d’explants primaires ; pour la
culture des cellules non transformées. Et ils sont beaucoup utilisés en virologie dans la
production de vaccins.

c. Les milieux RPMI

Ils se nomment ainsi car développés par Moore et al. au Roswell Park Memorial Institute en
1966. Ils ont été formulés au départ pour la culture de cellules lymphoblastoïdes en
suspension. Mais en présence de sérum, ils conviennent à la culture de nombreuses
cellules en culture, aussi adhérentes. (ex : fibroblastes)
Ils conviennent aussi à la culture de cellules sans sérum.
Il y a des options généralement proposées (sans rouge de phénol (notamment lors de
clonage car toxique), sans calcium (milieu en suspension) avec sels de Hank’s à la place
des sels de Earle (sans CO2) et avec du pyruvate (produit par la glycolyse anaérobie et
entre dans le cycle Krebs ; remplace le glucose = source d’énergie plus rapidement
disponible que si l’on met directement du glucose). Bien pour les cellules ayant un
métabolisme important
HEPES si acidification à contrôler.

d. Autres milieux

Les milieux définis sont des milieux où l'on connaît exactement sa composition. On
ajoute les hormones et facteurs de croissances à partir de solution prête à l’emploi
contrairement aux autres milieux où le sérum, provenant des animaux, est fluctuant et
peuvent être source de biais des expériences réalisées.
Le sérum est par exemple un milieu indéfini car on ne sait pas exactement la composition du
milieu dans lequel on fait croître nos cellules.
Important aussi en cas de réinjection des cellules chez des patients d’avoir un milieu défini,
interdit d’utiliser du sérum animal dans ce cas.
 4. Le choix du milieu de culture

Comme déjà dit auparavant ; le choix du milieu de culture est fait selon l'espèce d’où
proviennent les cellules, le type de culture et les objectifs fixés.
Il faut se référer à la littérature, faire des tests si nouveau type cellulaire ou mettre au point
des nouvelles conditions de culture. On peut également faire des mélanges de milieux de
culture.

a. Types cellulaires et milieux de culture

Pour de nombreuses espèces, les milieux 199, MEM, DMEM, F12K et MCDB 202.
Pour les cellules d’homme et de singe,les milieux 199, MEM, RPMI 1640, CMRL 1.969,
MCDB 104 et MCDB 202.
Pour les cellules de rat et de lapin ; les milieux MEM, F12K et MCDB 104.
Pour les cellules non transformées de souris, les milieux DMEM, CMRL 1.415, MCDB 202 et
MCDB 401.
Et pour les cellules de poulet les milieux 199, DMEM, F12K et MCDB 202.
Il existe pleins d’autres milieux…