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TP N°02
Dosage des
protéines totales
plasmatique.
I- Généralités :
Les protéines représentent la plus grande partie des matières solides du plasma. En dehors
du fibrinogène, protéine fibreuse, ce sont toutes des protéines globulaires. Seule la sérum-
albumine est une holoprotéine, toutes les autres étant des hétéroprotéines pouvant
contenir des lipides (lipoprotéines), des métaux (métalloprotéines) et surtout des glucides, la
plupart des protéines plasmatiques sont en effet des glycoprotéines.
Leurs propriétés sont très variables : transporteurs, anticorps, enzymes, agents de pression
oncotique, marqueurs de l'inflammation, marqueurs tumoraux, agents de la coagulation,
facteurs de croissance, etc. Mais il faudra différencier les protéines toujours présentes dans
le plasma, éléments constitutifs de celui-ci et celles, d'origine cellulaire, n'y apparaissant que
transitoirement.
Fonction de transport.
Assurée par l’albumine et de nombreuses globulines relativement spécifiques vis-à-
vis de leur ligand plus ou moins spécifique.
Les globulines sont plus spécifiques dans leur ligand.
1
Rôle dans la coagulation.
Exemple :
- Le fibrinogène : glycoprotéine asymétrique et de grande taille.
- Protéines C,
- Protéines S,
- … etc.
Méthodes colorimétriques
Électrophorèse des protéines
Dosages immunologiques
– Turbidimètriques
– Néphélémètriques
– Immunoenzymologiques
1. Réaction de Biuret
1. 1. Principe :
En milieu alcalin, les ions cuivriques donnent avec les liaisons peptidiques
un complexe de coloration violet-pourpre. L’intensité de la coloration est
proportionnelle à la concentration des protéines. Cette coloration est
mesurée par spectrophotométrie en lumière visible. C’est une méthode
simple, rapide et fiable mais peu sensible.
2. 2. Méthode d’immunodifusion
Méthode d’Oudin ou d’immunodiffusion simple
On incorpore l’anticorps à la gélose dans un tube; à la surface on
dépose l’antigène, celui-ci diffuse.
Le contact antigène-anticorps s’effectue et une ligne de précipitation
s’établit. C’est la première méthode immunologique en milieu solide.
2 3. Méthodes d’immunoélectrophorèse
Définition
L’immunoélectrophorèse, aussi appelée gammaglobuline
électrophorèse ou immunoglobuline électrophorèse est une méthode
mettant en jeu une séparation électrophorétique des protéines dans
un gel d’agarose suivie d’une double diffusion selon une direction
perpendiculaire à l’axe de migration électrophorétique contre un
antisérum. Chaque zone d’équivalence correspondant à un précipité
Ag-Ac se traduit par un arc de précipitation. On peut utiliser des
antisérums globaux reconnaissant toutes les protéines majeures du
sérum ou des antisérums spécifiques.
Principe
Les protéines sériques sont fractionnées par électrophorèse en gel
d’agarose, puis un antisérum est déposé dans une rigole parallèle à
l’axe de migration. Les protéines diffusent dans le gel à partir de leur
zone de migration, les anticorps à partir de la rigole. Des lignes de
précipitations se forment au niveau des zones d’équivalences.
Selon sa migration, sa concentration et sa diffusion dans la gélose, et
selon la spécificité de l’antisérum utilisé chaque protéine donne lieu à
un arc de précipitation dont la forme et la position sont
caractéristique.
Intérêt
L’immunoélectrophorèse est une méthode permettant d’étudier
toutes les protéines, une catégorie de protéines ou une protéine
particulière, si on utilise respectivement un antisérum, un anticorps
spécifique d’un mélange de protéines ou d’une protéine. Elle est
surtout utilisée pour les immunoglobulines. Elle est utilisée dans le
diagnostic des myélomes multiples et dans le diagnostic de
beaucoup de maladies du système immunitaire et dans l’évolution
des réponses thérapeutiques.
Les différentes méthodes utilisées sont :
3. Autres méthodes :
Méthode au BCA (acide bicinchonique) 1970 :
Technique ayant une très bonne limite de détectabilité et facile à
mettre en oeuvre.
1- Rappel :
En milieu alcalin (NaOH), à froid, les ions cuivriques (Cu2+) forment avec les
liaisons peptidiques un complexe de coordination coloré en rose, qui ajouté à la
teinte bleue du réactif donne finalement une coloration pourpre (bleu-violet).
Cette réaction est positive dès que la molécule possède 3 à 4 liaisons peptidique,s
elle est donc utilisable pour les protéines et les polypeptides.
La mesure de l’absorbance se fait à 540 nm après avoir laissé la coloration se
développer 30 min.
La technique tire son nom de la molécule le biuret NH2–CO–NH–CO–NH2 (obtenu
par condensation de 2 molécules d’urée NH2–CO–NH2) qui donne une la
coloration violette.
La technique a été développée par Gornall (1949) qui a laissé son nom au réactif
utilisé pour la colorimétrie.
Iodure de K+ (30mmol/l):
PM= 166g/mol
V= 200ml
M= Z.
Z= 30.10-3*0,2*166 = 0,996 g.
NaOH (0,2N) :
PM= 40g/mol
V=200ml
M= W
W= 0,2*0,2*40 = 1,6 g.
R2 :
Iodure de K+ (30mmol/l) qsp 200ml :
M= 0,996g.
3- Mode opératoire :
Le tableau suivant résume les étapes procédées lors de ce TP :
Remarque :
La concentration de l’étalon [Etalon] = 80 g/l ;
L’échantillon utilisé est le N° 56.
Etal Echantill
on on
Absorbance (D0) 0,21 0,162
3
[ech] = DO (echantiSSon)
* [Etalon].
DO (etaSon)
O,162
[ech] = * 80.
O,213
b- Valeurs normales :
Sang :