Techniques de Biologie Moléculaire (Chapi)

Génie Génétique
Année universitaire 2019/2020

Responsable de module : ZAKHROUF Zohra
CHAPITRE 2. LES TECHNIQUES D’ANALYSE DE L’ADN
2.1 Electrophorèse sur gel d’agarose ou polyacrylamide
Les acides nucléiques peuvent être séparés en fonction de leur taille par électrophorèse sur gel
d’agarose ou polyacrylamide. A pH neutre l’ADN est chargé négativement et migre vers l’anode.
L’électrophorèse est donc une méthode de séparation de particules chargées électriquement

par migration différentielle sous l'action d'un champ électrique.
Le gel d’acrylamide permet d’analyser des fragments d’ADN de très petites tailles et donne la
possibilité d’une résolution de l’ordre de la paire de base
L’agarose qui est un polysaccharide extrait d’une algue, Rhodophycea, permet d’analyser de
manière très simple des fragments d’ADN plus grands obtenus après hydrolyse par des enzymes
de restriction ou amplifiés par PCR.
Université Amar Thelidji-Laghouat

Département de Biologie
1
Génie Génétique
 Pour visualiser les bandes d'ADN, le gel est trempé dans un colorant bromure d’éthidium
qui se lie à l'ADN et émet une fluorescence brillante sous lumière ultraviolette
 En comparant l’emplacement d’ADN avec celui des marqueurs, le poids moléculaire d’ADN
étudié peut être estimé.
2.2 Technique de PCR

2
Génie Génétique
Cette technique permet d’obtenir un nombre élevé de copies d’une séquence d’ADN connue
Une ADN polymérase Taq polymérase extraite de la souche bactérienne thermophile Thermus
aquaticus, est utilisé pour catalyser la réaction de polymérisation.
Des amorces complémentaires sont nécessaires pour l’amplification, l’enzyme allonge les amorces
dans le sens 5’ → 3’

3
Génie Génétique
La Taq polymérase est dépourvue d'activités de réparation (5'-3' exonucléase et 3'-5' exonucléase).
Parce qu'elle est dépourvue d'activités d'édition la Taq polymérase est responsable de nombreux
mutations .
L’ADN polymérase de l’hyper thermophile Pyrococcus furiosus, appelée Pfu polymérase., C'est la meilleure
polymérase thermostable pour la correction des erreurs de réplication (Fidélité élevée) grâce à son activité
auto-correctrice. Cette enzyme est très utilisée lorsqu’une haute précision est requise.
 Reverse PCR (RT PCR)
Basée sur l’utilisation des ARNm, cette méthode est utilisée pour étudier l’expression d’un gène
(voir figure ci-dessous)

4
Génie Génétique

5
Génie Génétique
 PCR en temps réel ( REAL TIME PCR)
La PCR en temps réel repose sur la détection et la quantification d’un émetteur fluorescent
pendant le processus d’amplification. L’augmentation du signal d’émission fluorescente est
directement proportionnelle à la quantité d’amplicons produits durant la réaction.
L’émission fluorescente augmente lorsque qu’ils sont liés à l’ADN double brin. Pour être utilisés dans une
réaction de PCR en temps réel, ces agents doivent rencontrer deux exigences : augmenter en fluorescence
lorsque lié à l’ADN double brin et ne pas inhiber la réaction de PCR. Le SYBR Green I, est l’agent le plus
fréquemment utilisé.
L’émission de fluorescence est mesurée à la fin de chaque étape d’élongation pour chacun des
cycles par un système de lecture intégré à l’appareil de PCR en temps réel qui permet de suivre
l’augmentation de la quantité d’ADN amplifié durant la réaction

6
Génie Génétique
2.3 Techniques d’Hybridation des acides nucléiques
L’hybridation d’une sonde marquée avec un ADN dénaturé permet de marquer de façon
spécifique tous les fragments d’ADN dont la séquence est complémentaire de la sonde.
 Le Southern blot est une technique mise au point par Edward M. Southern en 1975, utilisée
pour détecter des fragments de l’ADN séparés par une électrophorèse en les hybridant
avec une sonde complémentaire bien spécifique.

7
Génie Génétique
 Les étapes de southern blot

1. Digestion de l’ADN par les enzymes de restriction
2. Séparation des fragments par électrophorèse
3. Les fragments sont transférés du gel à une membrane de nylon ou nitrocellulose à
laquelle l’ADN va se fixer.
4. La membrane est déposée sur le gel et recouverte d’une pile de papier buvard qui
absorbe le tampon ce qui dénature l’ADN et transfère l’ADN simple brin à la surface de
membrane.

8
Génie Génétique
5. La membrane est incubée dans un sac contenant les sondes et une solution
d’hybridation pendant quelques heures.
6. Une étape de lavage pour éliminer les sondes non hybridés.
7. La membrane est séchée puis mise au contact d’un film radiographie à l’abri de la
lumière
8. les taches noires sur le film correspondent aux emplacements où ont migré les
fragments d'ADN complémentaires de la sonde.
 La technique de Northern blot permet de comparer les niveaux d’expression d’un gène
dans différentes situations. On peut déterminer le taux d’expression de l’ARNm d’un tissu
donné à un moment déterminé ou sous l’effet d’un stress.
2.4. Le séquençage d’ADN
Le séquençage d’un gène est la connaissance du nombre, de la nature et de l’ordre des nucléotides
qui le composent La réaction de séquençage est une technique de synthèse d’ADN analogue à la
PCR. Elle consiste à effectuer la synthèse de multiples brins d’ADN complémentaires du brin dont
on veut déterminer la séquence.
La méthode de séquençage la plus utilisée est celle de FRED SANGER, Pour le séquençage
des nucléotides légèrement différents sont utilisés: les didésoxyribonucléotides (ddNTP) au lieu
des désoxyribonucléotides triphosphate (dNTP).

9
Génie Génétique
La méthode de séquençage de Sanger comporte ces étapes :
 la dénaturation de double hélice
 la synthèse du brin complémentaire à l’aide de l’ADN polymérase à partir d’une matrice

en présence des 4 désoxyribonucleotides et d’un didésoxyribonucléotide qui joue le rôle
de terminateur de chaine. Quatre réactions en parallèle sont nécessaires
 Séparation sur gel de polyacrylamide des fragments synthétisés.

10
Génie Génétique
L'automatisation du séquençage
L’automatisation de la méthode de Sanger nécessite l’utilisation des ddNTP fluorescents

au lieu des ddNTP radioactifs. Un marqueur fluorescent (fluorochrome) spécifique et différent est
attaché à chacun des quatre ddNTP
Les séquenceurs automatiques déterminent la séquence nucléotidique d’un ADN inconnu

par la séparation automatisée des divers fragments au sein d’un capillaire rempli de gel et la
lecture directe, à l’aide d’un faisceau laser, des signaux de fluorescence émis par les differents
ddNTP.

11
Génie Génétique
Les séquenceurs permettent de lire plusieurs centaines de nucléotides avec une très bonne
qualité, jusqu'à 10 00 pour les appareils les plus performants !

12

Techniques de Biologie Moléculaire (Chapi)

Transféré par

Informations du document

Titre original

Copyright

Formats disponibles

Partager ce document

Partager ou intégrer le document

Options de partage

Avez-vous trouvé ce document utile ?

Ce contenu est-il inapproprié ?

Droits d'auteur :

Formats disponibles

Techniques de Biologie Moléculaire (Chapi)

Transféré par

Droits d'auteur :

Formats disponibles

Génie Génétique

Année universitaire 2019/2020

CHAPITRE 2. LES TECHNIQUES D’ANALYSE DE L’ADN

2.1 Electrophorèse sur gel d’agarose ou polyacrylamide

L’électrophorèse est donc une méthode de séparation de particules chargées électriquement

Université Amar Thelidji-Laghouat

2.2 Technique de PCR

Université Amar Thelidji-Laghouat

Université Amar Thelidji-Laghouat

 Reverse PCR (RT PCR)

Université Amar Thelidji-Laghouat

Université Amar Thelidji-Laghouat

 PCR en temps réel ( REAL TIME PCR)

Université Amar Thelidji-Laghouat

2.3 Techniques d’Hybridation des acides nucléiques

Université Amar Thelidji-Laghouat

 Les étapes de southern blot

Université Amar Thelidji-Laghouat

6. Une étape de lavage pour éliminer les sondes non hybridés.

2.4. Le séquençage d’ADN

Université Amar Thelidji-Laghouat

La méthode de séquençage de Sanger comporte ces étapes :

 la dénaturation de double hélice

 la synthèse du brin complémentaire à l’aide de l’ADN polymérase à partir d’une matrice

 Séparation sur gel de polyacrylamide des fragments synthétisés.

Université Amar Thelidji-Laghouat

L’automatisation de la méthode de Sanger nécessite l’utilisation des ddNTP fluorescents

Les séquenceurs automatiques déterminent la séquence nucléotidique d’un ADN inconnu

Université Amar Thelidji-Laghouat

Université Amar Thelidji-Laghouat

Vous aimerez peut-être aussi