Synthése sur:

“Détection de Xylella fastidiosa

par PCR en temps réel sur végétal “

Mehdi Nouha – Numero d’ordre: 18 Encadré par:

Pr. Zahid

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 Sommaire:
I. Problématique

1- Contexte et theme
2- Caractéristiques de la Xyllela Fastidiosa

II-Objectifs

III- Matériels et Méthodes

1- Principe de la méthode
2-Echantillons et prélèvemnts
3-Test de détection par PCR en temps réel

IV- Analyse de donnees et Résultats:

a-Contrôle de la validité des résultats

b- Calculs et expression des résultats:

V- Conclusion
VI-Sources utilisées

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 I. Problématique:

1. Contexte et thème:

X. fastidiosa est une bactérie du xylème présente sur le continent américain sur une large
gamme d’hôtes. Il a été décrit à ce jour cinq sous-espèces de la bactérie, chacune plus ou
moins inféodée à une gamme de plantes hôtes et/ou à une région géographique. Ainsi
L'étude de Xylella fastidiosa est d'une importance cruciale pour prévenir sa propagation,
protéger les cultures et préserver les écosystèmes.

Thème: Utilisation de la PCR en temps reel sur l’ADN d’un vegetal pour détecter Xyllela
Fatidiosa.
Question de recherche: Est ce que l’analyse de l’ADN par PCR en temps reel a permis de
detecter la presence de la bacterie pathogene “X.Fastidiosa”?
Hypothèse: Le PCR en temps reel permet une detection efficace de X.Fatidiosa sur les
echantillons qu’elles soient symptomatiques ou non.

2. Caracteristiques de la xyllela Fastidiosa:

a. Répartition et dissimulation de la bactérie au monde:

Malgré son statut de quarantaine en tant qu'organisme réglementé pour l'Union européenne et
les réglementations relatives à son importation, X. fastidiosa est désormais considéré comme
un organisme émergent en Europe. Son émergence a été marquée par la déclaration d'un foyer
sur des oliviers en Italie fin 2013 (Loconsole et al., 2014). En 2014, la présence de cette
bactérie a également été signalée en Iran sur des vignes et des amandiers (Amanifar et al.,
2014). En France, la bactérie a été isolée en 2012 à partir de plants de caféiers (Coffea arabica
et C. canephora) importés d'Amérique latine. En juillet 2015, la bactérie a été détectée en
Corse, notamment sur des polygales (Polygala myrtifolia), et a ensuite été identifiée sur de
nombreuses autres espèces végétales. Des polygales ont également été testées positives à X.
fastidiosa en septembre 2015 en région PACA. Depuis 2016, la bactérie est présente en
Allemagne (avec une éradication réussie), en Espagne et au Portugal depuis 2018.

b. Les symtomes:

Les principaux symptômes provoqués par X. fastidiosa sont des brûlures foliaires, suivies dans
certains cas d’un dessèchement généralisé de la plante et de chloroses foliaires.

c. Les voies d’introduction:

La propagation de X. fastidiosa représente un risque majeur de dissémination, tant par la

multiplication et l'exportation de plants contaminés que par les insectes piqueurs-suceurs et les
outils de taille susceptibles de propager la maladie d'une plante à une autre.

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II. Objectifs
Objet: La détection de la bactérie phytopathogène X. fastidiosa sur toutes plantes, qu’elles
soient symptomatiques ou non.

La méthode de détection de Xylella fastidiosa mentionnée utilise un test de détection par PCR
en temps réel. Ce test est qualitatif, ce qui signifie qu'il permet de détecter la présence de X.
fastidiosa dans un échantillon, mais il ne permet pas de quantifier la quantité de la bactérie
présente ni d'identifier la sous-espèce spécifique.

III. Materiels et methodes:

1) Principe de la methode:

1. Reception de l’echantillon.
2. Un prélevement par echantillon: Prelever sur petioles et/ou nervures centrales, rameaux
non ligneux, tiges ou xylemes sur rameaux ligneux.

On utilise1g minimum de materiel vegetal

3. Broyage: 5 ml d’eau déminéralisée par gramme de matériel vegetal.

4. Sonification: 1min à 35-40 kHz et maceration environ 15 minutes à temperature
ambiante.
5. Deux prises d’essai par prélèvement pour extraire l’AND.
6. Extraction ADN: Olivier / chênes spp ou autres matrices.
7. On fait deux amplifications par extrait ADN : 4 amplifications par echantillon.
8. On effectue le test PCR en temps reel.

 Controle de la qualité de la manipulation afin de garantir la fiabilité des résultats:

Le contrôle de qualité de l'analyse comprend quatres types. Tout d'abord, un contrôle positif de
processus est utilisé, contenant l'organisme cible, qui est soumis à toutes les étapes de l'analyse,
à partir de l'extraction. Il permet de vérifier la qualité de la manipulation et le bon
fonctionnement du matériel. Si différentes espèces végétales sont analysées, il est recommandé
d'inclure un contrôle positif par espèce végétale ou au moins par genre botanique.

Ensuite, un contrôle négatif de processus est préparé pour chaque série d'extractions, utilisant
de l'eau stérile pour vérifier l'absence de contamination lors de l'extraction d'ADN. De plus, un
contrôle positif de PCR est inclus dans chaque réaction de PCR en temps réel, utilisant une
solution contenant les acides nucléiques cibles pour vérifier la qualité de l'amplification et de la
manipulation. Enfin, un contrôle négatif de PCR est également inclus, utilisant de l'eau ultra
pure pour vérifier l'absence de contamination lors de la phase de réaction de PCR. Ces contrôles
garantissent la fiabilité des résultats et permettent de détecter toute contamination ou problème
technique lors de l'analyse.

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 2) Echantillons et Prélèvement:

1. Les echantillons doivent etre en bon etat et conditionné individuellement dans un

emballage hermétique et parfaitement identifié et accompagnés d’une fiche de demande
d’analyse unique par échantillon.
2. Conservation: l’échantillon devra être conservé à 5°C sans dépasser 7 jours.
3. Prélèvement: Si l’échantillon est symptomatique, réaliser le prélèvement sur les
organes présentant des brûlures foliaires et/ou des chloroses et/ou dessèchements.
Sinon, prélever les tissus vasculaires des rameaux ligneux (xylème).
4. Extraction de l’ADN: L'ADN total des échantillons est extrait et purifié à l'aide d’un kit
d'extraction d'ADN de plante disponible dans le commerce. Le type de kit d'extraction
validé par le LNR pour cette méthode est le QuickPickTM SML Plant DNA Kit (Bio-
Nobile).

3) Test de détection par PCR en temps réel :

Pour chaque solution mère d’ADN extrait, deux amplifications doivent être réalisées.
Pour chaque série d’amplification, réaliser un témoin négatif d’amplification et un témoin
positif d’amplification

IV. Analyse de donnees et Résultats:

a. Contrôle de la validité des résultats:

La validation de l'analyse consiste à examiner les courbes de fluorescence produites par l'appareil
de PCR en temps réel à partir des différents témoins. L'analyse est considérée comme validée
uniquement si toutes les conditions requises sont satisfaites à la fin de la réaction.

L'analyse est considérée comme validée uniquement si toutes les conditions suivantes sont
remplies à la fin de la réaction :

 Le contrôle négatif de processus et le témoin négatif d'amplification ne présentent aucune

courbe de fluorescence caractéristique ni de valeur de Ct supérieure à 38. Ils permettent
de vérifier l'absence de contamination croisée accidentelle.
 Le contrôle positif de processus et le témoin positif d'amplification génèrent une courbe
de fluorescence de type exponentielle et une valeur de Ct inférieure ou égale à 38.

b. Calculs et expression des résultats:

Une fois que la série d'analyses est validée, les résultats peévent être interprétés comme fiables et
significatifs. Selon la publication de Harper et al. (2010, Erratum 2013), le seuil de détection de
la méthode est fixé à 38.
 Si la Ct obtenue par le replicat est inférieure à 38, le réplicat est considéré positif.
 Si la Ct obtenue par le replicat est supérieure à 38, le réplicat est considéré négatif.
Pour chaque échantillon analysé, les résultats des deux prises d’essai, par exemple
référencées ‘A’ et ‘B’, sont interprétés en parallèle.

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L’interprétation détaillée en fonction des résultats de chaque réplicat des extraits d’ADN est
présentée dans le tableau ci-après:

V. Conclusion:

La méthode PCR en temps réel QuickPickTM SML Plant DNA Kit est utilisée pour la
détection de Xylella fastidiosa. Elle permet une analyse rapide et précise de l'ADN de la
plante pour identifier la présence de cette bactérie pathogène. La performance de cette
méthode dépend de plusieurs facteurs tels que la qualité de l'échantillon, les conditions de
laboratoire et les protocoles utilisés. Cependant, en général, cette méthode est connue pour sa
sensibilité élevée et sa spécificité dans la détection de Xylella fastidiosa.

VI. Sources utilisées:

 Article etudié :

https://www.anses.fr/fr/system/files/ANSES_LSV_MA039_V5.pdf

 Autre sources ulisées:

https://agriculture.gouv.fr/xylella-fastidiosa-cest-quoi