Exercice 1 :

Dessiner les différentes étapes de la PCR sur 2 cycles.

Exercice 2 :
Ici on cherche à quan@fier la présence des bactéries dans un sol. Afin de les quan@fiés, on u@lise le
gène 16S rRNA de la bactérie. Voici les résultats obtenus par qPCR.
On cherche à quan@fier à l’aide d’une gamme connue du nombre de copie de 16S bactérien allant de
102 à 108. Chaque point de gamme on était faite avec 2 réplicats.

NC/µl Rep1 Rep2

1,00E+08 Std-1 8,75 8,61
1,00E+07 Std-2 12,47 12,22
1,00E+06 Std-3 15,82 15,79
1,00E+05 Std-4 19,52 19,63
1,00E+04 Std-5 22,80 22,75
1,00E+03 Std-6 26,05 26,00
1,00E+02 Std-7 25,10 27,49
NTC 27,14 27,11

Échantillon ng ADN Ct
Ech 12-0,2ng 0,2 20,21
Ech 12-0,02ng 0,02 23,39
Ech 12-0,02ng 0,02 23,03
Ech 13-0,2ng 0,2 19,91
Ech 13-0,02ng 0,02 22,86
Ech 13-0,02ng 0,02 22,76
Ech 14-0,2ng 0,2 20,15
Ech 14-0,02ng 0,02 22,83
Ech 14-0,02ng 0,02 23,09
Ech 15-0,2ng 0,2 20,48
Ech 15-0,02ng 0,02 23,36
Ech 15-0,02ng 0,02 23,07

1) Faire une courbe de type Ct = a log(nbr copies) + b,

a) Calculer les log des nombres de copies
b) Tracer la courbe
c) Déterminer l’équa@on de la droite
d) Calculer l’efficacité de la qPCR avec la formule suivante : E = 10(1/pente) -1
e) Calculer le nombre de copie présent dans chaque échan@llon à l’aide de l’équa@on de la
droite

Exercice 3 : QuanCficaCon relaCve

• pas besoin de courbe de standard

• calcul des résultats pas comparaisons des Ct
 • nécessité de définir :
- un gène cible servant de contrôle endogène,
- un gène cible servant de standard.
le contrôle endogène :
- donne une image de la quan@té de matrice apportée (ADN ou ADNc),
- est présent en quan@té constante dans tous les échan@llons,
- normalise :
- les biais d’extrac@on et de contamina@ons par des inhibiteurs (ADN)
- les varia@ons d’efficacité de transcrip@on inverse

On cherche à comprendre la capaciter à métaboliser l’atrazine par un sol. Pour cela, on cherche à
voire l’ac@vité du gènes atzA. En effet les gènes atzA et atzB catalysent les deux premières étapes
de la voie métabolique d'une bactérie qui métabolise rapidement l'atrazine en dioxyde de
carbone, en ammoniac et en oxygène.
Afin de normaliser l’ac@vité dans ce sol, on va régalement quan@fié l’ac@vité du gènes 16S rRNA
des bactéries

-t0 ajout d’atrazine à des mésocosmes de sol,

-t0 sera u@lisé comme valeur standard

t=0 t=2 t=4 t=7 t=14 t=21

Figure 1 : date des temps de prélèvements

Gene cible = atzA

Gene endogène = 16S rRNA des bactéries

Etape 1: normalisa@on par rapport au contrôle endogène

Ct gène cible – Ct contrôle endogène = DCt

Etape 2: normalisa@on par rapport au standard

DCt échan9llon - DCt standard = DDCt
Etape 3: détermina@on de la varia@on du nombre de copie du gène cible
2-DDCt