PAPILLOMAVIRUS
THÉMATIQUE À TAPER
Méthodes de détection et d’identification
des HPV
Laurence Olliera, Valérie Giordanengoa,b,*
RÉSUMÉ
P
Parmi i lles papillomavirus
ill i h
humains
i (HPV)
(HPV), on di
distingue
ti lles HPV dit
dits à h
risque oncogénique et les HPV à bas risque oncogénique. L’association
de ces génotypes à haut risque oncogénique et du cancer du col de l’uté-
rus est aujourd’hui bien établie et permet de proposer des techniques de
détection de ces génotypes d’HPV. Ce diagnostic d’infection est réalisé
par des techniques de biologie moléculaire qui reposent sur le principe
de l’hybridation moléculaire entre : un ADN ou ARN cible et une sonde
spécifique. Elles permettent de détecter, quantifier ou génotyper le ou les
HPV présents.
HPV – détection – génotypage – quantification – PCR.
1. Introduction
Les papillomavirus humains (HPV) sont des virus à ADN
infectant les kératinocytes des muqueuses épidermoïdes
génitales et de la peau [16, 20, 21]. Parmi les génotypes
d’HPV (près de 120), une trentaine environ présente un
tropisme génital. Parmi eux, on distingue d’une part les
HPV dits à haut risque oncogénique (high-risk HPV, HR-
HPV), représentés par HPV16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51,
52, 56, 58,59, 68, 73 et 82, et d’autre part, les HPV à bas
risque (low-risk HPV, LR-HPV) représentés par HPV 6, 11,
40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81 et 89 [21, 22]. Le cycle
viral des papillomavirus dépend de la différenciation épithé-
liale et les méthodes d’isolement viral par culture cellulaire
sont difficiles à mettre en place. Néanmoins, l’utilisation
de modèles de culture organotypique de kératinocytes
ou de lambeaux tissulaires sur un gel de collagène ont
permis des avancées significatives dans la compréhen-
sion des mécanismes moléculaires régulant la réplication
a Laboratoire de virologie
Hôpital de l’Archet II
151, route de Saint-Antoine-de-Ginestière – B.P. 3079
06202 Nice cedex 3
b Inserm U895 Biologie des interactions hôte-microorganisme – C3M
151, route Saint Antoine-de-Ginestière – B.P. 2 3094
06204 Nice cedex 3
* Correspondance
giordane@unice.fr
article reçu le 13 mars, accepté le 20 mars 2008.
© 2008 – Elsevier Masson SAS – Tous droits réservés.
REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - SEPTEMBRE/OCTOBRE 2008 - N°405 //
(HPV)
SUMMARY
hautt
Detection and identification of HPV
Among human papillomaviruses (HPV), high risk
(HR) and low risk HPV types can be distinguished.
The well established association of HR-HPV with
cervical cancer justifies the detection and identifi-
cation of these HR-HPV genotypes. This diagno-
sis of infection is realized by molecular biology
tolls based on molecular hybridization between
DNA or RNA target and specific probes. They
allow detection, quantification or typing of one
or several HPV genotypes.
HPV – detection – genotyping – quantification – PCR.
virale. Ces modèles ne peuvent pas être utilisés en routine
pour le diagnostic et seules des techniques de biologie
moléculaire permettent d’identifier qualitativement ou de
quantifier les séquences nucléiques des HPV.
Ces techniques de biologie moléculaire sont nombreuses
et parfois complémentaires [19, 28] ; elles reposent sur le
principe de l’hybridation moléculaire entre un ADN ou un
ARN messager (ARNm) cible et une sonde spécifique.
Certaines de ces techniques sont désormais utilisables
en routine de laboratoire. L’ADN génomique des HPV est
la cible la plus utilisée, car les ARNm sont plus fragiles.
Les étapes d’extraction et de dénaturation de l’ADN ou
de l’ARNm cible sont éventuellement suivies d’une étape
d’amplification, précédant l’hybridation moléculaire. L’étape
ultérieure de détection des hybrides « cible-sonde » permet
de révéler la présence de la cible. Ainsi schématiquement,
les techniques de biologie moléculaire actuellement appli-
cables en routine au laboratoire sont réalisées en 3 ou
4 temps (extraction, +/- amplification, hybridation, révé-
lation), à partir d’un prélèvement effectué au niveau de la
zone de jonction endocol-exocol (figure 1).
2. Détection qualitative
du génome HPV
Lors de la détection qualitative des HPV, deux types de
résultats peuvent être obtenus : soit le résultat indique
la présence (ou l’absence) de HR-HPV sans préciser le
génotype exact, soit le résultat précise le génotype de
l’HPV détecté.
51
 2.1. Détection des HPV à haut risque,
sans précision du type
Ces techniques permettent de détecter la présence d’un
ou de plusieurs HPV sans identifier le ou les génotypes
précis présents dans l’échantillon.
2.1.1. Hybridation en phase liquide
La spécificité diagnostique de cette technique ancienne
repose sur une étape d’hybridation en solution, c’est
une immunocapture en phase liquide. L’ADN est extrait
et l’hybridation en phase liquide est réalisée entre l’ADN
viral cible dénaturé et un « cocktail » de sondes ARN com-
plémentaires de 13 HR-HPV (HPV16, 18, 31, 33, 35, 39,
45, 51, 52, 56, 58,59, 68). Les hybrides ADN/ARN formés
sont stables et, grâce à des anticorps polyclonaux anti-
duplex ADN/ARN fixés sur la paroi des puits, ils sont
Figure 1 – Représentation schématique des différentes étapes
des techniques de détection et de génotypage des HPV.
Réalisées en 3 temps (extraction, hybridation, révélation) ou 4 temps (extraction,
amplification, hybridation, révélation).
Figure 2 – Hybridation en phase liquide.
L’ADN extrait dénaturé est hybridé avec les sondes ARN, puis capturé sur le puits
par des anticorps anti-hybride ADN/ARN et révélé.
52 // REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - SEPTEMBRE/OCTOBRE 2008 - N°405
captés sur la paroi de la microplaque. Après capture des
hybrides, un anticorps anti-duplex couplé à une phospha-
tase alcaline (PAL) réagit avec la partie libre des duplex
(figure 2). En présence d’un substrat chimioluminescent,
la PAL déclenche une émission de lumière détectée par
un luminomètre [2]. La sensibilité de cette technique est
proche de celle de la PCR (polymerase chain reaction) [3,
26] tout en étant une technique rapide, reproductible et
applicable à de grandes séries.
Le rendu du résultat est qualitatif :
- test HR-HPV positif : présence d’HPV à haut risque onco-
génique,
- test HR-HPV négatif : absence d’HPV à haut risque onco-
génique.
2.1.2. Amplification par PCR couplée à une détection
immunoenzymatique des amplicons
De nombreuses stratégies existent, toutes utilisent une étape
d’amplification d’une séquence caractéristique du génome
HPV, puis une étape de révélation de ces amplicons grâce
à une réaction colorimétrique [4, 23]. Ainsi sont successi-
vement réalisées : la lyse et l’extraction de l’ADN contenu
dans les cellules cervicales, puis la PCR avec des amorces
biotinylées encadrant un fragment de la région L1. Le choix
de cette région L1 permet une PCR de genre amplifiant le
fragment ADN quel que soit le génotype d’HPV. L’amplicon
est ensuite dénaturé puis hybridé, dans un puits, avec un
cocktail de sondes spécifiques et complémentaires des
13 HR-HPV. Les hybrides capturés dans les puits sont révélés
par réaction colorimétrique grâce au groupement biotine
présent sur l’amplicon (figure 3). Le rendu du résultat est
qualitatif : présence, ou non, d’HPV à haut risque oncogéni-
que dans le prélèvement. Dans la plupart des cas, une PCR
contrôle qui amplifie une région d’un ADN cellulaire ubiqui-
taire est réalisée afin de valider la qualité du prélèvement et
les conditions d’amplification et de révélation.
2.2. Génotypage des HR-HPV
Le patient pouvant être infecté par un seul type d’HPV ou
présenter une infection multiple, ces techniques identifient
Figure 3 – Détection immunoenzymatique
des amplicons HPV .
L’ADN extrait dénaturé est capturé sur le puits par des sondes
oligonucléotidiques puis révélé.

le (ou les) génotype(s) d’HPV présents dans l’échantillon
analysé. Elles comportent une étape d’amplification PCR
d’un fragment d’ADN HPV. Le choix de la région amplifiée
doit répondre à deux contraintes [5, 11, 25] : une séquence
ADN suffisamment conservée à ses extrémités afin de per-
mettre une PCR de genre, mais divergente dans sa région
interne pour autoriser le génotypage par comparaison avec
des séquences de génotypes connus.
La réalisation d’une PCR contrôle, à partir d’un ADN cel-
lulaire ubiquitaire, peut valider la qualité du prélèvement
et le bon déroulement des étapes d’amplification et de
révélation.
2.2.1. Génotypage par séquençage
C’est la méthode de référence puisque c’est la séquence
complète de la région L1 qui définit les différents génoty-
pes d’HPV. Cependant, en routine, le génotype est réalisé
à partir d’une plus courte séquence, celle des amplicons :
région variable suivant le type qui sera alignée avec des
séquences de référence des différents génotypes d’HPV
[7, 15].
Cette méthode permet de détecter le génotype d’HPV
majoritaire, présent dans le prélèvement, mais peut diffici-
lement diagnostiquer les infections multiples. En revanche,
elle permet de détecter des variants d’HPV (pour les HPV
16 et 18 principalement) dont la distribution varie selon
les zones géographiques.
2.2.2. Génotypage par sondes immobilisées
sur bandelettes
Dans cette technique, c’est lors de l’étape d’hybridation
que l’on différencie les divers génotypes présents. La PCR
HPV est réalisée avec des amorces biotinylées. Les produits
amplifiés sont hybridés sur une bandelette sur laquelle des
oligonucléotides spécifiques de différents génotypes d’HPV
ont été préalablement fixés. Les hybrides amplicon - oligo-
nucléotide sont révélés par réaction colorimétrique grâce
au groupement biotine présent sur l’amplicon (figure 4).
La lecture s’effectue ensuite, par comparaison entre le
profil d’hybridation obtenu et une plaquette où figurent les
Figure 4 – Génotypage par reverse dot-blot.
Les amplicons sont hybridés sur la bandelette formant des hybrides
amplicon – oligonucléotide spécifique d’un type d’HPV puis sont révélés
par réaction colorimétrique.
REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - SEPTEMBRE/OCTOBRE 2008 - N°405 //
PAPILLOMAVIRUS (HPV)
profils de tous les génotypes d’HPV. La localisation de la
bande (ou des bandes) colorée(s) sur la bandelette permet
de définir le (ou les) génotype(s) présent(s) dans le prélève-
ment [10, 27]. Ces techniques portent le nom de line blot
assay [10], line probe assay (LiPA) [27] ou de linear array
assay [29] La sensibilité de ces tests permet la détection
simultanée de plusieurs génotypes d’HPV [6, 29].
2.2.3. Génotypage par puce à ADN
Cette technique de biologie moléculaire est en plein essor
et permet un génotypage rapide [1, 12, 14]. La PCR HPV de
genre est réalisée avec des amorces fluorescentes, puis le
produit PCR est hybridé sur une lame. Cette lame contient
les sondes spécifiques des génotypes d’HPV recherchés
déposées sous forme de spots bien distincts. Les puces
applicables au diagnostic sont des puces de basse densité,
avec 5 à 100 sondes différentes par lame. Le produit PCR
étant fluorescent aucune étape de révélation n’est nécessaire
et, après lavage de la lame, la lecture se fait directement sur
un scanner qui localise l’hybride cible-sonde et en déduit le
génotype (figure 5). Cette technique est simple, sensible
et rapide. Elle permet également de détecter les différents
types dans les infections HPV multiples.
2.2.4. Génotypage par la technologie Luminex®
La technologie Luminex® est une nouvelle technologie de
cytométrie en flux permettant la détection de réactions
multiples dans un même tube. Ce système multi-analyti-
que est constitué d’un cytomètre de flux à 2 lasers et d’un
ensemble de microsphères. Après amplification avec des
amorces fluorescentes (PCR de genre), l’ADN amplifié est
hybridé sur les microsphères recouvertes chacune d’un
oligonucléotide spécifique d’un génotype d’HPV. Chaque
type de microsphères est reconnaissable en cytométrie
en flux par un code-couleur spécifique et l’amplicon est
lui aussi marqué par un fluorophore. Il est donc possible,
grâce à cette technologie, d’analyser simultanément jusqu’à
100 types de microsphères par condition et donc d’ana-
lyser rapidement les différents types d’HR-HPV présents
dans le prélèvement [24].
Figure 5 – Génotypage par puce à ADN.
Les amplicons sont hybridés sur la lame formant des hybrides amplicon
– oligonucléotide spécifique d’un type d’HPV puis sont visualisés par le
scanner à fluorescence.
53
 3. Détection quantitative
du génome HPV
Ces techniques évaluent la charge virale d’un type précis
d’HPV. La quantité de virus détecté dans les frottis pour-
rait être liée au grade de la lésion et donc être un facteur
pronostique, mais les résultats sont parfois contradictoires
[8, 9, 17]. L’arrivée de la PCR en temps réel permet de
nombreuses études. Cette technique donne une quantifi-
cation précise (nombre de copies d’ADN) par comparaison
avec des standards internes. La détection et la quantifi-
cation simultanées de l’ADN cible sont possibles grâce à
la mesure « en temps réel » de l’émission de fluorescence.
L’intensité de cette fluorescence est proportionnelle à la
quantité d’amplicons synthétisés et donc au nombre de
cibles (génome HPV) présentes initialement dans le pré-
lèvement. L’analyse de la pente de la courbe de mesure
de la fluorescence, au tout début de la phase exponen-
tielle, permet la quantification de cet ADN par rapport à
une gamme étalon.
4. Détection des ARNm HPV
Puisque les protéines oncogéniques E6 et E7 sont res-
ponsables de la carcinogenèse liée aux HPV à haut ris-
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54 // REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - SEPTEMBRE/OCTOBRE 2008 - N°405
que, la détection des ARNm E6-E7 peut être un marqueur
intéressant pour apprécier le risque d’évolution vers une
lésion cancéreuse. Dans la technique NASBA (nucleic acid
sequence based amplification) [13, 18], les ARN viraux et
cellulaires extraits des prélèvements cervicaux sont rétro-
transcrits en ADN par la transcriptase inverse. L’une des
deux amorces utilisées possède le promoteur de la T7-ARN
polymérase et permet à cette T7-ARN polymérase de
transcrire une centaine de copies d’ARN à partir d’une
copie d’ADN, réalisant une amplification isotherme des
ARNm. La détection de ces ARNm se fait par hybridation
avec des sondes oligonucléotidiques fluorescentes spé-
cifiques de type, permettant le génotypage.
5. Conclusion
La détection des HPV à haut risque oncogénique est un
outil indispensable à la prise en charge des lésions du col
utérin. Dans les années à venir, les techniques de biologie
moléculaire serviront probablement dans le suivi de ces
lésions du col utérin après traitement, et dans le diagnostic
d’autres lésions précancéreuses. L’évolution rapide des
techniques nous permet actuellement d’avoir de multiples
moyens, parfois complémentaires, pour détecter, identifier
et quantifier les HPV. Cependant les indications de ces
techniques doivent encore être évaluées.
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