Université Abdelmalek Essaadi

Faculté des sciences et techniques de Tanger

Licence Biotechnologie Animale

Recherche d’Influenza aviaire chez les

poussins par RT-PCR
À partir de 18/04/2022 jusqu’à 03/06/2022

Réalisé par: Encadré par:

SAHLAL Amina. Mr. CHICHI Abdellah.

BENARIBA Raouiya. Dr. EZ-ZAAIM Ayoub.
.
Année universitaire: 2021-2022
 Plan
01 Introduction

02 Matériels et méthodes

03 Résultats et discussions

04 conclusion
INTRODUCTION

Introduction
 Introduction

Réaparition à Honkong. Propagation de l’épidémie au

Nigéria .
1997 2005 2021

Apparition du virus H5N1 2003 Découvert du virus en 2006 Détection de plusieurs foyers
dans un élevage des vollailes Sibirie , Kazakhstan et l’Oural d’Influenza aviaires chez les
à Honkong. . animaux sauvage ou des
élevages en Europe.
 Introduction

La France recense, à la date du 6 mai, 1 374 foyers d’influenza aviaire hautement

pathogène (IAHP) en élevage depuis le déclenchement de l’épizootie en Aout dernier.
 Introduction
Structure du virus influenza.

- Structure complexe.
- Particule sphérique 100nm de
diamètre.
- 500 Hémagglutinine.
- 100 Neuraminidase.
- 3000 molécules de protéines
matricielles.
- 8 brins d’ARN associés à
plusieurs molécules de
protéines.
 Introduction
Mode de transmission du virus Influenza.

Transmission d’une
volaille à autre. Maturation

Poussin atteint. Poussin

Poussinatteint.
sain. Poulet atteint.
 Introduction
Mode de transmission du virus Influenza.

Transmission d’une Transmission d’un

volaille à l’Homme. Homme à autre.

Homme infecté par le

Poulet atteint. Homme sain.
virus influenza.

Pandémie.
 Introduction
Inquiétude en Europe, état d’alerte au Maroc.

Arrête du ministre de l'agriculture, de la pèche maritime, du développement rural et des eaux et forets no
2466-17 du 5 moharrem 1439 (26 septembre 2017) relatif aux mesures complémentaires et spéciales
pour lutter contre l'influenza aviaire hautement pathogène (peste aviaire).
 Introduction

La technique de la PCR a été

conçue par Kary Mullis en
1985

• les mesures de fluorescence peuvent déterminer

en "temps réel" si l’amplicon est réellement présent
la détection de l'ARN viral .
par RT-PCR est la • Le nombre d'amplicons est lié à la quantité initiale
technologie de choix qui
permet une détection
d'ADN de la matrice d'origine
spécifique de la grippe
 Introduction

La PCR quantitative
(qPCR) avec des étiquettes
témoin positive d'ADN fluorescentes est
une technique puissante
qui combine l'amplification
seuil par PCR de fragments
d'ADN avec la détection de
Témoin négative la fluorescence dans
chaque tube.
 PROBLEMATIQUE

Influenza aviaire est détecté dans des élevages avicoles en Europe.

Il faut effectuer des contrôles sanitaires sur les poussins d’un jour
importés au Maroc.
Matériels et méthodes

Matériels et méthodes
AWESOME
Matériels et méthodes
Ecouvillonnage des poussins

Poussin d’un jour.

Matériels et méthodes
Ecouvillonnage des poussins

• Oropharyngés • Cloacaux
Matériels et méthodes
Ecouvillonnage des poussins

Écouvillons.
Matériels et méthodes
Ecouvillonnage des poussins
Matériels et méthodes
Préparation des broyats d’écouvillons

1000µL de H2O qualité PCR.

Matériels et méthodes
Préparation des broyats d’écouvillons

Broyage des écouvillons.

Matériels et méthodes
Préparation des broyats d’écouvillons

Centrifugation à 14000 RPM pendant 2 min.

Matériels et méthodes
Préparation des broyats d’écouvillons

Transfère 200 µL du surnageant dans des

nouveaux tubes Eppendorf.
 Matériels et méthodes
Extraction de l’ARN du virus Influenza aviaire

Hotte à flux laminaire (pour extraction des

acides nucléiques).

Kit d’extraction
 Matériels et méthodes
Extraction de l’ARN du virus Influenza aviaire
Volume
Nom Rôle
(µL)

Carrier RNA Porteur d’ARN. 4µL

Proteinase K 20 µL
Lyse des protéines, capside, enveloppe, organites  Libération d’ARN.
Lysis Buffer VL1 180 µL

IPC Internal Positif Control (pour contrôle d’inhibition de PCR). 2 µL

B-Beads Les billes magnétiques. 20 µL

Binding Buffer VEB Permet la liaison à l’ARN avec les billes magnétique. 600 µL

Wash Buffer VEW1 600 µL

Le cascade du lavage pour purifier l’ARN et à éliminer toute protéine et
de sel, débris de nucléoprotéines…
Wash Buffer VW2 600 µL

Ethanol 80% Solution de lavage dont le but est induire la précipitation de l'ARN. 600 µL

Elution Buffer VEL Utilisé pour détacher l’ARN extrait des billes magnétiques. 50-100 µL
 Matériels et méthodes
Préparation du Master-Mix
 Le mélange réactionnel est préparé soigneusement dans une salle réservée à
la préparation du Master mix dans une Hotte Captair.

Hotte Captair.
 Matériels et méthodes
Préparation du Master-Mix

 Le Master-Mix contient tous les composants nécessaires pour la PCR à l’exception de

l’échantillon d’ARN à amplifier et les amorces spécifiques de la séquence à amplifier
(Amorces : F, R et Sonde).
Matériels et méthodes
Préparation du Master-Mix

Réactifs Concentration Volume (µL/25µL)

Mix 2X 12,5

MgSO4+ 50X 0,5

Rox 6 mM 0,5

Taq Mix - 0,5

Amorce sens F (Forward) 20 µM 0,625

Amorce anti-sens R (Reverse) 20 µM 0,625

Sonde fluorescente P (Probe) 10 µM 0,750

H2O - 3

IPC - 1

Concentrations et volumes des réactifs utilisés dans le

Master Mix.
 Matériels et méthodes
Amplification de l’ARN extrait
Mélange de master mix et l’ARN extrait:

• Distribution de 25µL du Master-Mix dans la plaque optique.

• Ajout de 5 µL de l’ARN extrait dans la plaque optique.
Master-Mix ARN extrait • Couvrons la plaque avec un film optique adhésif
puis on centrifuge pendant 2 min à 4000 RPM.
 Matériels et méthodes
Amplification de l’ARN extrait
Paramétrage et lancement de la réaction d’amplification:

 On met la plaque préparée dans le bloc thermique du thermocycleur.

 On crée le plan de la plaque sur le logiciel et on paramètre l’appareil
selon les conditions présentés dans les tableaux.
 Matériels et méthodes
Amplification de l’ARN extrait
Paramétrage et lancement de la réaction d’amplification :

Etapes Température Durée Nombre de cycles

Transcription inverse 45°C 20min 1X

Dénaturation initiale 95°C 15min 1X

Dénaturation 94°C 45s

40X
Hybridation/Elongation 60°C 45s

 On met la plaque préparée dans le bloc thermique du thermocycleur.

 On crée le plan de la plaque sur le logiciel et on paramètre l’appareil
selon les conditions présentés dans les tableaux.
 Matériels et méthodes
Amplification de l’ARN extrait
Paramétrage et lancement de la réaction d’amplification :

Cible Fluorophore

Cible 1 (IA) FAM, TAMRA (499nm-520nm)

Cible 2 (IPC) VIC (532nm-554nm)

 On met la plaque préparée dans le bloc thermique du thermocycleur.

 On crée le plan de la plaque sur le logiciel et on paramètre l’appareil
selon les conditions présentés dans les tableaux.
Résultats et discussions

Résultats et discussions
 Résultats et discussions
Résultats

Une absence de signal cible FAM et la présence

de signal IPC (VIC) l’échantillon est négatif
Une présence de signal cible FAM et la
présence de signal IPC (VIC) la matrice Échantillons négatifs
analysée est fortement positif

Nombre des échantillons analysés 350

Nombre de réactions PCR (pool) 70
Nombre de résultats positifs 0
Nombre de résultats négatifs 70
 Discussions
• l’absence de signal cible FAM avec la présence du signal IPC les résultats
obtenue est négatifs.
• Toutes les analyses effectués sont négatifs sa revient au sévère contrôle exécuté par le
Maroc pour protéger le cheptel avicole ainsi le consommateur marocain contre cette maladie
causé par le virus d’influenza aviaire.
conclusion
conclusion

conclusion
 Merci pour votre attention

Pour réussir, travailler dur, ne

jamais abandonner et surtout
chérir une obsession
magnifique.