Inhibition de l'activité enzymatique

-Entité (I)  l’activité enzymatique (  la vitesse d’une réaction enzymatique) :

-En se liant à l’enzyme, un inhibiteur peut :

• empêcher la fixation de S au site actif,
• provoquer une déformation du site actif (notamment à l’état de transition) et rendre
l’enzyme moins active (voire inactive) vs S.

-L’affinité de I pour E est traduite par la constante d’inhibition Ki :

• Ki = cte de dissociation de EI en E + I (unité : M),
ki k [E][I]
E + I EI K i  -i  ; unités en Molaire
k-i ki [EI]
• Ki = [I] pour laquelle la moitié des sites enzymatiques est occupée,
• + Ki est petit, + l’affinité de I pour E est grande,
• Inhibiteur « idéal » : forte affinité (Ki petit) pour E et forte sélectivité vs S (Km/Ki
grand).

Exemple :
K mF6P  200 µM
phosphoglucose K m Ki  1000
isomérase (PGI) K 5PAH
i  200 nM

BCM 1502 Cinétique d’inhibition enzymatique Page 1/29

  Nature des inhibiteurs :
-Analogues de S (ou P)
« Mimes » : qui ressemblent à… sans être eux-mêmes transformés
-Analogues de l’ET ou IHE
-Complexants de métaux (EDTA…)
-Structures diverses (généralement trouvés par hasard)

 Conception des inhibiteurs :

-Beaucoup d'inhibiteurs (médicaments) ont été trouvés par hasard !
-Ethnopharmacologie
-Criblage à haut débit (HTS ou High Throughput Screening) de produits naturels ou
synthétiques (chimiothèques…)
-Criblage virtuel (screening « in silico »)
-Conception d’un I vs E ciblée par docking

Inhibition non-compétitive (IC50 = 3 nM) d’une

protéine kinase (CK2) par un composé de type
polyoxométallate (POM).
CK2

© CEA POMs
Chem. Biol., 2008, 15, 683-692

BCM 1502 Cinétique d’inhibition enzymatique Page 2/29

 1.1. Différents types cinétiques d’inhibiteurs d'enzymes
 Inhibiteurs réversibles :
-Liaison non-covalente (ou covalente) peu stable de l’inhibiteur à l’enzyme (complexes
EI, ESI).
-L'inhibition est réversible (peut être levée), i.e. l’enzyme n’est pas irréversiblement
inhibée :
• Inhibiteurs compétitifs
• Inhibiteurs incompétitifs (et inhibition par excès de substrat)
• Inhibiteurs non-compétitifs purs
• Inhibiteurs non-compétitifs mixtes

 Inhibiteurs irréversibles :
-Liaison covalente (ou non-covalente) stable de l’inhibiteur à l’enzyme (complexe E-I)
-Inhibition ne peut pas être levée (inactivation  l’enzyme est irréversiblement inhibée) :
• Marqueurs d'affinité
• Inhibiteurs suicides (ou mécanistiques)
• Cas particulier : inhibiteurs dits à interaction lente et/ou à forte affinité :
inhibition non-covalente mais quasi-irréversible (slow-binding, tight-binding
inhibitors)

BCM 1502 Cinétique d’inhibition enzymatique Page 3/29

 1.2. Intérêts et usages des inhibiteurs d’enzymes
 Recherche fondamental :
-Etudes cinétiques des mécanismes enzymatiques :
• Mode d'interaction d'un inhibiteur ?
• Stoechiométrie et mécanisme de l'inhibition ?
• Effet de l'inhibiteur sur les paramètres cinétiques Km et Vmax (Kmapp, Vmaxapp)
• Efficacité d'un inhibiteur (Ki vs Km)
• Comparaison de l'efficacité de ≠ inhibiteurs sur une cible (comparaison des Ki )
• Comparaison de l'efficacité d’un inhibiteur sur ≠ cibles (comparaison des Ki )

Exemple : Etudes d’inhibition de ribose-5-

phosphate isomérases (Rpi) de type A et B
Ki (mM) Ki (mM)
Inhibiteur SoRpiA MtRpiB
4PEA 0.028 1.7
4PEH 0.029 0.057
R5P (Km) 7.5 2.5
SoRpiA : Rpi d’épinard, type A
MtRpiB : Rpi de Mycobacterium tuberculosis, type B

BCM 1502 Cinétique d’inhibition enzymatique Page 4/29

 -Etudes cristallographiques des enzymes (complexes EI cristallisés) :
• Nature et rôle des résidus du site actif
• Mode de fixation du substrat (→ I analogues de S/P)
• Mode de fixation des intermédiaires réactionnels (→ I analogues de IHE/ET)
• Fonctionnement de l’enzyme (mécanisme)

Complexe EI
RmPGI-5PAA

5PAA

PDB 1G98

Biochemistry 2001, 40, 1560-1566

-Etudes de métabolismes (rôle d’une enzyme dans un processus métabolique)

-Génération d’abzymes (anticorps catalytiques) :

• Enzymes artificielles générées par un organisme en réaction à la présence
d’un antigène (inhibiteur analogue de l’ET appelé « haptène »)

BCM 1502 Cinétique d’inhibition enzymatique Page 5/29

 Applications thérapeutiques :
-Enzymes : cibles de choix
-Utilisation biomédicale des inhibiteurs : bien avant de connaître les enzymes !
-Difficulté : spécificité de l’enzyme inhibée : souvent, les cellules « cibles » et « hôtes »
possèdent les "mêmes" enzymes (→ parasites, cellules cancéreuses…)

-Correction d’un métabolisme défectueux :

• Hypocholestérolémiant (vs excès de cholestérol)
• Antidiabétique (hypoglycémiants)

-Correction d’un "désordre physiologique" :

• Antidépresseurs
• Antiépileptiques
• Antihypertenseurs
• Antihistaminiques (vs effets de l’histamine produite lors de réactions allergiques)
• Antipyrétiques (vs fièvre)
• Analgésiques (vs douleur)
• Antiinflammatoires

BCM 1502 Cinétique d’inhibition enzymatique Page 6/29

 -Destruction d’un organisme pathogène :
• Antiparasitaires (paludisme, trypanosomiases…)
• Antibactériens
• Antifongiques (vs champignons)
• Anticancéreux
• Antiviraux (antirétroviraux) (vs maturation des virus, interaction virus-cible…)

 Environnement :
-Lutte contre les plantes parasitaires, les insectes et les champignons (xylophages…)
• Herbicides
• Insecticides Pesticides (produits phytosanitaires)
• Fongicides

 Armes chimiques (!) :

-Neurotoxiques (gaz Sarin, Tabun) : → I irrév. d’une enzyme du SNC
-Vésicants (gaz Moutarde/Hypérite) : → irritants (peau, yeux, muqueuses…)

F
O P O P N
O O

Sarin Tabun

BCM 1502 Cinétique d’inhibition enzymatique Page 7/29

 1.3. Exemples d’agents thérapeutiques inhibiteurs d’enzymes

Infection par le VIH

AZT Trithérapie (vs résistances)
ddC

Ritonavir

http://www.wellesley.edu/Chemistry/Chem101/hiv/HIV-2.html

-4 cibles dont 2 principales ; d’autres multi-thérapies existent

-résistances vs RT du VIH
BCM 1502 Cinétique d’inhibition enzymatique Page 8/29
 X AZT-TP
Antiviraux (antirétroviraux)
kinases
AZT AZT

P P PO P P PO

Zidovudine® 2’, 3’-dideoxy-cytidine (ddC)

3’-azido-2’, 3’-dideoxy-thymidine (AZT)  ddC-TP :
 AZT-TP : Ic Transcriptase Inverse (VIH)
Ic Transcriptase Inverse (VIH)

P P PO
Ritonavir® H Aciclovir®
N R'
Ic Protéase (VIH) R  Aciclovir-TP :
O Ic ADN Polymérase (Herpes, VZV)
S

BCM 1502 Cinétique d’inhibition enzymatique Page 9/29

 Antibactériens

Pénicilline Triméthoprim® Sulfaméthoxazole®

Iirr Transpeptidase Ic Dihydrofolate Reductase Ic Dihydroptéroate Synthase
(paroi cellulaire bactérienne)
Bactrim®

Autres activités

Méthotrexate® Kétoconazole®
Anticancéreux Antifongique
Ic Dihydrofolate Reductase Ic C14 a-Demethylase à CytP450
(biosynthèse de l’ergostérol de la paroi
cellulaire des champignons)

BCM 1502 Cinétique d’inhibition enzymatique Page 10/29

 Autres activités (suite)

Aspirine Isocarboxazide Allopurinol

Analgégique, antipyrétique, Antidépresseur vs goutte/calculs rénaux
antiinflammatoire Iirr (suicide) Monoamine Ic Xanthine oxydase
Iirr Prostaglandine Synthase Oxidase (biosynthèse acide urique)
(Cyclooxygénase)

Captopril
Antihypertenseur
Ic Enzyme de Conversion Mévinoline
de l’Angiotensine (ACE) Hypocholestérolémiant
Ic Hydroxymethylglutaryl-CoA
reductase

BCM 1502 Cinétique d’inhibition enzymatique Page 11/29

2. Inhibition réversible : généralités et cinétique
2.1. Inhibition compétitive
Fixation réversible exclusive
Différents modèles de l’inhibition compétitive :
A. Modèle classique : S et I ont le même site de fixation

1.

S et I sont en compétition vs site actif

de part leur analogie de structure.

Site actif de la fructose-1,6-

phosphate aldolase d’H. pylori
FBP
Inh

J Biol Chem. 2011 286, 40219-31

BCM 1502 Cinétique d’inhibition enzymatique Page 12/29

 B. Modèles alternatifs : les sites de fixation de S et I sont distincts

2. 4.

L’encombrement stérique de I
empêche la fixation de S Les sites de fixation de S et I
se recouvrent

3. 5.
Régulation allostérique :
La fixation de I induit un
changement de conformation de
l’enzyme qui déforme ou
S et I ont un groupe en commun masque le site de fixation de S
qui se fixe sur un 3ème site (et inversement)
Exemples :
-aspartate transcarbamylase
-glutamine synthétase

"Enzyme Kinetics " I. Segel (1975), Ed. J. Wiley & Sons, Inc.

BCM 1502 Cinétique d’inhibition enzymatique Page 13/29

 Cinétique de l’inhibition compétitive (rappels) :

k1 kcat
E + S ES E + P
k-1
+
I

Ki
• S et I sont en compétition pour leur fixation sur E
(inhibition exclusive)
EI • L’affinité apparente de E  : Kmapp 
• I peut être déplacé par un excès de S : Vmax n’est
pas modifié
[E][S]
Km 
[ES]
[E][I]
Ki  [E]T = [E] + [ES] + [EI] v0 = kcat[ES]
[EI]

BCM 1502 Cinétique d’inhibition enzymatique Page 14/29

 Inhibition compétitive : v0 = f([S])

[S]
[S] soit v 0  Vmax
v 0  Vmax K m  [S]
app

 [I] 
1   K m  [S]  [I] 
 Ki  avec Km
app
 1   K m
 Ki 

Vo

Vmax

[I] > 0
Vmax/2

[S]
Km Kmapp

BCM 1502 Cinétique d’inhibition enzymatique Page 15/29

 Inhibition compétitive : 1/v0 = f(1/[S]) (Lineweaver-Burk)

 [I]  K m
 [I]  pente = 1   oao = ordonnée à l'origine
1   K m  K i  Vmax

1 1 Ki  1
  oao = 1/Vmax
v 0 Vmax Vmax [S]
pente  et oao = cte lorsque [I] 

[I]3 > [I]2 > [I]1

[I]3
1/Vo
[I]2
[I]1

sans inhib.
Km1app/Vmax
+
Km/Vmax
+
1/Vmax ++ +

-1/Km 1/[S]
-1/Km1app

BCM 1502 Cinétique d’inhibition enzymatique Page 16/29

 Inhibition compétitive (Lineweaver-Burk)
représentation secondaire : pente = f([I])

 [I]i  K m
pentei = 1  
K i  Vmax
pour pente = 0, [I] = -Ki


•
•
•
•
-Ki [I]

BCM 1502 Cinétique d’inhibition enzymatique Page 17/29

 Mesure du paramètre IC50
IC50 = conc. d’inhibiteur pour laquelle v0 mesurée (v0I) = 50% vo sans inhibiteur :
IC50 = [I] pour v0I = v0 /2 (mesure réalisée généralement à [S] = Km)

v0I / v0

100%
+
+
50%
+
+
+
+ +
[I]
IC50

Ki
Inhibition compétitive : IC50  [S]  Ki (IC50 = 2 Ki pour [S] = Km)
Km

BCM 1502 Cinétique d’inhibition enzymatique Page 18/29

 2.2. Inhibition incompétitive
Un inhibiteur incompétitif (uncompétitif) ne se fixe que sur le complexe ES (le site de
fixation de I est induit par celle de S) :
L’affinité de E pour S  (induit par la formation de ESI) : Kmapp 
E apparaît moins active (à cause de ESI, inactif) : Vmaxapp 

S
kcat
E S E + P
KS
I ES
Ki
Si [S] >> Km :
[E]T = [ES] + [ESI]
Vmaxapp = kcat([E]T - [ESI])
(< Vmax)
S x
[E]T = [E] + [ES] + [ESI] I
[ES][I] [E][S]
Ki  Km  v0 = kcat[ES] ESI
[ESI] [ES]

BCM 1502 Cinétique d’inhibition enzymatique Page 19/29

 Inhibition incompétitive : v0 = f([S])

Vmax [S] [S]

ν0   soit v 0  Vmax app
K m  [S]
app
[I] K m
1  [S]
K i 1  [I]
Vmax Km
Ki avec Vmax
app
 et Km
app

[I] [I]
1 1
Ki Ki

Inhibition incompétitive : 1/Vo = f(1/[S])

• Lineweaver-Burk nous donne :
[I] [I]3 [I]2 [I]1
1 1/Vo sans inhib.
1 K
Ki 1
  m 
v0 Vmax Vmax [S] +
pente = Km/Vmax
1  [I] K i +
oao  Km/Vmax
Vmax
+
pente = cte et oao  lorsque [I]  +
+ 1/Vmax1app
Ki K m
IC50   Ki 1/Vmax
[S]
-1/Km 1/[S]
(IC50 = 2 Ki pour [S] = Km) -1/Km1app

BCM 1502 Cinétique d’inhibition enzymatique Page 20/29

 2.3. Inhibition non-compétitive pure
• Un inhibiteur non-compétitif peut se fixer sur E et sur ES (mais n’est pas en compétition avec
S pour sa fixation à l’enzyme). Il ne peut être déplacé par augmentation de [S]
• E apparaît moins active (à cause de ESI, inactif) : Vmaxapp 
• L’affinité de E (et EI) pour S n’est pas modifiée : Km n’est pas modifié (I nc pure)

k1 kcat
E + P
k-1
[E][I] [ES][I]
Ki  
[EI] [ESI]
Ki Ki [E][S] [EI][S]
Km  
[ES] [ESI]
[E]T = [E] + [ES] + [EI] + [ESI]
k1
v0 = kcat[ES]
k-1

x
BCM 1502 Cinétique d’inhibition enzymatique Page 21/29
 Inhibition non-compétitive pure : v0 = f([S])
[S]
soit  0  Vmax app
Vmax [S] K m  [S]
0  
[I] K m  [S]
1 Vmax
Ki avec Vmax 
app
[I]
1
Ki

Vo

Vmax

Vmaxapp

[I] > 0
Vmax/2
Si [S] >> Km :
Vmaxapp/2 [E]T = [ES] + [ESI]
Vmaxapp = kcat([E]T - [ESI]) (< Vmax)

[S]
Km
BCM 1502 Cinétique d’inhibition enzymatique Page 22/29
 Inhibition non-compétitive pure : 1/v0 = f(1/[S]) (Lineweaver-Burk)
 [I]  K m
pente = 1  
[I]  [I]   K i  Vmax
1 1   K m
1  [I] K i

1 Ki Ki  1 oao 
 
0 Vmax Vmax [S] Vmax
pente et oao  lorsque [I] 

[I]3 > [I]2 > [I]1

[I]3
1/Vo
[I]2
[I]1

sans inhib.
1/Vmax1app Km/Vmax1app
+
Km/Vmax
1/Vmax +
IC50 = Ki
++ +

-1/Km 1/[S]

BCM 1502 Cinétique d’inhibition enzymatique Page 23/29

 2.4. Inhibition non-compétitive mixte
• Par rapport au cas précédent, dans le cas d’un inhibiteur non-compétitif mixte, les affinités
de E pour I (Ki) et de ES pour I (K’i) sont .
• Il en résulte que les affinités de E pour S (KS) et de EI pour S (K’S) sont également .

k1 kcat
E + S ES E + P
k-1
+ +
I I

Ki K’i
k’1
EI + S
k’-1
ESI x

[E][I] [ES][I]
Ki  K'i 
[EI] [ESI] [E]T = [E] + [ES] + [EI] + [ESI]
[E][S] [EI][S] v0 = kcat[ES]
Km  K' m 
[ES] [ESI]

BCM 1502 Cinétique d’inhibition enzymatique Page 24/29

 Deux cas peuvent être distingués : Dans les deux cas :
• Ki > K’i : Kmapp  • Vmaxapp  (à cause de ESI)
• Ki < K’i : Kmapp 

Inhibition non-compétitive mixte : Vo = f([S])

[S]
0 
Vmax

[S] soit v 0  Vmax app
K m  [S]
app
α' α K  [S]
m
α'
Vmax α
 
app app
avec Vmax et K m Km
[I] [I] α' α'
α  1 α'  1 
Ki K'i

Inhibition non-compétitive mixte : 1/Vo = f(1/[S])

• Lineweaver-Burk nous donne :
 [I]  K m
1 α' α Km 1 pente = 1  
    K i  Vmax
v 0 Vmax Vmax [S]
1  [I] K'i
oao 
Vmax
pente et oao  lorsque [I] 

BCM 1502 Cinétique d’inhibition enzymatique Page 25/29

 Inhibition non-compétitive mixte : 1/v0 = f(1/[S])

Ki < K’i [I]3 > [I]2 > [I]1

[I]3
1/Vo
[I]2
[I]1

a1Km/Vmax
sans inhib.
+
Km/Vmax
+
++ +
a’1/Vmax
-1/Km 1/Vmax 1/[S]
α1
 Km
α'1

BCM 1502 Cinétique d’inhibition enzymatique Page 26/29

 Inhibition non-compétitive mixte : 1/v0 = f(1/[S])

Ki > K’i [I]3 > [I]2 > [I]1

[I]3
1/Vo [I]2
[I]1
sans inhib.

a1Km/Vmax
+
Km/Vmax
+
++ a’1/Vmax

1/Vmax 1/[S]
-1/Km
α1

α'1K m

BCM 1502 Cinétique d’inhibition enzymatique Page 27/29

 Deux modèles alternatifs d’inhibition non-compétitive (mixte)

kcat
E + P
KS
E + P
KS kcat

Ki Ki K’i

K’S

EI peut fixer S (pour donner ESI inactif), ES peut fixer I (pour donner ESI inactif),
mais ES ne peut pas fixer I mais EI ne peut pas fixer S

BCM 1502 Cinétique d’inhibition enzymatique Page 28/29

 Tableau comparatif des inhibitions réversibles

Finalement, les inhibitions compétitive, incompétitive et non-compétitive pure sont des

cas particuliers de l’inhibition non-compétitive mixte :

Inhibition Effet sur Vmax Vmaxapp Effet sur Km Km app

K’i =  compétitive - Vmax  aKm
Ki =  incompétitive  Vmax /a’  Km/a’
Ki = K’i non-compétitive pure  Vmax /a - Km
Ki > K’i non-compétitive mixte  Vmax /a’  aKm/a’
Ki < K’i non-compétitive mixte  Vmax /a’  aKm/a’

[I] [I]
α  1 α'  1 
Ki K'i

Remerciement à Dr. Laurent Salmon, Institut de Chimie Moléculaire et des Matériaux d’Orsay (ICMMO),
Université Paris-Sud 11, 91405 Orsay Cedex, France

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