Institut Supérieur de Biotechnologie de Sfax Année Universitaire 2022 - 2023

Université de Sfax

T.D.2 Enzymologie
Exercice 1
Une lactase sert de matériel expérimental. Aux concentrations données de lactose, les vitesses
initiales sont les suivantes :

[lactose] 10-4 mol.L-1 Vi mol.L-1.s-1 pour 1mg d’enzyme

50 2.58 10-6
20 1.72 10-6
10 1.14 10-6
7 0.88 10-6
5 0.68 10-6

1- Déterminer graphiquement les constants de l’équation de Michaelis KM et Vmax

relatives à ce système.
2- La masse molaire de cette lactase est 135 000 g.mol-1 ; calculer l’activité catalytique
molaire (zm) de la préparation exprimée en kat.mol-1.
Exprimer cette activité catalytique molaire en moles de substrat hydrolysé par mole
d’enzyme et par minute.

Exercice 2
Glock et Mac Lean ont suivi l’influence du pH sur la constante de Michaelis de la 6-
phosphogluconate déshydrogénase de foie de rat.
L’activité de la déshydrogénase est suivie au spectrophotomètre à 340 nm en suivant la
réaction du NADP.

[substrat] 104 mol.L-1 A/min

pH 7.6 pH 9.0
0.174 0.074 0.034
0.267 0.085 0.047
0.526 0.098 0.075
1.667 0.114 0.128
4 - 0.167

A quel pH l’enzyme a-t-elle le plus d’affinité pour le substrat, justifier la réponse.

Exercice 3
La pénicilline est hydrolysée par une pénicillinase. La masse moléculaire de cette enzyme est
de 29.6 kDa. La quantité de pénicilline hydrolysée en 1 min dans 10 ml de mélange

1
réactionnel contenant 10-9 g de pénicillinase purifiée a été mesurée pour plusieurs
concentrations initiales en pénicilline (tableau 1).

[pénicilline] 105 M Quantité de pénicilline hydrolysée (x 109 mole)

0.1 0.11
0.3 0.25
0.5 0.34
1.0 0.45
3.0 0.58
5.0 0.61
Tableau 1

1- Ecrire la réaction catalysée par cette enzyme.

2- Déterminer les paramètres cinétiques KM et VM.
3- En faisant l’hypothèse qu’il existe un seul site actif par molécule d’enzyme,
déterminer la constante kcat.

Exercice 4
Une cinétique enzymatique où on mesure des vitesses initiales en fonction de la concentration
en substrat donne les résultats suivants :

Vi µmole.ml-1 .min-1 [S]0 mM

200 1
500 2
660 4
750 6
800 8
830 10
910 20
Déterminer à partir du tableau KM et VM
1- Directement
2- Après avoir tracé vi = f([S]0)
3- Après avoir tracé 1/vi = f(1/[S]0)
4- Conclusions ?

Exercice 5
On a étudié les paramètres cinétiques de la ribonucléase T1 et de trois enzymes obtenus par
mutagenèse dirigée, en utilisant comme substrat un dinucléotide, le pGpC. L’enzyme natif est
caractérisé par une constante de vitesse de vitesse catalytique égale à 75 700 min -1 et une
constante de Michaelis de 0,54 mM. La mutagenèse dirigée a permis de changer l’acide
glutamique situé en position 58 en aspartate (Asp-58), en glutamine (Gln-58) ou en alanine
(Ala-58). Le tableau donne les vitesses d’hydrolyse du substrat, exprimée en µM/min, pour
différentes concentrations de substrat et aux concentrations d’enzymes modifiés indiquées :

2
 [pGpC] (mM)
0,135 0,2 0,33 0,5 1
5,4 nM de Asp-58 7,6 10,1 13,8 17,1 22,3
9 nM de Gln-58 2,35 3,2 4,4 5,5 7,4
9 nM de Ala-58 4,2 5,1 6,2 7 8

Déterminer pour les trois enzymes les valeurs de constantes de vitesse catalytiques et des
constantes de Michaelis.

Exercice 6
L’hydrolyse de phosphate de p-nitrophénol par la phosphatase alcaline a été étudiée en
présence de différentes concentrations de substrat pour pouvoir déterminer les paramètres
cinétiques de cette hydrolyse. On a mesuré par absorbance l’apparition du p-nitrophénol.
Dans les conditions où l’on a travaillé, le coefficient d’extinction molaire du p-nitrophénol est
égal à 18 000 M-1.cm-1 et celui de substrat est nul. Les expériences ont été faites dans un
volume de 1 ml, en présence de 0,08 µg d’enzyme purifiée. Les vitesses initiales sont données
dans le tableau en variation d’absorbance par min.

[S] (µM) 3 5 7 10 15 20 30
V (A/min) 0,0072 0,01 0,012 0,014 0,017 0,018 0,02

1- Déterminer la constante de Michaelis et la vitesse maximale de la réaction (en

µM.min-1).
2- La phosphatase alcaline est un homodimère de masse moléculaire 94 kDa, déterminer
la constante catalytique de la réaction (exprimée par site actif).

Exercice 7
La alactosidase catalyse l’hydrolyse de l’o-nitrophényl-alactoside (ONPG). En présence
d’ions Mg2+, la constante de Michaelis de ce substrat est proche de 0,1 mM. On a cherché à
déterminer la valeur de cette constante en absence d’ions Mg2+. On a suivi l’hydrolyse de
l’ONPG à 373 nm. A cette longueur d’onde, le coefficient d’extinction molaire de l’ONPG est
égal à 350 M-1.cm-1 et celui de l’o-nitrophénol à 2400 M-1.cm-1. Le tableau donne les vitesses
initiales de la réaction, exprimées en variation d’absorbance par min, pour différentes
concentrations d’ONPG :

[ONPG] (mM) 0,138 0,220 0,291 0,560 0,766 1,46

V (A/min) 0,148 0,171 0,234 0,324 0,390 0,493
Déterminer la vitesse maximale de la réaction (en M.min -1). L’absence d’ions Mg2+ modifie-t-
elle la constante de Michaelis de l’ONPG ?