TP : UTILISATION DU LOGICIEL SNAPGENE ET CLONAGE MOLECULAIRE

Valentine BRETEAU
IV. QUESTIONS POUR SE FAMILIARISER AVEC LE LOGICIEL

Ouvrir le vecteur 1_pCMV-EYFP, quelle est la taille de vecteur ?

La teille du vecteur est de 4680 paires de bases

- Quel est la taille du gène codant pour la EYFP ?

La taille du gène est de 717 paires de bases

- Quels sont les 5 premiers acides aminés de la EYFP ?

Les 5 premiers AA sont : Met-Val-Ser-Lys-Gly

- Gène de résistance à la kanamycine et la néomycine : combien contient-il de paires de base ?

combien d’acides aminés comprend la protéine ? quelle est la masse moléculaire de la protéine ?

Ils contiennent 795 paires de bases, 264 acides aminés, la masse moléculaire de la protéine est de
29 KDA

- Quels sont les sites de restriction de SalI et AvrII ?

- Combien de fragments seraient obtenus avec une digestion par SalI et AvrII ? Quel tampon peut
être utilisé pour faire une double digestion ?

Apres digestion par la SalI et AvrII , il y as 3 site de restriction

Le tampon qui peut être utilisé pour faire une double digestion est le tampon CutSmart

- Peut-on utiliser les amorces EGFP-N et EGFP-C pour amplifier le gène codant pour EYFP ?

Non, nous ne pouvons pas utiliser les amorces EGFP-N et EGFP-C : L’amorce EGFP-N n’est pas
orientée dans le bon sens, si on la prend nous aurions la partie qui ne nous intéresse pas. De plus
cette amorce coupe le gène EYFP mais pas au début du gène. Pour l’amorce EGFP-C, celle-ci n’est pas
orienté dans le bon sens, nous aurions pu l’utiliser uniquement si nous aurions changé son sens.
VI. CONSTRUCTION DU VECTEUR SUR SNAPGENE

Nom Séquence Tm %CG

Cherry 1 AGCTAGCatggtgagcaagggcgagg 69°C 60 %
Cherry 2 TCTAGActtgtacagctcg 60°C 48%

- Quelles enzymes de restriction utilisez-vous ?

Les enzymes de restrictions utilisés sont NheI et XbaI

- Quelle est la taille finale de ce nouveau vecteur ?

La taille finale de ce vecteur est de 3443 paires de bases.

VII. PREPARATION DES DIFFERENTES ETAPES

1) PCR

- Calculer le volume de chaque composant de la réaction PCR sur la base des informations
indiquées dans le tableau.
Solutions Volume pour 1 Concentration/quantit
réaction (μL) é finale
Tampon 5X 5 1X
MgCl2 (25 mM) 1.5 1,5 mM
Amorce F (10μM) 1 0,4 μM
Amorce R (10μM) 1 0,4 μM
dNTP (10 mM) 0.5 200 μM
Gotaq (5u/μL) 0.12 0,6 u
ADN (vecteur) 1.5 300 ng
H2O 14.38 Qsp 25 μL

Exemple de calcul pour MgCl2 :

- Volume de MgCl2 (Vmère) : ?
- Volume final (Vfille) : 25 microlitres
- Concentration du MgCl2 (Cmère) : 25 mM
- Concentration final en MgCl2 (Cfille) : 1.5mM
1.5∗25
V mère = 25

V mère = 1.5 microlitres

Combien de réactions PCR devez-vous prévoir ? Justifiez votre réponse

ADN total disponible = 300 ng

ADN par réaction = 7500 ng (300*25 microlitres)
Donc 7500/300 = 25 réaction
Donc nous devons prévoir 25 réaction de PCR
- Définir le programme de la PCR en complétant les informations manquantes
Dénaturation : 30 secondes à 94°C.

Pour la température d'hybridation, celle-ci est déterminée en fonction de la Tm des amorces. Avec
des Tm de 69°C et 60°C, la température d'hybridation est fixée à environ 2°C en dessous du Tm le
plus faible, soit 58°C. Cette réduction de la température d'hybridation de 2°C par rapport à la Tm la
plus basse aide à favoriser une hybridation spécifique des amorces à leurs sites cibles, tout en
réduisant les risques d'hybridations non spécifiques.

Pour l'élongation, le temps est calculé sur la base du nombre de paires de bases à amplifier. Selon le
guide fourni, 1000 paires de bases nécessitent 1 minute d'élongation. Pour une séquence de 725
paires de bases :
725pb *60 secondes = 43 500
43 500 / 1000 = 43.5 secondes
Le temps de l’élongation doit donc être d’environ 44 secondes.

2) Electrophorèse
- Expliquez en quelques mots le principe de la séparation des fragments d’ADN par électrophorèse.
L'électrophorèse sur gel est une technique couramment utilisée en biologie pour analyser et trier des
fragments d'ADN et d'ARN en fonction de leur taille. Elle repose sur l'utilisation d'un gel,
généralement de l'agarose, dont la concentration varie en fonction de la taille des fragments à
séparer. Les gels à concentration plus élevée ont des pores plus petits, ce qui les rend idéaux pour la
séparation des fragments d'ADN plus petits.
Les acides nucléiques sont placés dans des puits sur le gel et soumis à un champ électrique. Comme
l'ADN et l'ARN sont chargés négativement en raison de la présence des groupes phosphate, ils se
déplacent vers l'anode, le côté positif du gel. Les fragments plus petits traversent plus facilement le
gel que les plus grands, ce qui entraîne leur séparation en bandes distinctes selon leur taille. Ainsi,
l'électrophorèse sur gel permet une analyse précise de la taille des fragments d'ADN et d'ARN,
offrant une méthode efficace pour étudier la structure et la composition génétique des échantillons
biologiques.
- Quel résultat attendez-vous ?
Les fragments d'ADN migreront à travers le gel du côté de l'anode (positif) vers le côté de la cathode
(négatif). Les fragments plus petits passeront plus rapidement et migreront plus loin que les
fragments plus grands. Ainsi, les bandes apparaîtront généralement en fonction de leur taille.
- Comment savoir que le fragment observé est bien à la bonne taille ?

Des marqueurs de poids moléculaire sont déposés à côté de l’échantillon sur le gel. Ces marqueurs
consistent en des fragments d'ADN de tailles connues, ce qui permet d'estimer la taille des fragments
inconnus en les comparant à ces marqueurs.
 3) Digestion enzymatique

- Quel tampon utilisez-vous ?

Le tampon a utiliser est le R2.1 car le pourcentage d’activité des deux enzymes de restriction est de
100% dans ce tampon.
Solutions Volume pour 1 Concentration/quantit
réaction é finale
Tampon 10X 2 1X
Enzyme 1 (2u/μL) 0.5 1u
Enzyme 2 (2u/μL) 0.5 1u
ADN (500 ng/μL) 1 500 ng
H2O 16 Qsp 20 μL

Combien de réactions devez-vous prévoir ? Justifiez votre réponse *

ADN total disponible : 500 ng
ADN per réaction = 20 μL × 500 ng/μL = 10000 ng
Donc le nombre de réaction a prévoir est : 10 000/500 = 20 réactions

- A quelle température et pendant combien de temps devez-vous incuber les tubes pour la réaction
enzymatique ?

Incuber à 37 °C pendant 5 à 15 minutes car les deux enzymes sont qualifiées Time-Saver, sinon 1
heure.

4) Vérification du vecteur final

- Après ligation du fragment PCR (codant pour la mCherry) dans le vecteur receveur, on vous propose
de réaliser des mesures spectrophotométriques à 260 nm et 280 nm. Qu’apportent ces mesures ?
Ces mesures facilitent le calcul du ratio des absorbances à 280 nm et à 260 nm pour évaluer la pureté
de notre ADN. Si le rapport A260/A280 est inférieur à 2, cela signifie une potentielle contamination
de notre ADN par des protéines qui absorbent à 280 nm.

- Quelles stratégies proposez-vous pour vérifier que vous avez bien obtenu le vecteur final ?
Comment le différencier les 2 vecteurs d’origine (2_pCMV-mCherry et 3_p-luciferase)

Pour confirmer l'obtention du vecteur final, le séquençage de l'ADN est une approche fiable. En
séquençant les zones autour du site d'insertion, nous pouvons obtenir une confirmation précise de
l'intégration correcte du fragment. De plus, la réalisation d'une PCR en temps réel (qPCR) permet de
vérifier la présence de l'insert en ciblant spécifiquement les séquences d'ADN de l'insert.

On peut distinguer les deux vecteurs d'origine par électrophorèse, car la taille des fragments sera
différente pour chaque vecteur, en fonction de la localisation des sites de coupure.