Chapitre 7

DOSAGE ENZYMATIQUE ET PARAMETRES PHYSICOCHIMIQUES

1. Méthodes de Dosage de l'activité enzymatique

Nombreuses sont les techniques physiques ou chimiques qui permettent de suivre les
paramètres d'une cinétique, pour en citer quelques-unes : spectrophotométrie –
fluorescence – radioactivité - dosages immunologiques

2. Dosage par spectrophotométrie

La spectrophotométrie permet l'étude de solutions colorées dans l'infrarouge (1 100

nm au maximum), dans le visible et dans l'ultraviolet (190 nm).

Figure 1: Longueurs d’ondes

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 Figure 2: Schéma de principe du spectrophotomètre UV-visible mono faisceau.

Figure 3: variation de l’absorbance

Courbe d’étalonnage
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 Figure 4: courbe d’étalonnage

On trace A en fonction de C pour différentes solutions de concentration connues

Pour déterminer une concentration inconnue Cx, on mesure sa densité optique et on

déduit Cx par projection.

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3. Paramètres à doser

Mesurer la quantité d'enzymes qui a une activité enzymatique dans une préparation
donnée. Etudier les paramètres physico-chimiques (KM, Ki, inhibition, effet du pH,
température optimale, etc.).

a. L'activité enzymatique :

C’est la mesure de la quantité d'enzymes active dans une préparation. Une unité
d'activité enzymatique (abréviation U.I. ou U.E.) est définie comme la quantité
d'enzyme qui produit la transformation d'une micromole de substrat par minute à 25°C.

Remarque : dans le système international (S.I.), l'unité officielle est le katal (kat). C’est
la quantité d'enzyme qui catalyse la transformation de 1 mole de substrat par seconde.
Les biochimistes préfèrent utiliser les unités internationales (U.I. ou U.E.)

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 1 U.I = 1 U.E. = 0,0166 µkat = 16,6 nkat.
On peut également exprimer des activités volumiques en termes d'U/mL.

b. L'activité spécifique :

L'activité spécifique des préparations plus ou moins purifiées s'exprime souvent en U/g
de protéines. Si on veut comparer la quantité d'activité entre deux tissus, on utilise
généralement les U/g de tissu. On peut également exprimer des activités volumiques
en termes d'U/mL. L'activité spécifique des préparations plus ou moins purifiées
s'exprime souvent en U/g de protéines. Si on veut comparer la quantité d'activité entre
deux tissus, on utilise généralement les U/g de tissu.

Pour tracer les courbes de Michaelis-Menten, et déterminer le KM, Ki, etc., il faut
mesurer la vitesse initiale de la réaction (V0), aussi appelée activité, à diverses
concentrations initiales de substrat (S0)

4. Effet des paramètres sur la cinétique

a. Température

La température augmente la vitesse enzymatique puisque l'interaction entre

l'enzyme et son substrat devient plus importante à forte température. Nous
constatons que la vitesse augmente d'une façon exponentielle avec la température.
Mais, l'enzyme à partir d'une certaine température voit sa structure se modifier.

A fortes températures la protéine se dénature et perd donc une partie de son

activité enzymatique. L'activité enzymatique sera donc la résultante de la variation
de la vitesse de la réaction enzymatique et du pourcentage de dénaturation de
l'enzyme en fonction de la température. Ainsi, l'activité enzymatique augmente
jusqu'à une température optimale puis diminue pour atteindre une activité nulle à de
grandes températures. A la température optimale l'activité enzymatique est la plus
importante. Cette température optimale varie d'une enzyme à un autre.

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 Figure 5: Température optimum

Examinons maintenant l’effet de la température du milieu sur la réaction enzymatique

qui s’y déroule. Le graphe qui représente les quantités de produit transformées par
une enzyme (A) en fonction de la température du milieu d’incubation, est une courbe
ascendante jusqu’à une tempéra- ture (ici 45°C.) où l’activité de l’enzyme est la plus
grande, puis rapidement descendante.

b. L'effet du pH sur l’activité des enzymes :

Un enzyme est actif à certains pH. L'activité est maximale à un pH précis. C'est
le pH optimal. A ce pH, l'enzyme possède une conformation bien déterminée qui va
lui conférer son activité. Lorsque ce pH varie, la structure de l'enzyme varie et donc
son activité diminue. Ainsi, si nous traçons l'activité enzymatique en fonction du pH,
nous constatons que cette activité augmente pour atteindre une valeur maximale au
pH optimal, ensuite elle diminue pour atteindre une activité égale à zéro à forte pH ;
Il doit être tout à fait clair que le pH optimal varie d'une enzyme à un autre.

Il est possible de déterminer les valeurs du pK d'une enzyme en portant le pKM (=

log KM ) de l'enzyme en fonction du pH. L'activité maximale étant la plus importante
au pH et à température optimaux, il devient tout à fait normal de faire travailler un
enzyme dans les conditions optimales de température et de pH.

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Influence du pH :
Le pH joue sur l’ionisation des molécules :
- conformation de la protéine enzymatique
- disponibilité des fonctions chimiques de l’enzyme et / ou du substrat (i.e. le substrat
réel doit être sous une certaine forme, qui n’est pas nécessairement la forme de la
neutralité).
- En général, à 2 unités du pH optimum, l’activité est réduite 100 fois, mais parfois la
gamme est beaucoup plus restreinte.
- Valeurs extrêmes : il faut les atteindre pour qu’il y ait une dénaturation de l’enzyme
par attaque acide ou basique, sinon, le plus souvent, c’est une inhibition réversible.
Exemple : Effet du pH su l'activité de l’Aldolase de Muscle de Lapin

Figure 6: variation de Vmax en fonction du pH

Le pH Optimum varie d'une enzyme à une autre. Exemples :

- Pepsine (estomac) : fonctionne mieux à pH acide

- Lipase du suc pancréatique : pH optimal compris entre 7 et 7.5

- Phosphatases alcalines osseuses ou hépatiques : pH optimal entre 8.6 et

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BCG S5 Pr Maurady Amal Département de Biologie- FSTT : 2020-2021