Filière Sciences de la Vie

Semestre 4
Année universitaire 2020-2021

MODULE : ENZYMOLOGIE ET BIOCHIMIE METABOLIQUE

TP d’Enzymologie : ETUDE CINETIQUE DE L’INVERTASE

Coordinnation TP :
Pr. Laila EL BOUZIDI
Pr. Mohamed ABDERRAZIK
 SOMMAIRE

A- Eléments utiles de cinétique enzymatique .............................................................1

B- Généralités sur l'invertase et principe du dosage colorimétrique par le DNS .....4
1. Généralités sur l'invertase .........................................................................................4

2. Principe du dosage colorimétrique par le DNS..........................................................5

C- Partie expérimentale ...............................................................................................5

1. Matériel et réactifs disponibles pour le TP ................................................................5

2. Extraction de l’invertase et préparation de la solution enzymatique pour les tests

cinétiques ........................................................................................................................6

3. Réalisation de la gamme étalon pour le dosage des sucres réducteurs .......................6

4. Etude de la cinétique d’hydrolyse du saccharose.......................................................7

5. Etude de l'influence de la concentration en substrat (saccharose) sur la vitesse de

réaction et détermination des paramètres cinétiques Km et Vmax ...................................8

D- Exploitation des résultats .....................................................................................10

 A- Eléments utiles de cinétique enzymatique
La cinétique enzymatique a pour objet d’identifier et de décrire les mécanismes des réactions
biochimiques catalysées par les enzymes (réactions enzymatiques), en étudiant leur vitesse, c’est
à dire leur évolution en fonction du temps.
Les enzymes appelées « Michaeliennes » catalysent la transformation du substrat (S) en produit
(P), selon des réactions qui suivent la théorie de Michaelis-Menten et qui se déroulent en deux
étapes avec un passage par un complexe intermédiaire :
k+1
E + S ES k+2 E+ P
k-1
Pour étudier expérimentalement les propriétés cinétiques de ces réactions enzymatiques, on doit
toujours utiliser une concentration en substrat en large excès par rapport à la concentration en
enzyme, ceci pour être en conformité avec l’une des hypothèses simplificatrices de la théorie de
Michaelis-Menten.

L’étude cinétique peut se faire en suivant la disparition du substrat (S) en fonction du temps, ou
encore l’apparition du produit (P) en fonction du temps, dans les conditions optimales.

- d [S] d [P]
V = =
dt dt
La technique la plus souvent utilisée pour suivre la variation du produit formé en fonction du
temps, est la spectrophotométrie. La courbe [P] = f(t) obtenue a une allure hyperbolique.

Figure 1 : Variation de la concentration du produit en fonction du temps

Cette courbe présente 2 parties distinctes :

- Une partie linéaire croissante, correspondant aux premiers instants de la réaction : Dans
cette phase appelée “phase stationnaire”, la réaction se comporte comme une réaction
d’ordre zéro.
- Une partie non linéaire qui suit l’équation de la vitesse des réactions d’ordre 1, observée
quand la quantité de S transformé devient importante.

1
Dans la phase linéaire de cette courbe, la vitesse V = d[P]/dt est constante et correspond à la vitesse
initiale Vi de la réaction. Elle est déterminée graphiquement en traçant la tangente à l’origine de
la courbe [P] = f (t).
Pour une concentration en enzyme donnée [E], la vitesse initiale de la réaction dépend de la
concentration en substrat [S]o.
Elle augmente avec l’augmentation de [S]o, jusqu’à atteindre une valeur maximale constante
appelée Vmax. De plus, plus [S]o est grande, plus la partie linéaire de la courbe (vitesse constante)
est courte.

Figure 2 : Cinétique de formation du produit pour différentes concentrations en substrat

La vitesse de réaction, exprimée en μg de P par min ou en μmole/min, permet de déduire l’activité

enzymatique exprimée en unités internationales (UI).
C’est l’unité d’activité enzymatique la plus utilisée pour quantifier les vitesses de réactions
enzymatiques. 1 UI correspond à la transformation de 1 micromole de substrat par minute à 25°C
et dans les conditions optimales de l’activité enzymatique (pH, force ionique).
Une fois la vitesse initiale déterminée avec précision pour différentes concentrations initiales de
substrat, on peut tracer ensuite la courbe expérimentale Vi = f ([S]o) qui devrait suivre l’allure de
la courbe de l’équation de Michaelis-Menten si toutes les hypothèses simplificatrices ont été
respectées (voir cours).

k+2 x [E]o
Vi = k+2 : constante catalytique
1 + (Km / [S]o)

k+2 x [E]o = Vmax, vitesse maximale de la réaction qui correspond à l’asymptote horizontale de la
courbe Vi = f ([S]o).
Km = constante de Michaelis, elle correspond à la concentration de substrat pour laquelle la vitesse
initiale de la réaction est égale à la moitié de la vitesse maximale.

Dans le cas des réactions simples à un seul complexe intermédiaire [ES], la première étape étant
la plus rapide ; la constante de Michaelis Km peut être assimilée à la constante de dissociation du
complexe ES.

[E] [S] k-1

Km = = Kd =
[ES] k+1

2
Par conséquent, Km permet de quantifier la force de liaison entre l’enzyme et le substrat ou encore
l’affinité de l’enzyme pour le substrat. Plus le Km est faible plus l’affinité est forte et vice versa.
Ces notions seront abordées en détail dans le cours d’enzymologie.

Figure 3 : Variation de la vitesse initiale en fonction de la concentration en substrat

Pour déterminer les constantes cinétiques avec plus de précision, il est préférable d’utiliser la
représentation de Lineweaver-Burk, dite « des doubles inverses ».
1 1 Km 1
1 / Vi = f (1 / [S]o) qui est une droite d’équation : = + x
Vi Vmax Vmax [S]o

Figure 4 : Représentation de Lineweaver et Burk (doubles inverses)

Dans la partie expérimentale de ce TP, sera étudié l’hydrolyse du saccharose (diholoside) par
l’invertase à l’aide d’une technique de dosage colorimétrique des sucres réducteurs libérés par la
réaction.

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 B- Généralités sur l'invertase et principe du dosage colorimétrique
par le DNS
1. Généralités sur l'invertase
L'invertase ou -D-fructosidase ou encore -D-Fructofuranoside Fructohydrolase (EC : 3.2.1.26)
est une enzyme présente dans la levure de boulangerie en quantité assez importante.
Elle est présente sous deux formes :
- une invertase externe (située dans la paroi)
• C'est la forme prédominante
-1
• Sa masse molaire est de l'ordre de 270 000 g.mol constituée de 50 % de protéine et de 50
% de mannane. La partie glucidique n'est pas indispensable à l'activité catalytique, mais elle
augmente la stabilité.
- une invertase interne (vacuole)
• Elle représente un faible pourcentage de l'invertase totale
• Elle a les même caractéristiques cinétiques que l'invertase externe
-1
• Sa masse molaire est de l'ordre de 135 000 g.mol (il n'y a pas de partie glucidique)

L’invertase catalyse l’hydrolyse du saccharose en glucose (-D-Glucopyranose) et en Fructose (-

D-Fructofuranose). Elle entraîne ainsi une inversion du pouvoir rotatoire de la solution d’où le
nom d’invertase. La solution de saccharose est dextrogyre alors que le mélange (Glucose +
Fructose) est lévogyre.

Saccharose D-Glucopyranose D-Fructofuranose

(-D-Glucopyranosyl (12) Sucres réducteurs
-D-Fructofuranoside)
Sucre non réducteur

L'invertase est spécifique du groupement -D-Fructofuranosyl non substitué. Elle présente une
forte affinité pour le saccharose mais hydrolyse néanmoins d’autres Fructofuranosides comme le
raffinose par exemple.
La mesure de l’activité d’hydrolyse du saccharose par l’invertase peut-être effectuée par plusieurs
méthodes utilisant différentes techniques, par exemple :
- La polarimétrie : en suivant la variation du pouvoir rotatoire de la solution à l’aide d’un
polarimètre.
- Le dosage du glucose libéré par des techniques spécifiques.
- Le dosage des sucres réducteurs libérés par la réaction à l’aide de la méthode de dosage
colorimétrique au 3, 5-dinitrosalicylate (DNS).

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 2. Principe du dosage colorimétrique par le DNS
En milieu alcalin et à chaud, le fructose et le glucose réduisent l'acide 3-5 dinitrosalicylique (jaune)
en acide 3-amino-5-nitrosalicylique (rouge orange) dosable par colorimétrie à 540 nm. Le glucose
et le fructose quant à eux, sont oxydés en divers produits d’oxydation.

Acide 3,5-Dinitrosalicylique Acide 3-amino, 5-nitrosalicylique

(Jaune) (Orange-jaune)

L'hydrolyse du saccharose (sucre non-réducteur) libère deux sucres réducteurs (le glucose et le
fructose). En incubant la solution du saccharose avec le DNS, les deux sucres réducteurs produits
vont le réduire et libérer un produit qui absorbe la lumière à 540 nm. Cette absorbance est donc
proportionnelle à la quantité de glucose et fructose libérée et par conséquent proportionnelle à la
quantité de saccharose hydrolysé.

C- Partie expérimentale

1. Matériel et réactifs disponibles pour le TP

* Spectrophotomètres
* Centrifugeuse de paillasse
* Bain-marie bouillant (réglé à 100°C)
* Bain-marie de paillasse réglé à 30°C
* Vortex pour agiter les tubes
* 2 mortiers pour broyer la levure
* Sable fin
* Levure de boulanger (15 g ).
* Tampon d'extraction : Tampon citrate de Na 50 mM pH 6 avec -mercaptoéthanol 10 mM
* Tampon de réaction : Tampon Acétate de Na 50 mM à pH 4,7
* Solutions stock de saccharose à 0,3 M et 0,6 M.
* Réactif au 3-5 Dinitrosalicylate (DNS) solution déjà préparée :
- 5 g de DNS dans 100 ml de soude (NaOH) 2M
- 150 g de tartrate double de Na et K dans 300 ml d’eau
- Les deux solutions sont mélangées et complétées à 500 ml avec de l’eau distillée
* 4 tubes à centrifuger avc couvercle
* Tubes à essais en verre
* Pipettes automatiques de 1 ml
* Pipettes en verre de 1 ml, 5 ml et 10 ml
* Eprouvettes et béchers.

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 2. Extraction de l’invertase et préparation de la solution enzymatique pour
les tests cinétiques

Mode opératoire :
Broyer très finement pendant 5 min au mortier 15 g de levure de boulanger et une cuillère de sable
très fin avec 15 ml de tampon d’extraction : citrate de Na (10 mM, pH 6,0) + -mercaptoéthanol
(10 mM). Ajouter ensuite 14 ml du même tampon d’extraction et 1 ml de triton (détergent).
Transvaser le contenu du mortier dans un tube à centrifuger, bien boucher le tube et agiter
vigoureusement au vortex pour permettre au triton de bien solubiliser les lipides membranaires et
libérer l’invertase.
Centrifuger 15 min à 3000 tours/min. Recueillir le surnageant légèrement ambré dans un autre
tube à centrifuger propre. C’est l’extrait brut d’invertase qui sera par la suite dilué au 1/25 avec de
l’eau distillée dans une fiole jaugé de 25 ml, pour être utilisé dans les études cinétiques de ce TP.

3. Réalisation de la gamme étalon pour le dosage des sucres réducteurs

Mode opératoire :
On utilisera une solution étalon de saccharose hydrolysé à 10 mM (glucose 10 mM + fructose 10
mM, quantité équimoléculaire de glucose et de fructose).
- Préparer une série de 5 tubes numérotés de 1 à 5 contenants des quantités croissantes à partir de la solution
étalon mère de saccharose hydrolysé à 10 mM : 0 ml (Témoin) ; 0,1 ml; 0,3 ml; 0,5 ml et 1 ml. Compléter
les tubes avec de l'eau distillée pour avoir un volume final de 3 ml dans les 5 tubes
- Rajouter 1ml de DNS dans tous les tubes, agiter au vortex et incuber les tubes dans le bain-marie
bouillant (100° C) pendant 5 minutes.
- Refroidir les tubes dans le bac d’eau froide et rajouter dans chaque tube 10 ml d'eau distillée.
- Après avoir bien homogénéiser les solutions au vortex, mesurer l'absorbance à 540 nm au
spectrophotomètre. Le zéro d'absorbance sera réglé à l'aide de la solution 1 ne contenant pas de
sucres réducteurs. (complétez le tableau ci-dessous)

Tubes 1 2 3 4 5
Volume de la solution étalon de saccharose hydrolysé
0 0,1 0,3 0,5 1
à 10 mM (Glucose 10 mM + Fructose 10 mM) en ml
Eau distillée (qsp 3 ml)
Réactif au DNS (ml) 1 1 1 1 1
Chauffage à 100°C pendant 5 minutes
Refroidissement des tubes dans le bac d’eau froide
Eau distillée (ml) 10 10 10 10 10

Absorbances à 540 nm 0

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- Calculer la quantité de sucres réducteurs en moles dans chaque tube.
- Représenter graphiquement sur papier millimétré l’Absorbance à 540 nm en fonction de la
quantité de sucres réducteurs en moles dans chaque tube et tracer la courbe étalon.
La droite étalon obtenue servira pour déterminer la quantité de saccharose hydrolysé par
l'invertase dans les réactions enzymatiques suivantes.

4. Etude de la cinétique d’hydrolyse du saccharose :

Mode opératoire :
Dans une série de 6 tubes propres numérotés de 6 à 11 (Suivre le tableau ci-dessous) :
- Mettre 1 ml de tampon acétate pH 4,7 et 1 ml de saccharose 0,3 M.
- Dans le tube 6 uniquement (tube servant de témoin), rajouter 1 ml de DNS qui, par son pH très
basique, va empêcher la réaction enzymatique d’avoir lieu. On n’aura donc pas d’hydrolyse de
saccharose même après l’ajout de l’invertase
- Au temps 0, rajouter rapidement 1 ml de l'extrait enzymatique dilué dans les tubes de 6 à 11 et
agiter les au vortex.
- Incuber au bain-marie les tubes 7-11 à 30°C (Garder le tube témoin sur la paillasse).
- Après 2 minutes de réaction, retirer le tube 7 et rajouter 1 ml de DNS et agiter vigoureusement
au vortex pour bien arrêter la réaction. Déposer le tube sur la paillasse et après 4, 6, 8 et 10 minutes
rajouter 1 ml de DNS respectivement dans les tubes 8, 9, 10 et 11 puis agiter vigoureusement.
- A la fin de la cinétique, mettre tous les tubes à 100° C pendant 5 minutes, refroidir et rajouter
dans chaque tube 10 ml d’eau distillée.
Après avoir régler le zéro d'absorbance du spectrophotomètre avec la solution du tube 6 (tube
témoin), mesurer les absorbances à 540 nm des autres tubes de 7 à 11.

Tubes 6 7 8 9 10 11
Saccharose à 0,3 M (ml) 1 1 1 1 1 1
Tampon acétate de Na 0,1 M (ml) 1 1 1 1 1 1
Solution d'invertase au 1/25 (ml) 1 1 1 1 1 1
Temps d’incubation à 30°C (min) 0 2 4 6 8 10
Réactif au DNS (ml) 1 1 1 1 1 1
Chauffage à 100° C pendant 5 min.
Refroidissement des tubes dans le bac d’eau froide
Eau distillée (ml) 10 10 10 10 10 10
Absorbance à 540 nm 0

Détermination de la vitesse initiale de la réaction :

- Rapporter les absorbances obtenues aux différents temps de réaction sur la droite étalon pour
obtenir la quantité de sucres réducteurs (en moles) aux différents temps de réaction.

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- Tracer ensuite la courbe représentant la quantité de sucres réducteurs (en moles) en fonction du
temps de réaction.
- Déterminer à partir de cette courbe la vitesse Vi en moles de sucres réducteurs libérés par min.
- Calculer ensuite la vitesse initiale en moles de saccharose hydrolysé par min (UI).
- Déterminer le nombre d’UI contenu dans 1 ml d’extrait F non dilué.

5. Influence de la concentration en substrat (saccharose) sur la vitesse de

réaction et détermination des paramètres cinétiques Km et Vmax

Mode opératoire:
- Préparer la gamme de concentrations de saccharose suivante: 30 mM, 60 mM, 120 mM, 200 mM,
300 mM et 600 mM. Pour cela, utiliser la solution mère de saccharose à 600 mM. Les volumes
des solutions à préparer doivent varier entre 2ml et 10ml maximum.
- Mettre 1 ml de chacune de ces solutions dans 1 tube propre, les tubes seront numérotés de 12 à
18 dans l'ordre croissant de concentration de saccharose. Dans le tube 12 on mettra 1 ml d'eau
distillée à la place du saccharose (tube témoin).
- Rajouter dans chaque tube 1 ml de tampon acétate pH 4,7.
En suivant le temps, démarrer la réaction enzymatique en rajoutant au niveau de l’ensemble des
tubes, 1 ml de l'extrait enzymatique dilué, en essayant de minimiser au maximum le décalage
entre les tubes. Aller du tube 12 au tube 18.
- Incuber à 30°C pendant 4 minutes, arrêter la réaction en rajoutant 1ml de DNS dans les tubes 12
au 18 pour neutraliser le décalage effectué lors du démarrage de la réaction. L'enzyme doit réagir
avec toutes les solutions de saccharose pendant exactement 4 min.

- Après lecture des Absorbances à 540 nm, porter les valeurs trouvées sur la droite étalon pour
déterminer la quantité de sucres réducteurs dans chaque tube en moles. En déduire la quantité de
saccharose hydrolysé en moles.

Tubes 12 13 14 15 16 17
Solutions de saccharose à différentes
0 30 60 120 200 300
concentrations
mM mM mM mM mM mM
(1 ml de chaque solution)
Tampon acétate, pH 4,7 (ml) 1 1 1 1 1 1

Extrait d'invertase dilué au 1/25 (ml) 1 1 1 1 1 1

Incubation au bain marie à 30° C pendant 4 minutes

Réactif au DNS (ml) 1 1 1 1 1 1

Chauffage à 100° C pendat 5 minutes

Refroidissement des tubes dans le bac d’eau froide

Eau distillée (ml) 10 10 10 10 10 10

Absorbances à 540 nm 0

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- Sachant que cette quantité a été hydrolysée pendant 4 min, déterminer la vitesse initiale Vi en
moles de sucres réducteurs par minute pour chaque concentration initiale de substrat.
- Sur un papier millimétré porter ensuite les vitesses initiales Vi en moles/min en fonction de la
concentration en saccharose (en mM) dans le milieu réactionnel.
- Commenter l’allure générale de la courbe.

Remarque : Pour les fortes concentrations en saccharose  300 mM, on peut avoir une inhibition
par excès de substrat. Cette inhibition est surtout causée par la viscosité du milieu. Donc pour la
détermination des paramètres cinétiques Km et Vmax il faut prendre en considération surtout les
points situés avant la Vmax dans la représentation des doubles inverses 1/Vi=f(1/So). A l’aide de
cette représentation déterminez Km et Vmax.

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 D- Exploitation des résultats

Gamme étalon :

Tube n° 1 2 3 4 5
DO à 540 nm
Quantité des sucres réducteurs en µmoles
- Déterminer la quantité des sucres réducteurs en μg dans les tubes 1 à 5
- Donner un exemple de calcul.
- Tracer la courbe « DO = f (sucres réducteurs) ». Cette courbe servira de référence pour
déterminer les quantités de sucres dans les expériences qui suivront.

Cinétique d’hydrolyse du saccharose :

Tube n° 6 7 8 9 10 11
DO
Quantité des sucres réducteurs en µmoles
Temps de reaction enzymatique
- A partir de la gamme étalon, déterminer la quantité de sucres réducteurs en μmoles dans
les tubes 6 à 11. Portez les valeurs directement dans le tableau ci-dessous.
- Sur papier millimétré, ou par une application de traitement de données (Excel par exemple), tracer
la courbe « Quantité de sucres réducteurs en μmoles = f (temps) ». Joindre la courbe au compte
rendu.
- A partir de cette courbe, déterminer la vitesse initiale de la réaction, en μmoles de sucres réducteurs
par minute.
- Déterminer Vi en unités internationales (UI).
- Déterminer le nombre d’UI contenues dans 1 ml d’extrait enzymatique non dilué.

Influence de la concentration en substrat sur la vitesse de réaction et détermination des

paramètres cinétiques Km et Vmax :

Tubes 12 13 14 15 16 17
Concentration finale du substrat dans les 3 ml
0
du milieu réactionnel ([S]o) en mM
DO à 540 nm. 0

Quantité des sucres réducteurs en μmoles.

Quantité de saccharose hydrolysé en μmoles.

Vitesse initiale (Vi) en UI.

1/[S]o en μmoles-1

1/Vi en UI-1

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- Compléter le tableau ci-dessus :
o Pour chaque tube, calculer la valeur de la concentration de saccharose en mM dans
les 3 ml du milieu réactionnel.
o A l’aide de la gamme étalon, déterminer la quantité de sucres réducteurs présents
dans chaque tube.
- Sachant que la réaction d’hydrolyse a eu lieu pendant 4 minutes, déterminer Vi en UI pour
chaque valeur de [S]o
- Tracer la courbe Vi = f([S]o).
- Tracer la courbe 1/Vi = f(1/[S]o).
- Commenter ces 2 courbes et en déduire les valeurs de Km et Vmax.

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