Diagnostic biologique des infections respiratoires et ORL

Dr KABAMBA KALONJI Fiston

DES 3 BC 2021-2022
 Diagnostic biologique des infections respiratoires

Objectifs

• Énumérer les agents infectieux responsables d’infections respiratoires

• Décrire les techniques de prélèvements respiratoires

• Décrire les techniques de recherche des agents infectieux en pathologie respiratoire

• Décrire la validation des résultats

Plan

Introduction

1. Généralités

2. Prélèvements

3. Techniques diagnostiques

4. Interprétation

Conclusion
Introduction

• Infection est dite "respiratoire" lorsqu’elle atteint l’une des structures composant le système
respiratoire:

- Nez

- Oreilles

- Gorge

- Larynx, Trachée

- Bronches ou alvéoles

• Infections broncho-pulmonaires comprennent différents tableaux cliniques tels que : bronchites,

bronchiolites, pneumonies aigües communautaires (PAC), exacerbation de pathologies
respiratoires chroniques ( bronchite chronique , mucoviscidose) ou pneumonies acquises sous
ventilation mécanique (PAVM)

• Non inclus tuberculose

 Intérêt

• Épidémiologique:

o Bronchites et bronchiolites: virus +++

o Pneumonies: bactéries +++

o Fréquences élevées chez sujets à risque

• Diagnostique: le diagnostique bactériologique est complexe

• Pronostique:
 o Infections virales d’évolution favorables

o Pneumonies bactériennes: gravité et mortalité importante

1-Généralités
1-1- Rappels anatomo-cliniques

• Voies respiratoires

o Supérieures:

 Sièges affections ORL

 Fosses nasales, rhinopharynx, oropharynx, larynx

Rhinopharynx: siège d’une flore abondante variable selon l’âge et le terrain

o Inférieures:

 Bronches

 Bronchioles

 Alvéoles

 Poumons

 Existence de regroupement fonction de la glotte

o Structures sous glottiques → prélèvements normalement stériles

o Structures sus-glottiques → existence d’une flore avec haut risque de contamination

 Stérilité des voies respiratoires inférieures

o Mécanique: toux, division bronchique et épithélium bronchique cilié

o Humoral: IgA, IgG, lysozyme, surfactant, antiprotéases

o Cellulaire: macrophages, lymphocytes, polynucléaires

 Infection respiratoire: déséquilibre entre mécanismes de défense et virulence du pathogène

1-2- Physiopathologie

• Origine des infections:

o Aspiration de microorganismes des secrétions nasopharyngées

o Inhalation de particules contaminées provenant d’autres patients et de l’environnement

• Dépôt des particules au niveau des bronchioles ou des alvéoles

• → multiplication du pathogène

• Transport par les canaux lymphatiques vers ganglions lymphatiques régionaux

• Transport par voie sanguine vers sites éloignés

1-3- Germes responsables

• Bronchites

o Virus à tropisme respiratoire primaire:

 Affinité marquée pour cellules ciliées des muqueuses respiratoires

 Virus Influenza A, B +++, Virus Parainfluenzae

 Virus respiratoire syncitial+++ (VRS): bronchiolite du nourrisson

 Adénovirus, Rhinovirus

 Métapneumovirus

o Virus à tropisme respiratoire secondaire:

 Atteintes respiratoires associées à autres manifestations cliniques (maladies

systémiques)

 Virus de la rougeole

 Entérovirus humains A à D

 Parechovirus

 HSV

 VZV

 EBV

 CMV

o Virus respiratoire opportunistes:

 Adenovirus

 CMV

 Autres virus accessoirement

• Pneumopathies aigües communautaires (PAC)

• Pneumopathies aigües nosocomiales

• Pneumopathies acquises sous ventilation mécanique (PAVM)

o Pseudomonas aeruginosa

o S. aureus

o Entérobactéries (Klebsiella, Enterobacter, Serratia)

 o Anaérobies

o Acinetobacter baumannii

o Legionella pneumophila

• Exacerbation de pathologies respiratoires chroniques

o Haemophilus influenzae

o Streptococcus pneumoniae,

o Branhamella catarrhalis,

o Pseudomonas aeruginosa

o Staphylococcus aureus

1-4- Facteurs favorisants

• Âge du patient (nouveau né, nourrison, petits enfants et sujets âgés)

• Terrain débilité

• Immunodépression

• Résidence en région tempérée

• Période de l’année (hiver)

1-5- Mode de contamination

• Voie aérienne +++

• Dissémination par

o Voie sanguine

o Voie lymphatique

o Par contiguïté (péricardique)

2- Diagnostic bactériologique
2-1- Circonstances de diagnostique

• Pneumopathie grave

• Pneumopathie nosocomiale

• PAVM qui ne repond pas au traitement de 1ère intention ( rebelle au traitement)

• Signes radiologiques évocateurs chez sujet à risque

2-2- Prélèvements

• Indiqués si diagnostic bactériologique → modification de la PEC

• Parfois bilan systématique chez immunodéprimé

• Conditions de prélèvement
 o Absence de traitement anti infectieux préalable

o Transport rapide

• Prélèvements respiratoires

o Expectoration

o Lavage broncho-alvéolaire

o Aspiration endo-trachéale et endo-bronchique

o Prélèvement distal protégé

• Autres prélèvements

o Liquide pleural

o Urines

o Sang (Hémocultures)

Prélèvements des expectorations

• Rarement contributif

• Source d’erreurs

• Recueil de secrétions contaminées par la salive (> 50%)

• CI: PAC traitées en ambulatoire

Indications:

o Échec du traitement empirique

o Surinfections de bronchite chronique

o Infections à mycobactéries

o Infections respiratoires chez sujets atteints de mucoviscidose

Protocole de recueil rigoureux:

o Réalisé avant tout ATBthérapie

o Rinçage bucco-dentaire à l’eau stérile

o Effort de toux, aidé si nécessaire d’un kinésithérapeute

o Recueil dans récipient stérile acheminé idéalement en moins de 2h au laboratoire

Prélèvements des aspirations endo-trachéale et endo-bronchique

• Aspiration des secrétions broncho-pulmonaires par sonde d’intubation

• Méthode alternative lorsque patient n’expectore pas et que méthode invasive contre-indiquée

• Ne nécessite pas fibroscopie et réalisée à l’aveugle

• Fréquemment utilisée chez patient en réanimation, intubé et ventilé

• Risque de contamination important

• Si sécrétions peu abondantes, injecter petit volume de SS (quantité à noter)

Lavage broncho-alvéolaire (LBA)

• Sous fibroscopie

• Composé de deux fractions

o Bronchique: 50cc

o Alvéolaire: 150-200cc

• Technique:

o Réaliser blocage du broncho-fibroscope dans une bronche de 3ème ou 4ème génération

o Instiller 4 à 6 fois 50cc de SS → permet recueil de 20 à 60% de la quantité injectée

o Première aliquote (fraction bronchique) à éliminer

o PAVM

o PAC chez immunodéprimé

o PAC avec échec du traitement empirique → recherches spécifiques : Legionella spp,

Nocardia spp, mycobactéries, champignons

Variante: mini-lavage

o Instillation de 20cc de SS

o Recueil de 2 – 3 cc

Prélèvement distal protégé

• Brossage bronchique

o Brossage de la muqueuse bronchique distale sous fibroscopie

o Brosse protégée par un double cathéter obturé par un bouchon de polyéthylène glycol
(évite contamination)

o Au site de prélèvement, cathéter interne est poussé, expulsant le bouchon

o Volume recueilli: 1- 10 µl

o Extrémité de la brosse coupé de façon aseptique et mis dans un tube de 1cc de SS stérile

o Indications identiques au LBA

o Avantage:

 Meilleur prélèvement pour cultures virales et cytologie

o Inconvénients:
  Sensibilité et spécificité variables pour pneumonies bactériennes

 Reproductibilité mauvaise

Cathéter distal protégé

 Variante du brossage bronchique

 Indication: patients intubés et ventilés, à lésions bilatérales

 Injection d’un volume de 1cc puis respiration à la seringue

 Section aseptique de l’extrémité du cathéter

 Disposé embout dans tube stérile

Dispositif du brossage bronchique et de l’aspiration trachéale

Prélèvement du Liquide pleural

• 20 – 40% : association épanchement pleural et pneumonie

• Ponction pleurale

• Sensibilité améliorée par détection des Ag ou du génome de S. pneumoniae

• Intérêt: grande spécificité

Prélèvements des Urines

• Fraîchement émises

• Recueil dans un flacon avec ou sans conservateur

• Adresser rapidement au laboratoire

• Recherche d’Ag urinaires de Legionella pneumophila sérotype 1

Hémocultures

• Indications

o Pneumonies graves (hospitalisation)

o Sujets immunodéprimés

 Identification de pathogènes autres que S. Pneumoniae (S. aureus, K. pneumoniae, P.

aeruginosa)

• Intérêt:

o Adaptation de l’ATBthérapie

o Marqueur de gravité

3- Techniques diagnostiques

3-1- Examen microscopique de l’échantillon

• Intérêt:

o Évaluer le degré de contamination salivaire: reflété par présence de cellules épithéliales

o Rejet des prélèvements fortement contaminés

o Donner premiers éléments d’orientation du diagnostic étiologique

 Expectorations, aspirations bronchiques et endo-trachéales

• Analyse cytologique après coloration de Gram et coloration au MGG

• Dénombrer au grossissement (X100) cellules épithéliales et PN par champ en réalisant

moyenne sur 10 champs

• Vérifier au préalable morphologie à grossissement plus fort

• Critères établis (Bartlett, Murray et Washington) à ne pas prendre en compte pour Legionella
spp
-Les crachats de classe 1 et 2 sont trop fortement contaminé par la salive et ne doivent donc pas être
mis en culture sauf aplasie et mucoviscidose, il faut demander un autre prélèvement

- Les crachats de classe 3 et 4 ont un nombre de leucocytes qui témoigne d’une réaction
inflammatoire mais sont contaminés par la salive, peuvent être mis en culture avec toutes des
résultats à rendre sous réserve

- Les crachats de classe 5 sont de qualité optimale

• Présence de macrophages alvéolaires et cellules bronchiques: témoin de l’origine basse (ne

garantit pas absence de contamination)

• Si échantillon mauvais: arrêter examen et inscrire « prélèvement non conforme »

• Observation au grossissement X 1000 des portions les plus purulentes du frottis

• Évaluation semi-quantitative des morphotypes bactériens

• Distinguer flore mixte et flore monomorphe

• Préciser présence de bactéries à l’intérieur des PN

• Analyse cytologique et bactériologique: indissociable

 Lavage broncho-alvéolaire

• Réaliser plusieurs frottis après cyto-centrifugation

• Colorations avec recherche exhaustive surtout chez immunodéprimé: Gram, MGG,

immunofluorescence

• Évaluer par analyse cytologique, proportion des PN, lymphocytes, cellules bronchiques,
macrophages et cellules épithéliales

• LBA normal: > 80% macrophages

• > 1% cellules épithéliales → contamination → rejet

 Prélèvement distal protégé

• Recueilli dans 1ml de milieu de préservation (liquide de Ringer)

• Si besoin, ajuster volume à 1 ml

• Si V > 1ml noter pour établir calcul final exprimant résultat en ml

• Réaliser plusieurs frottis après cyto-centrifugation

• Colorations: Gram et MGG

3-2- Culture et identification

• Mise en culture le plus tôt possible

• Éviter perte de viabilité des pathogènes et prolifération des commensaux

• Expectorations et aspirations bronchiques à fluidifier et vortexer au préalable

Dilutions proposées pour la mise en culture et seuil de significativité selon le type de

prélèvement

Milieux spécifiques de bactériologie

• Diluer prélèvements

• Dénombrement des bactéries présentes dans l’échantillon

• Ensemencement sur gélose au sang, gélose chocolat

• LBA: recherche complémentaires à partir du culot de centrifugation (1500 t/min 15min)

remis en suspension dans SS

• Si LBA très muqueux: fluidifier

• Si aspirations bronchiques trop diluées: centrifugation pour colorations et mise en culture à

partir du culot
 • Incubation:

• Prélèvements non protégés: 48h

• Prélèvements protégés: 5 jours

• 35°C en aérobiose +/- 5% CO₂

• Anaérobiose: brossages bronchiques

Cultures cellulaires

• Isolement des virus respiratoires: intérêt épidémiologique

• Surveillance de la grippe

• Typage de souches responsables d’épidémies

3-3- Méthodes immunologiques: Recherche d’Ag

Antigènes urinaires

• Détection du sérotype 1 de L. pneumophilia

Antigènes viraux

• Recherche directe (aspiration trachéo-bronchique, LBA)

• Technique:

o Examen cytologique en immunofluorescence (réactifs commercialisés)

• Technique:

o Tests immuno-chromatographiques unitaires disponibles pour certains virus (grippe,

VRS, ADV)

• Avantages:

o Techniques simples

o Rapides

o Faible coût

• Inconvénients:

o Peu sensibles

o Efficacité essentiellement dépendante de charge virale et qualité du prélèvement

Recherche d’Ac

• Diagnostic des pneumopathies atypiques

• Intérêt limité si virose respiratoire (réponse tardive et sensibilité réduite chez nrs)

• Intérêt épidémiologique
 • Trousses ELISA disponibles (qualités variables)

3-4- Amplification génique

• PCR en temps réel

• Diagnostic de virose respiratoire

• Excellente sensibilité

• Résultats disponibles en 48h au plus

• Existence de tests commercialisés

• Résultats qualitatifs → évalue niveau charge virale

4-Interpretation

4-1- Résultats bactériologiques

• Isolement en culture de certaines bactéries (S. pneumoniae, H. influenzae ou S. aureus)

o Ne signe pas infection

o Bactéries commensales de l’oropharynx

o Possible contamination

• Mise en évidence de bactéries pathogènes (Legionella pneumophilia ou M. tuberculosis)

o Confirme diagnostic (légionellose ou tuberculose)

o Pas de portage sain

• Prendre en compte état du patient

o Sujet intubé: colonisation trachéale fréquente

o Entérobactéries, P. aeruginosa, S. aureus → cultures des aspirations endo-trachéales

peu spécifiques

o Bactéries d’origine salivaire à ne pas rendre: SCN, anaérobies, streptocoques du

groupe viridans

• Si absence d’ATB dans les 72h + stérilité des cultures: exclusion des PAVM

• Existence de co-infection bactéries-virus

• Toujours quantifier les germes surtout commencaux

4-2- Résultats virologiques

Virus à tropisme respiratoire primaire

• Existence de syndromes respiratoires caractéristiques d’un groupe viral mais pas de

spécificité étiologique
 • Utilisation de techniques sensibles (PCR) → positivité de plusieurs cibles d’agents
respiratoires

Virus à tropisme respiratoire secondaire

• Initialement: faire diagnostic de la pathologie primitive

• Confirmer infection

• Écarter possibilité d’une co-infection par pathogène viral primaire

Conclusion

• Affections respiratoires: pathologies fréquentes dues à nombreux agents pathogènes

(bactéries, virus…)

• Explorations microbiologiques non systématiques

• Indication du diagnostic biologique: situations particulières

• Démarche diagnostique bactériologique minutieuse

• Interprétation des résultats en fonction d’un faisceau d’arguments

 Diagnostic biologique des infections de la
sphère ORL
Objectifs

 Définir une infection de la sphère ORL

 Citer les principales infections de la sphère ORL

 Enumérer les principaux microorganismes responsables de ces infections

 Décrire la démarche diagnostique biologique devant chaque type d’infection ORL

Plan

Introduction

I. Rappels anatomiques

II. Principales infections sphère ORL

III. Diagnostic biologique

Conclusion
Introduction

• Infections sphère ORL: atteintes des voies respiratoires supérieures (nez, gorge et sinus) ainsi
que des oreilles

• Origine

o virale

o bactérienne

o mycosique

Intérêt

• Epidémiologique:

o Infections aussi fréquentes chez l’adulte que chez l’enfant

o origine mycosique plus fréquente chez nouveau-né, personnes âgées et

immunodéprimés

• Pronostique:

o Complications graves de certaines infections ORL (angines à SGA): RAA,

glomérulonéphrite...

• Diagnostique: Diagnostic biologique difficile==˃ prélèvement et interprétation délicats car

présence de flore commensale

I. Rappels anatomiques

Le pharynx ( origine grec = “gorge”) est un carrefour aéro-digestif entre les voies aériennes ( de
la cavité nasale au larynx) et les voies digestives ( de la bouche à l’oesophage).

On rencontre aussi à son niveau le tube auditif (trompe d'Eustache ) qui le met en
communication avec l'oreille moyenne au niveau de la caisse du tympan

• Pharynx

Conduit musculo-membraneux 3 segments :

o Le nasopharynx (Rhinopharynx)

o Oropharynx

o L’hypopharynx (laryngopharynx)

Anatomie du pharynx

Anatomie de l’oreille Anatomie des sinus

 Localisation des différentes infections ORL
II-Principales infections de la sphère ORL

• Angine: infection douloureuse et fébrile des amygdales voire de tout le pharynx

• Majorité sont d’origine virale (enfant˂ 3ans+++)

 Angines bactériennes

o Angine aigue

o Angine pseudomembraneuse

o Angine ulcéro-nécrotique de Vincent

o Phlegmon amygdalien

 Flore commensale

• Voies respiratoires supérieures

La flore buccale varie en fonction de l’état bucco-dentaire et de l’alimentation

Tableau 1-1 : Flore bactérienne des VRS

 • Voies auditives externes

On retrouve ici la flore cutanée ( Staphylocoques, Corynébactéries, Cutibactérium, Streptocoques).

Tableau 1-2 : Principaux germes responsables d’angines

• Sinusite: atteinte inflammatoire des sinus

 Sinusites bactériennes

o Aigües communautaires

o Aigües nosocomiales (patients intubés, ventilés , sédatés, dans le coma, ou

au décours d’une nutrition nasogastrique)

o Chroniques

Tableau 1-3 : Principaux germes responsables de sinusites

• Otite: inflammation de l’oreille interne, moyenne ou externe

o Otites moyennes aigües (OMA)

o Otites chroniques

o Otites externes
Tableau 1-4 : Principaux germes responsables d’otites

• Rhinopharyngite: inflammation souvent d’origine virale des fosses nasales et du pharynx

o Evolution rapidement favorable, fera rarement objet exploration microbiologique

o Surinfections bactériennes fréquentes: S. aureus, H. influenzae, S. pneumoniae, B.

catarrhalis

III-Diagnostic biologique

2-1: Prélèvements de gorge

• Indications

o Principale indication: angine aigüe bactérienne

o Suspicion de scarlatine, angine ulcéro-nécrotique, pseudo-membraneuse (dans les

phlegmons, analyse du liquide de ponction évacuatrice)

o Bilan d’une IST (pour isoler Neisseria gonorrhoeae)

• Modalités du prélèvement

o Avant toute antibiothérapie locale ou générale

o Ecouvillonnage amygdales, piliers voile du palais

o Faire émettre le son «Â» par le patient pour diminuer reflexe nauséeux

o Utiliser abaisse-langue pour dégager pharynx et éviter tout contact salivaire

o Si présence ulcération ou exsudat, prélèvement doit être fait à leur niveau

o Si suspicion de diphtérie, prélèvement doit porter sur la périphérie ou sous les

fausses membranes

o 03 écouvillons avec un milieu de transport (Portargerm)

• 1 ==˃ TDR du SGA

 • 2 ==˃ étalement sur lame

• 3 ==˃ mise en culture

• Test de diagnostic rapide à la recherche du SGA

o Détection des Ag spécifiques du SGA par immunochromatographie ou tests

enzymatiques

o Peut être réalisé par le clinicien

o Chez l’enfant à partir de 03 ans et chez adulte

o Spécificité ˃ 95% mais sensibilité autour de 90%

• Examen microscopique

o Après coloration de Gram, au bleu de Méthylène ou à la fuschine diluée

o But principal: mise en évidence association fuso-spirochétienne (suspicion angine de

Vincent)

o Résultat: foisonnement de formes fusiformes et de spirochètes

 Frottis d’un prélèvement de gorge montrant une
association fusospirillaire

• Mise en culture: Conditions de culture

o Technique de référence pour mise en évidence SGA

o Suspicion d’angine aigüe: GS, Gélose chocolat, Gélose au sang + ANC incubée sous 5-
10% CO2 pendant 48h (incubation en anaérobiose recommandée)

o Si présence de rash cutané: prolonger incubation à 96h (mise en évidence de

Arcanobacterium haemolyticum)

• Mise en culture: identification

o Aspect macroscopique des colonies, délai de pousse, présence d’un halo d’hémolyse
totale, aspect microscopique des colonies (SGA: cocci gram positif chaînette), tests
biochimiques (vérification absence d’une catalase pour le SGA)

• Antibiogramme

o Antibiogramme limité aux bactéries suivantes selon recommandations du

CA-SFM/EUCAST

• Streptocoques des groupes A, C, G

• A. haemolyticum

• N. gonorrhoeae

• Interprétation:

TDR

o Test positif: ne distingue pas porteur asymptomatique du sujet malade ==˃ associer
contexte clinico-biologique

o Test négatif: ne permet pas d’éliminer le diagnostic ==˃ mise en culture en cas de
forte suspicion et chez sujets présentant un facteur de risque de RAA
 Culture

o Ne pas mentionner présence de flore commensale du pharynx

o Ne pas signaler : H. influenzae, S. pneumoniae, N. meningitidis, S. aureus (hôte de

passage ne provoquant aucune manifestation symptomatique liée au pharynx)

2-2: Prélèvements auriculaires

• Indications

o Otite moyenne aigüe

o Otite chronique

o Otite externe

• Modalités du prélèvement

o Réalisé par oto-rhino-laryngologiste

o OMA: prélèvement réalisé après incision du tympan à l’aide d’un cathlon monté sur
seringue (écouvillonnage non recommandé)

o Otite chronique: écouvillonnage du pus avec alginate

o Otite externe: écouvillonnage conduit auditif externe

Culture

Antibiogramme

o Selon recommandations du CA-SFM

o Sur espèces isolées dans les OMA et les OM récidivantes

• Interprétation

o H. influenzae, S. pneumoniae, M. catarrhalis ==˃ rôle pathogène

o Autres bactéries: interprétation difficile surtout en cas de prélèvement par

écouvillonnage ==˃ attribuer un rôle pathogène potentiel aux microorganismes
prédominants ou isolés de façon itérative
 o Otites plurimicrobiennes (S. pneumoniae + H. influenzae): fréquentes dans otites
récidivantes et otites externes

2-3: Prélèvements des sinus

• Indications

o Sinusites complexes et chroniques: sinusite invasive, échecs thérapeutiques avec

extension de l’infection, sinusites nosocomiales

• Modalités du prélèvement

o Doit être réalisé par un ORL

o Aspiration ou ponction au niveau du méat moyen (parfois biopsies guidées par

imagerie)

o Alternative: prélèvement 1/3 inférieur des fosses nasales (mais mauvaise qualité car
contamination par flore commensale)

• Examen microscopique

o Après coloration de Gram, ou autres colorations spécifiques aux champignons

• Culture

o GS, G chocolat: incubées à 37°C, 5-10% CO2, 48h

o Chapman, EMB à 37°C en atmosphère normale

o Ballon anaérobie

o Sabouraud en tubes à 25°C, 15 jours

• Interprétation

o Prélèvements souvent polymicrobiens

o Incrimination des espèces isolées peut nécessiter prélèvements itératifs:

interprétation en fonction du contexte clinique et quantité de bactéries isolées

2-4: Prélèvements naso-pharyngés

• Indications

o Suspicion de coqueluche (recherche de Bordetella sp)

o Parfois portage de bactéries multirésistantes

• Modalités du prélèvement

o Aspiration naso-pharyngée à l’aide d’un cathéter flexible placé au bout d’une

seringue

o Alternative: écouvillonnage avec écouvillons fins

• Culture

o Gélose de Bordet-Gengou incubée sous 10 % de CO2 pendant 3-7 jours

 o sensibilité de 50 à 60 % dans la 1ère semaine de toux et de 0 % après 3 à 4 semaines
de toux

• Amplification génique par PCR: méthode de choix en cas de suspicion coqueluche

• Recherche de Bordetella sp dans prélèvement naso-pharyngé doit faire l’objet d’une

demande spécifique et est réservée aux laboratoires spécialisées

• Isolats obtenus envoyés à un centre de référence pour typage et antibiogramme.

Conclusion

• Infections ORL regroupent plusieurs entités: infections de la gorge (angines), otites, sinusites

• Modalités du prélèvement varient en fonction du type infection

• Difficulté majeure diagnostic biologique: agents pathogènes à rechercher se trouvent au

milieu d’une flore commensale

• Interprétation délicate: nécessité d’associer conditions de culture, espèces isolées,

prélèvements itératifs, présentation clinique.