Institut agronomique et vétérinaire Hassan II

Complexe Horticole d’Agadir

Utilisation de l’immunofluorescence pour la détection

des bactéries phytopathogènes
Le cas de Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus

PREPAREE ET PRESENTEE PAR : EVALUEE PAR :

ELAASRI Abdessamad PR. Fatmi M'Barek

BOUKHRISS Aya

ANNEE ACADEMIQUE : 2021/2022

 PLAN

I. Généralités sur Clavibacter michiganensis subsp. Sepedonicus

II. La technique d’immunofluorescence
 Définition et principe
 Types de l’immunofluorescence

III. Détection de Clavibacter michiganensis subsp. Sepedonicus

IV. Avantages et inconvénients
V. Références
 I. Généralités sur Clavibacter michiganensis subsp.
Sepedonicus

Introduction

- L’une des bactéries les plus destructrives de la pomme de

terre.

- Elle n’attaque naturellement que la pomme de terre.

- Présente actuellement dans plusieurs régions.

Sources: detection of clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in

potato tubers (Solke H, De Boer) – Cours maladies bactériennes(M.Fatmi)
 I. Généralités sur Clavibacter michiganensis subsp.
Sepedonicus
Symptômes

Enroulement des parties Pourriture annulaire de

marginales des folioles vers l’anneau vasculaire et exudats
l’intérieur du limbe Sources: detection of clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in
potato tubers (Solke H, De Boer) – Cours maladies bactériennes(M.Fatmi)
 I. Généralités sur Clavibacter michiganensis subsp. Sepedonicus

Moyens de lutte

Elle préfère les températures froides Tubercules doivent être indemnes de

Production des semences dans les bactéries ( Culture in vitro )
régions chaudes est préférée

Diagnostic

Lot Analyse
Echantillonnage
nombre
de
de PDTs
PDTs
?

Sources: Cours maladies bactériennes(M.Fatmi)

 II. La technique d’immunofluorescence

Définition et principe

- L'immunofluorescence est une technique puissante qui utilise des anticorps

marqués par fluorescence pour détecter des antigènes cibles spécifiques. Elle est
largement utilisé dans la recherche scientifique et les laboratoires cliniques.

- En bactériologie, on utilise l’immunofluorescence pour une détection directe de

bactéries dans les liquides biologiques.

- Il existe deux catégories de techniques d'immunofluorescence, primaire (ou

directe) et secondaire (ou indirect).

Sources: Ephytia.inra.fr
 II. La technique d’immunofluorescence

Types de l’immunofluorescence

1. Immunofluorescence directe :

Primaire ou directe, immunofluorescence utilise Fluorochrome

un seul anticorps primaire, chimiquement lié à
un fluorochrome . L'anticorps primaire Anticorps primaire
reconnaît la molécule cible et se lie à une région
spécifique appelée l'épitope. Le fluorochrome Antigène
fixé peut être détectée par microscopie à
fluorescence.

Sources: Ephytia.inra.fr
 II. La technique d’immunofluorescence
Types de l’immunofluorescence

2. Immunofluorescence indirecte :
Fluorochrome

Secondaire, ou indirecte, immunofluorescence

utilise deux anticorps, le premier anticorps non Anticorps secondaire

marqué se lie spécifiquement à la molécule cible,

et l'anticorps secondaire, qui porte le Anticorps primaire
fluorochrome, se fixe sur l'anticorps primaire.
Plusieurs anticorps secondaires peuvent se lier à Antigène
un anticorps primaire unique.

Sources: Ephytia.inra.fr
 III. Détection de C.michiganensis subsp. Sepedonicus

Echantillonnage

Sélection aléatoire de 200 tubercules à partir d’un lot de semences

2 répétitions

2 cas : 20 si la détection est importante

(recherche des sources d’inoculum-infection
probable aux cultures saines)
Sources: detection of clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers (Solke H, De Boer)
 III. Détection de C.michiganensis subsp. Sepedonicus

Protocole d’extraction

1. Enlever 0,5g de l’extrémité de du

stolon en utilisant le scalpel ( ou
mellon baller-12mm)

2. Rincer avec de l’eau le sol attaché

au noyaux en utilisant un tamis

Sources: detection of clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers (Solke H, De Boer)
 III. Détection de C.michiganensis subsp. Sepedonicus

Protocole d’extraction

3. Faire macérer les noyaux dans un

mixeur à grande vitesse pour 60 à 90s (
ou homogéniseur mécanique )

4. Filtrer le résultat de macération en

utilisant une double couche de
l’étamine(Cheesecloth) ou en utilisant
le filtre de café.

Sources: detection of clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers (Solke H, De Boer)
 III. Détection de C.michiganensis subsp. Sepedonicus

Immunofluorescence indirecte
1. Centrifugation de 20ml du liquide filtré à partir du macérât pendant 10min à 175g
et collecter le surnageant.

2. Centrifugation du surnageant pendant 20min à 6000g et suspendre le culot dans

1,5 ml de 0,01 M PBS, pH 7,4.

3. Préparer des dilutions de 1/10, 1/50 et 1/100 de culot remis en suspension et

pipeter 15 µl de chaque dilution, en double, sur des fenêtres séparées d'une lame de
microscope imprimée à plusieurs fenêtres.
4. Sécher la lame à 50°C et fixer l'échantillon par immersion dans l'acétone pendant
10-15 min, puis sécher à nouveau la lame.

Sources: detection of clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers (Solke H, De Boer)
 III. Détection de C.michiganensis subsp. Sepedonicus

5. Ajouter 15 µl d’un anticorps de C. michiganensis subsp. sepedonicus (par exemple,

anticorps monoclonal 9A1, Agdia, Inc., ou équivalent) sur chaque fenêtre de la lame
et l’incuber pendant 45-60 min à 37°C dans une chambre humide pour éviter
l'évaporation.

6. Laver et sécher la lame et colorer avec un conjugué fluorescéine-anticorps anti-

souris.

7. Lavez et séchez la lame et montez une lamelle avec du liquide de montage (90 %
glycérol/10 % 0,01 M PBS, pH 7,4).

8. Observez les cellules bactériennes fluorescentes à un grossissement de

1000x avec un microscope optique en utilisant une ampoule au mercure ou au xénon
pour l'éclairage par épifluorescence et un fil spécifique à la fluorescéine.

Sources: detection of clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers (Solke H, De Boer)
 III. Détection de C.michiganensis subsp. Sepedonicus
Immunofluorescence indirecte

Si on détecte 1cellule fluorescente par

50 champs magnétiques on peut dire
que l’échantillon est positif.

On doit focaliser la lecture que sur 50

champs à partir de 500 champs par
cavité.

Sources: detection of clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers (Solke H, De Boer)
 III. Détection de C.michiganensis subsp. Sepedonicus
Immunofluorescence indirecte

Schaad-A,Schaad-B,Massart:
Combinaisons des méthodes
d’extraction et des méthodes de
pcr pour la détection.
Cms: C.michiganensis subsp.
Sepedonicus

Sources: Performance of real-time PCR and immunofluorescence for the detection of Clavibacter michiganensis
subsp. sepedonicus and Ralstonia solanacearum in potato tubers in routine testing. (EPPO)
 III. Détection de C.michiganensis subsp. Sepedonicus
Immunofluorescence indirecte

Faussement négative : 0% par apport

6,8%
Schaad-A : Combinaison d’une
Faussement positive : 2,1% par apport méthode d’extraction et une
0,4% méthode de pcr pour la
détection.

Sources: Performance of real-time PCR and immunofluorescence for the detection of Clavibacter michiganensis
subsp. sepedonicus and Ralstonia solanacearum in potato tubers in routine testing. (EPPO)
 IV. Avantages et inconvénients

Les avantages
• Robuste, pas chère et spécifique.
• Sensibilité acceptée.
• En immunofluorescence indirecte, on a une augmentation de
l’intensité lumineuse, car il y a plusieurs sites de fixation sur les
anticorps primaires, ce qui permet d’avoir plusieurs anticorps
secondaires fixés dessus.
• La disponibilité des antisérums spécifiques aux espèces et aux
pathovars.
Sources: Performance of real-time PCR and immunofluorescence for the detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus and Ralstonia solanacearum in
potato tubers in routine testing (EPPO)
Indirect immunofluorescence test for plant pathogenic bacteria (EPPO,2009)
The application of immunofluorescence techniques to host plant/nodule bacteria selectivity experiments using Trifolium repens (D.G. Jones, P.E. Russell )
Plant pathology Fifth edition (GEORGE N. AGRIOS)
Comparison of Dig-Labeled PCR, Nested PCR, and ELISA for the Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in Field-Grown Potatoes (I.-M. Lee)
 IV. Avantages et inconvénients

Les inconvénients

• Temps nécessaire parfois long.

• La possibilité de réactions faussement positives et faussement
négatives.
• Requiert un personnel bien formé pour l'examen des lames avec
des bactéries colorées.
• Une microscopie à fluorescence et des réactifs de haute qualité
sont nécessaires -spécificité des anticorps-
Sources: https://serologytest.com/immunofluorescence-principle-types-applications-advantages-disadvantages/
Indirect immunofluorescence test for plant pathogenic bacteria (EPPO,2009)
The application of immunofluorescence techniques to host plant/nodule bacteria selectivity experiments using Trifolium repens (D.G. Jones, P.E. Russell )
Plant pathology Fifth edition (GEORGE N. AGRIOS)
Comparison of Dig-Labeled PCR, Nested PCR, and ELISA for the Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in Field-Grown Potatoes (I.-M. Lee)
 V. Références

- Detection of clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers (Solke

H, De Boer)
- Cours maladies bactériennes(M.Fatmi)
- https://serologytest.com/immunofluorescence-principle-types-applications-advanta
ges-disadvantages/
- Indirect immunofluorescence test for plant pathogenic bacteria (EPPO,2009)
- The application of immunofluorescence techniques to host plant/nodule bacteria
selectivity experiments using Trifolium repens (D.G. Jones, P.E. Russell )
- Plant pathology Fifth edition (GEORGE N. AGRIOS)
- Comparison of Dig-Labeled PCR, Nested PCR, and ELISA for the Detection of
Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in Field-Grown Potatoes (I.-M. Lee)
- Performance of real-time PCR and immunofluorescence for the detection of
Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus and Ralstonia solanacearum in
potato tubers in routine testing. (EPPO)
- Ephytia.inra.fr
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