DIAGNOSTIC VIROLOGIQUE DES

INFECTIONS RESPIRATOIRES

Dr Manel Marzouk
Laboratoire de Microbiologie
Faculté de Médecine de Sousse
 Citez les virus respiratoires que vous
connaissez
 Virus Influenza

Virus respiratoire syncytial (VRS)

Métapneumovirus humain

Virus parainfluenza 1, 2, 3 et 4

Herpesviridae
Adénovirus (HSV,VZV,CMV,EBV)
Coronavirus
Rougeole
Rhinovirus

Entérovirus

Bocavirus

Parechovirus

Polyomavirus
 Fréquentes / Epidémiques

Les infections respiratoires de l’enfant sont à 80 % d’origine virale.

 Parfois graves :

- Extrêmes d’âges / immunodéprimé

- Bronchiolites VRS
- Grippe : pandémie : nombre de décès ↗
‐ COVID 19 : pandémie

 Virus respiratoire : Organe cible habituel et principal : l'arbre respiratoire.

 Grande variétés de virus / nouveaux virus : Plusieurs familles virales

 Peu de vaccins / peu de traitement spécifique

 Virus Influenza morbi‐mortalité
surveillance étroite, tant au
niveau national qu’au niveau
Virus respiratoire syncytial (VRS)
international (réseaux OMS)

Métapneumovirus humain
Bronchiolite du
nouveau‐né /nourrisson
Virus parainfluenza 1, 2, 3 et 4

Adénovirus

Coronavirus

Rhinovirus

Entérovirus

Bocavirus

Parechovirus

Polyomavirus
 RV, Coronavirus…… Rhinite
VRS, Adenovirus Otite
Adenovirus Parainfluenza Pharyngite
ParaInfluenza Laryngite

VRS, RV, ADV, Bronchites

Influenza virus
Bronchiolites
ParaInfluenza
Coronavirus
Métapneumovirus Pneumonies
Bocavirus
Polyomavirus
« nouveau » virus

*Laurent Andréoletti
 Héla KARRAY‐HAKIM, Séminaire‐Atelier « Viroses respiratoires » , 18 Avril 2005

Nouvelles techniques de PCR

Notion d’associations virales ++++ : signification ?
coronavirus NL63, HKU1, OC43, and 229E  21.50% : Bronchiolites +++
Pertinence du diagnostic virologique
d’une virose respiratoire ?
 Pertinence du diagnostic virologique
d’une virose respiratoire ?
 Diagnostic COVID19

 Formes sévères +++

 But Diagnostic : Pour rattacher un syndrome clinique respiratoire à une étiologie

virale

 Orientation thérapeutique :

‐ Prise en charge adaptée

‐ éviter traitement antibiotique abusif

‐ Raccourcir période hospitalisation

 Précaution /prévention :

isolement / précaution transmission aérienne

 But épidémiologique
Quel prélèvement ?
Virus de la Prélèvement
grippe
un prélèvement à visée diagnostique

 dans les premiers jours de la

maladie+++

l’épithélium cilié des voies aériennes supérieures : la

muqueuse nasale

Hall CB JID, 1975; 131: 1‐5

SARS‐CoV‐2
 Prélèvement

Types de prélèvement:
‐ voies aériennes inférieures
• Expectorations : 3‐5ml
• Aspiration trachéale : malade intubé 2‐3ml
• LBA

‐ voies aériennes supérieures

 Lavage‐aspiration nasale (prélèvement de choix)
 Écouvillonnage nasopharyngé

‐ Autres: sang (sujets virémiques), fragments de biopsie

VRS Prélèvement
+++ Aspiration naso‐pharyngée
Diagnostic de l’infection à SARS‐CoV‐2

Proper collection of specimens is the most

important step in the laboratory diagnosis
of infectious diseases.
A specimen that is not collected correctly
may lead to false negative test results.

 Préleveur expérimenté !!!!


EPI
• Solution hydro‐alcoolique (SHA)
• sur blouse à manches longues, tablier
imperméable en plastique
• masque type FFP2
•Gants à usage unique
•lunettes de protection / Visière
‐Ecouvillon flexible stérile
uniquement écouvillons en fibres
synthétiques, Dacron, polyester ‐tiges en
plastique.
Ne pas utiliser : écouvillons d'alginate de
calcium ou avec des manches en bois, 
risque d’inhibiteur de PCR
‐Milieu de transport virologique (type VTM
pour Viral Transport Medium)
‐Etiqueter / nom du patient
 Respecter
le triple emballage
 Prélèvement
Milieu de transport

Ces prélèvements peuvent attendre

Plus de 48 heures à température
ambiante avant
D’être traités par le laboratoire de
virologie, cela sans réduction des
possibilités de détection de la plupart des
virus respiratoires.
 Techniques de diagnostic

 Diagnostic Direct
 Microscopie électronique
 Culture virale
 Détection antigénique
 Détection du génome viral

 Diagnostic indirect
 Détection des anticorps
 Techniques de diagnostic

 Diagnostic Direct
 Microscopie électronique
 Culture virale
 Détection antigénique
 Détection du génome viral

 Diagnostic indirect
 Détection des anticorps
 Techniques de diagnostic
V.Influenza

 Diagnostic Direct
 Microscopie électronique
 Culture virale
 Détection antigénique Coronavirus
 Détection du génome viral

 Diagnostic indirect
 Détection des anticorps
Metapneumovirus
 Techniques de diagnostic

 Diagnostic Direct
 Microscopie électronique
Culture cellulaire
 Culture virale
Culture sur œuf embryonné
 Détection antigénique
 Détection du génome viral

 Diagnostic indirect
 Détection des anticorps
 Culture cellulaire : Isolement viral
Effet cytopathogène :
Cellules saines Identification
ECP
immunologique
IF//IHA….
 Inoculation du virus sur œuf de poule embryonné
(Virus de la grippe)

Incubation (24h‐3j) à 35‐37°C

Révélation : par HA sur LA ou sur liquide allantoïque

Si HA(+)  identification du sous‐type par IHA/INA

(Ac Spécifiques du type et du variant)

 Techniques de diagnostic

 Diagnostic Direct
 Microscopie électronique
 Culture virale
 Détection antigénique
Les plus utilisées en routine
 Détection du génome viral

 Diagnostic indirect
 Détection des anticorps
 Techniques de diagnostic

 Diagnostic Direct ++++

 Microscopie électronique
 Culture virale
 Détection antigénique
 Détection du génome viral
Immuno‐fluorescence
Immuno‐chromatographie
T. immunoenzymatiques (ELISA)

 Diagnostic indirect
 Détection des anticorps
  Immuno‐fluorescence
‐ Fixation des cellules sur lame
‐ Révélation par des anticorps dirigés contre
les protéines virales et marqués par une
molécule fluorescente
‐ Lecture au microscope à fluorescence
 Immuno‐fluorescence
  Immuno‐fluorescence

(A) Contrôle (‐) (B) Adénovirus (C) Influenza A (D) Influenza B

(E) Virus para (F) Virus para (G) Virus para (H) VRS
Influenza ‐1; Influenza ‐2 Influenza ‐3
 Techniques de diagnostic

 Diagnostic Direct
 Microscopie électronique
 Culture virale Immuno‐fluorescence
 Détection antigénique Immuno‐chromatographie
T. immunoenzymatiques (ELISA)
 Détection du génome viral

 Diagnostic indirect
 Détection des anticorps
 L’immuno‐chromatographie sur membrane :
Tests de Diagnostic rapides TDR
 Détecter la présence d’Ag viraux à l’aide d’Ac spécifiques (anti‐VRS
ou antigrippaux) adsorbés sur la membrane
 L’immuno‐chromatographie sur membrane :
Tests de Diagnostic rapides TDR
Diagnostic de l’infection à SARS‐CoV‐2

Détection du
Diagnostic moléculaire (PCR) génome

TECHNIQUE DE RÉFÉRENCE

La protéine S
S1 : attachement à la cellule cible
Diagnostic antigénique S2 : fusion membranaire

Détection des anticorps

Protéine N
Diagnostic antigénique de l’infection à SARS‐CoV‐2
Diagnostic antigénique de l’infection à SARS‐CoV‐2

Positivité surtout débit symptômes 

charge virale élevée (Ct ≤ 25)
• Symptomatiques +++
• Maximum : J5 Symptômes +++

Prélèvement respiratoire
Règles de biosécurité++++
 Techniques de diagnostic

 Diagnostic Direct
 Microscopie électronique
 Culture virale
 Détection antigénique
Exp : Diagnostic de
 Détection du génome viral ++++ l’infection à SARS‐CoV‐2

 Diagnostic indirect
 Détection des anticorps
 3&5
Extraction de l’acide nucléique Amplification du génome

Détection du génome

PCR classique PCR temps réel

 OMS, CDC et ECDC, la manipulation des échantillons microbiologiques d’un patient suspect de
COVID‐19 dans un LSB2 respectant les bonnes pratiques de travail
 Manipulation des échantillons respiratoires : sous PSM2, quelles que soient les activités réalisées
 Règles de biosécurité : EPI / désinfectants‐SHA/ précautions si aérosols : vortex‐centrifugation../
procédures écrites : exp: gestion déchets‐ d’incidents‐déversement échantillons / personnel limité
/ restrictions d’accés…
Tests RT‐PCR: détection génomique 4 à 8h « série »
Phase pré‐analytique

Extraction
ARN

Analyse
Tests RT‐PCR: détection génomique 4 à 8h « série »
Préparation du Dépôt
mix réactionnel D’AN

Analyse
Tests RT‐PCR: détection génomique 4 à 8h « série »

Phase pré‐ Extraction Préparation du Dépôt Amplification Analyse

analytique ARN mix réactionnel D’AN (RT‐PCR)

Tests « rapides » RT‐PCR

30 à 90 minutes
POSITIF

NEGATIFS
Y a t‐ils des « FAUX NEGATIFS » ?

Une PCR négative n’exclut

pas le diagnostic
 RT ‐PCR
Une PCR négative n’exclut pas le diagnostic
 Qualité du
prélèvement
 Préleveur expérimenté

Proper collection of specimens is the most

important step in the laboratory diagnosis
of infectious diseases.
A specimen that is not collected correctly
may lead to false negative test results.
 Délais du « faux négatif »
prélèvement Si trop tôt ou trop tard
À ce jour, et en l’état actuel des connaissances, l’ARN viral est détecté de façon optimale
dans les échantillons nasopharyngés jusqu’à J7 après l’apparition des symptômes. Après
ce délai, la détection n’est plus optimale au sein de ces prélèvements.

PCR sur pvt NP

 Délais du
prélèvement

J1‐J7

> J14

> J7
 Délais du
prélèvement

J3‐J10

> J10

Sérologie
J20
CHARGE VIRALE
‐ Durée positivité ?
‐ Lien transmission ?
The median time from symptom onset to negative testing was
24 days.
PCR+ de façon prolongée?
45 ‐ 49 ‐ 60J

3497 samples

The median duration of virus

in respiratory samples was 18 days
.
RT ‐PCR
charge virale et sévérité de l’infection ?

3497 samples
duration of virus in patients with severe disease (21
days, 14‐30 days) was significantly longer than in
patients with mild disease (14 days, 10‐21 days; P=0.04)
patients with severe disease showing a significantly
higher viral load than those with mild disease, which
suggests that viral load can be used to assess
prognosis

detection in serum samples was higher in patients

with severe disease than in patients with mild
disease (45% v 27%)

Stool samples: 59% of patients and duration of virus

detection was longer / viral load peaked later

We rarely found SARS‐CoV‐2 RNA in urine (RNA

detection : up to 50% in the urine of patients with
SARS
 Techniques de diagnostic

 Diagnostic Direct
 Microscopie électronique
 Culture virale
 Détection antigénique
 Détection du génome viral

 Diagnostic indirect
 Détection des anticorps
 Diagnostic Direct
 Détection antigénique
 Détection du génome viral

 Diagnostic indirect : Détection des anticorps

Immuno‐Chromatographie
Tests « rapides » Anticorps

Sérologie ELISA , EIA+++

 Diagnostic Indirect : TDR / TROD
détection des anticorps  ELISA‐EIA‐CLIA…(automatisables)

Diagnostic de rattrapage (mais tardif) si suspicion clinique et RT‐PCR

négative
Compagnes de dépistage : personnel médical / professions exposée
Enquête épidémiologiques / foyers en cours  guider les stratégies
Diagnostic Les tests sérologiques ne sont pas recommandés dans le cadre du
tardif diagnostic précoce de l’infection COVID‐19 (pas S1)

Les tests sérologiques permettent uniquement de déterminer si

Indique un
une personne a produit des anticorps en réponse à une infection
contact
par le virus

virus
infectieux? Les tests sérologiques ne permettent pas de statuer si la
contagiosité? personne est contagieuse ou pas.

Anticorps La présence des anticorps …ne permet pas de déterminer leur

protecteurs? activité neutralisante.
 Diagnostic Direct
 Microscopie électronique
 Culture virale
 Détection antigénique
Tests « rapides » Antigène
 Détection du génome viral
Immuno‐Chromatographie

 Diagnostic indirect Tests « rapides » PCR

 Détection des anticorps

Tests « rapides » Anticorps

Immuno‐Chromatographie
MERCI