MÉTHODES DE DIAGNOSTIC

VIROLOGIQUE

Microbiologie élémentaire
PCEM2

Dr Salma MHALLA
 Généralités
📫 Infections bénignes 🡺 dg virologique non indiqué

📫 Indications:
◻ Infections sévères ou I° chez un ID

◻ Diminuer la consommation inutile des ATB

◻ TTT antiviral spécifique (Grippe, herpèsvirus,

VIH...)
◻ Surveillance épidémiologique (grippe)

◻ Lors d’I° d’étiologie inconnue (cancer, maladies

auto-immunes…)
📫 Intérêt de la sérologie:

◻ Statut immunitaire (diagnostique ou avant vaccin)

◻ Suivie d’une I° persistante ou d’un TTT antiviral

 METHODES DIRECTES
🢩 Détection et caractérisation du virus ou
l’un de ses constituants

METHODES INDIRECTES
🢩 Détection, titrage et caractérisation des
anticorps spécifiques
DIAGNOSTIC INDIRECT
I- Diagnostic indirect : sérologie

Tests
sérologiques

Anticorps élaborés par l’hôte infecté

en réponse à l’infection virale
Cinétique de la réponse immunitaire
 2 prélèvements consécutifs
à 15j d’intervalle

2 prélèvements consécutifs
à 15j d’intervalle

Diagnostic d’une infection en cours

Test d’avidité des IgG
IA ⬄ I° ancienne
 1- Prélèvements
- 5 à 10ml de sang veineux sur
tube sec + centrifugation
🢩 sérum

- Transport à température
ambiante

- Éviter la conservation de sang

total à +4°C après prélèvement

- Autres prélèvements: LCR, liquide oculaire, liquide amniotique….

2- Techniques :

◻ Plusieurs méthodes immunologiques :

◻ principe général : formation d’un complexe
antigène–anticorps.
2.1 Techniques ELISA
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

◻ Principe général:

1) Formation d’un complexe Ag-Ac

2) Détection du complexe Ag-Ac

Ig humaine marquée
marquée Sérum

Réactif commercial sur base solide: Microplaque,

lame de verre/plastique, mb de nitrocellulose/nylon…
2.2 L’immunofluorescence

Molécule fluoréscente: Immunofluorescence (IF)

2.3 Technique d’immunoblot (Western blot)

📫Immuno-empreite (tests de confirmation)

Western blot (VIH), Immunoblot (VHC)
Western Blot VIH-1
• 1: Contrôle +
• 2: Contrôle -
• A: Négatif
• B: Indéterminé
• C: Positif
 Avantages :
Rapidité, Simplicité, Caractère standardisé automatisable, Faible coût
Inconvénients :
- Délai : « fenêtre sérologique »
- Manque de fiabilité si immunodéprimé
- Difficultés d’interprétation (transfusé, transplanté, nouveau-né…)
- Faux positif++

⇨ Le diagnostic direct reste à privilégier, surtout en cas d’infection aigue

DIAGNOSTIC DIRECT
2.1- Prélèvement : conditionne le résultat
◻ Sanguin: tube contenant un anti-coagulant (EDTA)
Permet de séparer les leucocytes
des autres éléments sg
🡺 Ex: recherche du CMV

◻ Selles/urines
◻ LCR Tube stérile sec
◻ Ponctions diverses…
◻Écouvillonnage stérile: gorge, nez, lésion, œil…
🡺 milieu de transport
◻ Dans tous les cas:

Acheminement rapide (4h) +++

Préserver l’infectiosité, antigénicité
Intégrité du virus
Qualité des Ac nucléiques

À + 4°C (tube dans de la glace)

Éviter la prolifération des bactéries
TECHNIQUES D’ETUDE DIRECTES
TECHNIQUES D’ETUDE DIRECTES
TECHNIQUES D’ETUDE DIRECTES
VISUALISATION DES
PARTICULES VIRALES
 Microscopie électronique:
Principe
📫 Visualisation de la particule virale, dans le prélèvement
📫 Agrandissement 10 – 40 X
celui du microscope optique
📫 Utile ++ Vs non cultivables
📫 Mais il faut une Gde quantité
de virus (106/mL) et pas de diff°
entre les familles
 Microscopie électronique:
Avantages et limites

◻ AVANTAGES ❑ LIMITES

– Équipement coûteux
– virus non
cultivables
gastro-entérites virales : – Manque de sensibilité:
rotavirus, calicivirus, * Nécessité d’une bonne
astrovirus…. concentration en virus
* Ne permet pas de différencier
– Nouveaux virus entre les virus de la même
famille
Microscopie électronique:
Exemples
 ISOLEMENT VIRAL
PAR CULTURE CELLULAIRE

Virus = replication intra-cellulaire obligatoire

🢩Culture possible sur ¢ vivantes sensibles
 Culture cellulaire:
Avantages
◻ Demeure la technique de référence car elle permet:

1- Isolement viral ⬄ preuve d’infectiosité

2- Mise au point de vaccins

3- Étude de sensibilité aux antiviraux

 Manipulation sous
hotte à flux laminaire

Asepsie rigoureuse
◻ Après inoculation sur cellules permissives:

On observe une altération morphologique: l’ECP

Confirmation par un autre test (ex: IF)
 Culture de cellules saines

Inoculation par un prélèvement

contenant un virus

Effet cytopathogène (ECP)

À rechercher quotidiennement
ECP généralement caractéristique d’un genre/famille de virus
🢩 Nécessité de confirmation par un test spécifique

Cas du virus de la rougeole

Cellules B95a non infectées ECP sous forme de syncythium

S’agit-il du virus de la rougeole ou autre paramyxovirus?

ECP généralement caractéristique d’un genre/famille de virus
🢩 Nécessité de confirmation par un test spécifique

Délai de la culture long

🡺 Recours au techniques de culture rapide
Immunofluorescence

Cellules non infectées Fluorescence spécifique

du virus de la rougeole
 DÉTECTION DES
ANTIGÈNES VIRAUX

•Largement utilisées
•Résultat rapide (quelques heures)
• Matériel riche en virus: prélèvement de qualité +++
• Ac adsorbé sur support solide
Plusieurs techniques :
Immunofluoréscence

IF indirecte IF directe
Technique ELISA
 Technique
d’immunochromatographie

- Détection des rotavirus

et des adénovirus
dans les selles

- Détection des virus

respiratoires
 TROD
◻ dépistage de masse surtout ++ populations à risque / situations
urgentes.
◻ technique immunochromatographie unitaire sur bandelette ou
savonnette, qui porte soit l’antigène (Ex : TROD du VIH, VHC)
soit un anticorps spécifique du virus à rechercher (Ex : TROD du
VHB).
◻ utilisables sur sang ou salive et doivent présenter une bonne
spécificité.
◻ moins sensibles que les tests classiques 🡺 confirmation si (+)
Technique d’agglutination

Agglutination de billes de latex

sensibilisées

Ex: Détection des rotavirus

et des adénovirus
dans les selles
 DÉTECTION DES GÉNOMES VIRAUX
- HYBRIDATION MOLÉCULAIRE

• Détection directe de l’ADN/ARN sur:

- support solide: (Dot-blot, Southern-blot)
-in-situ: (sur coupe tissulaire, Ex: HPV sur biopsie
de cancer du col de l’utérus
🡺 Prélèvement doit être riche en Ac nucléiques
 DÉTECTION DES GÉNOMES VIRAUX
- AMPLIFICATION GÉNIQUE

• Méthodes REVOLUTIONNAIRES
• Rapide, sensible++
• Applicable sur les virus non cultivables
• Amplification 109 fois

🡺 Prélèvement riche/pauvre en Ac nucléiques

Extraction de l’ADN
Polymerase Chain
Reaction : PCR

+2 Amorces spécifiques du
virus: sens et anti-sens

+ ADN polymerase (Taq)

+ désoxyribonucléotides:
dATP, dCTP, dGTP, dTTP

20-40 cycles d’amplification

Cas des génomes à ARN:
RT-PCR
 PCR en temps réel
Amplification avec mesure de l’accumulation
du produit amplifié au cours de la phase exponentielle

🢩 Quantification réalisée en cours d’amplification

 PCR en temps réel

📫 Sensibilité/Spécificité+++
📫 Émission de fluorescence en cours d’amplification
📫 Automatisation, multiplex (plusieurs gènes ou germes
ciblés)
📫 Mesure de l’intensité de fluorescence
Fluorescence proportionnelle à la quantité d’ADN amplifié
PCR quantitative: quantification de la charge virale (VIH,
virus des hépatites…)