Les enzymes dans le diagnostic médical ⤓

Préambule : les informations, valeurs, tableaux, graphes et questions présentées ci-dessous ne sont qu'une partie du sujet étudié. Certaines questions ne figurent
pas dans le document support de l'activité mais ont été posées au cours des séances.

Pour rechercher une pathologie, des tests enzymatiques sont fréquemment pratiqués dans les laboratoires d’analyses médicales. La plupart des ces tests sont
réalisés sur des prélèvements sanguins. On peut alors doser soit un substrat, soit une activité enzymatique.

En effet, lors d’une souffrance cellulaire, des enzymes habituellement intracellulaires peuvent se retrouver libres dans le plasma à de fortes concentrations.
L’aide au diagnostic est donc souvent facilitée par la connaissance de la provenance de l’enzyme retrouvée en quantité anormale. Le tableau suivant en fournit
quelques exemples :

Enzyme Source

Alanine aminotransférase (ALAT) foie

Amylase Glandes salivaires, pancréas

Aspartate aminotransférase (ASAT) Cœur, muscle squelettique

Créatine kinase (CK) Muscle, cœur, cerveau

Phosphatase acide (PAC) Prostate

Phosphatase alcaline (PAL) Muqueuse intestinale, rein, os

Le tissu malade peut être aussi identifié par la détermination du profil d’isoenzymes.
[D’après l’ouvrage : Enzymologie et applications de Jean-Pierre SINE (édition ellipses 2010)]

1ère partie : dosage du cholestérol plasmatique

Le cholestérol plasmatique est dosé à l'aide d'un kit fabriqué par Biomérieux (kit "Cholestérol RTU) après réalisation d'une gamme d'étalonnage de
concentration croissante en cholestérol.

- Indiquer, en justifiant, quelle est : la réaction principale ; la réaction indicatrice ; la réaction intermédiaire (si il y en a une)

La méthode mise en oeuvre est une méthode en point final : on attend la fin de la réaction ( au bout de 15 minutes : tout le substrat consommé).
Le substrat doit donc être en concentration limitante, tous les autres constituants (enzymes, coenzymes, cofacteurs) devant être en large excès avec des
conditions physico-chimiques (température, pH) constants et proches des optimaux

Etalonnage de la prodécure : dosage du cholestérol plasmatique par méthode enzymatique en point final

189,000 Fr

L'échantillon à analyser est testé en double essai ; la détermination de la concentration en cholestérol dans le plasma peut être déterminée :

 soit par report graphique (la pire des méthodes... la faible résolution des échelles provoque une inexactitude énorme sur la valeur)

 soit par le calcul en utilisant les paramètres de la droite (pente, ici en L.g-1, et ordonnée à l'origine)

Données :
- le plasma testé a été dilué au 1/20
- les valeurs d'absorbance mesurées pour les deux essais sont respectivement : 0,199 et 0,202
- l'écart-type de répétabilité de la procédure de dosage : sr = 0,06 g.L-1
- l'incertitude-type composée sur cette procédure de dosage : uc = 0,09 g.L-1

1) Démontrer que ρ(cholestérol ; plasma) en g.L-1 est égale à 2,203 g.L-1 pour l'essai 1 et 2,236 g.L-1 pour l'essai 2.

2) Montrer que les deux valeurs mesurées obtenues sont bien compatibles (cf. l'aide mémoire de métrologie).

3) En déduire la valeur retenue pour ρ(cholestérol ; plasma).

4) Calculer et exprimer l'incertitude élargie U en choisissant une valeur du facteur d'élargissement k permettant d'obtenir un niveau de confiance de 95 %
L’incertitude élargie est arrondie de la façon suivante :
- si le premier chiffre significatif est 1, 2 ou 3 : garder deux chiffres significatifs ;
- si le premier chiffre significatif est 4 ou plus : garder un chiffre significatif.
==> l'incertitude élargie U vaut-elle 0,18 g.L-1 ou 0,2 g.L-1 ?

5) Exprimer le résultat de mesure, associant la valeur retenue de ρ(cholestérol ; plasma) et l'incertitude élargie, en respectant la règle suivante : la valeur retenue
du résultat est arrondie de la façon suivante : le dernier chiffre significatif doit être à la même position décimale que le dernier chiffre de
l’incertitude élargie.

6) Conclure en utilisant les données suivantes :


2ème partie : dosage de l'Alanine Amino-Transférase

La détermination de l’activité ALAT plasmatique (ou GPT) d'un patient masculin est réalisée par le kit « Enzyline ALAT/GPT » de BioMérieux, selon la réaction :

ALAT ou GPT = transaminase glutamique pyruvique

LDH = lactate déshydrogénase

- Indiquer, en justifiant, quelle est : la réaction principale ; la réaction indicatrice ; la réaction intermédiaire (si il y en a une).

Pré-incuber le mélange de réactif (R1+R2) 10 min à 30°C ou 37°C en bain thermostaté

Ajuster le spectrophotomètre à zéro contre de l’air ou de l’eau distillée

introduire dans une semi-microcuve spéciale UV :

- 1 000 µL du mélange de réactif (R1+R2) préalablement incubé 10 min à 30 ou 37°C

- 150 µL d’échantillon de plasma à doser

Parafilmer, homogénéiser rapidement, déclencher le chronomètre et introduire dans le spectrophotomètre

thermostaté à 30°C ou 37°C.

Attendre 1 minute.

Mesurer la variation de l’absorbance à 340 nm toutes les 30 secondes pendant 3 minutes

La méthode mise en oeuvre est une méthode cinétique en continue car on effectue la mesure de l’absorbance sur trois minutes sans arrêter la réaction.
Ici, le substrat doit être en excès ainsi que tous les autres constituants (coenzymes, cofacteurs) à l'exception de l'enzyme à doser, qui doit être limitante.

- Expliquer pourquoi la procédure indique d'attente 1 minute avant de commencer à mesurer l'absorbance.
- Justifier, à l'aide des spectres d'absorption ci-dessous, le choix de la longueur d'onde de 340 nm

Sécurité : rechercher, pour les deux protocoles à mettre en œuvre :

- un danger éventuel, sa nature et la ou les voies d'exposition
- puis une situation exposant au danger liée à la réalisation de procédure

- proposer, si nécessaire la (les) mesure(s) de prévention adaptée(s) (collectives et individuelle) au(x) risque(s) encouru(s)

La cinétique obtenue est la suivante :

1) Démontrer que la pente (coefficient directeur) vaut -0,0221 min-1 puis convertir en s-1.

2) Calculer la vitessse initiale de transformation ξi en mol.s-1 selon l'équation aux grandeurs

ε NADH, H+ = 6 220 L.mol-1.cm-1



3) Valider
Date del'équation aux
dernière mise grandeurs
à jour précédente en rédigeant l'équation aux unités.
: 23/11/2022

4) En déduire l’activité z(ALAT ; 150 µL de plasma) de l’ALAT en nkat puis en U.

Données :
- l’activité enzymatique (z) contenue dans le milieu réactionnel porte lamême valeur numérique que la vitesse initiale de transformation ξi (enmole.s-1) dans le
milieu réactionnel et est exprimée en katal.
- 1 U est la quantité d’enzyme nécessaire pour la transformation de 1 µmol de substrat par minute.
COMMENTAIRES
Réponse : les calculs et conversions doivent amener aux valeurs suivantes :
1 Gwendoline Le 23/11/2022
z(ALAT ; 150 µL de plasma) = 6,76 x 10-11 katals
z(ALAT ; 150Bonjour, -3
µL de plasma) = 4,05 x 10 U

5) Déduire la concentration d’activité catalytique b(ALAT -1 -1

Serait-il possible d'avoir une correction svp ? ; plasma) en nkat.L et en U L .
Comparer avec les valeurs usuelles et conclure.
Bien cordialement,
Données : valeurs usuelles dans le sérum à 30 °C :
Gwendoline

Hommes : 100-750 nkat.L-1 ou < à 29 U.L-1 à 30 °C ou < 40 U.L-1 à 37 °C

Sébastien Droguet Le 23/11/2022

Femmes : 80-580 nkat.L -1 ou

Bonjour La<réponse -1 à :30
à 24 U.Lest non.
°C C'est
ou < 33U.L -1 à 37 °C
bien indiqué sur la page d'accueil, l'objectif du site n'est pas de proposer des exercices avec leurs corrigés
mais de remettre en situation ce qui est fait en activité. Préparez les réponses et soumettez les à votre enseignant.
Conclusion : utiliser tous les résultats pour indiquer si le patient semble souffrir souffre d’une pathologie.

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