1

7- ENZYMOLOGIE
 2
Rappels de cinétique enzymatique

Substrat Produit
A X

Vitesse de la réaction : V = - dA = dX
dt dt

Mesure de la vitesse d’une réaction enzymatique = mesure de la petite

quantité (ou concentration) de substrat qui disparait (ou de produit qui
apparait) au cours d’un petit intervalle de temps

N.B. Nous exprimerons la vitesse en concentration (par ex. µM) / unité de temps (par ex.
par min) dans ce chapitre

=
µmol/L
  Cinétique d’ordre 0 3
 La vitesse est indépendante de la concentration en réactifs.
 Autrement dit, V est une constante (-dA/dt = k).

∞
 Après intégration (‫׬‬0 ), une relation linéaire est obtenue:
A0

A = A0 – kt 100 2

Concentration (µmol/L)
 La pente de la droite = -k 50 1
-k= la pente

k= constante de vitesse

0
0 50 100 150
Temps (min)

k (= la pente) est une constante = à la vitesse de réaction V (concentration/temps)

  Cinétique d’ordre 1 4
 la vitesse de la réaction est directement proportionnelle à la concentration (ou quantité)
du substrat.
 La vitesse de réaction est rapide lorsque la concentration du substrat est élevée; elle se
ralentit lorsque la concentration du substrat diminue
 Courbe exponentielle décroissante

- dA = k x A
120 A0 dt
∞
100 Intégration (‫׬‬0 )
Concentration (µmol/L)

80
Graphe
cartésien: 60

40
A = A0 x e-kt
20

0 1 goutte/sec
0 50 100 150
Temps (min)
2 gouttes/sec
Par exemple:
Entre 0 et 5 min, V = 18 µM/5min soit 3,6 µM/min
Entre 5 et 10 min, V = 15 µM/5 min, soit 3 µM/min 4 gouttes/sec
  Après transformation semi-logarithmique, nous obtenons une droite 5
dont la pente est égale à - k, la constante de vitesse de la réaction

Graphe semi-logarithmique (ln)

A0
100 2

ln A = ln A0 – kt
Concentration (µmol/L)

Concentration -k= la pente

10 1
du substrat, sur (ou log A = log A0 – kt/2.3)
une échelle
logarithmique k a les dimensions de l’inverse de temps
0 (par exemple min-1)
0 50 100 150
Temps (min)

Le temps reste
sur une échelle
linéaire
 6

Analyse des paramètres qui influencent

la vitesse d’une réaction catalysée

1- La concentration d’enzyme
2- La concentration du substrat
3- La présence d’un inhibiteur enzymatique
4- La température
1- Effet de la concentration en enzyme sur la
vitesse de la réaction 7
Dans l’expression simplifiée d’une réaction catalysée par une enzyme:
E = Enzyme S = Substrat P = Produit

k
E + S P

 En général, si la concentration en substrat n’est pas limitante, la vitesse de la

réaction évolue de façon linéaire avec la concentration de l’enzyme:
V = k [E] où [E] est la concentration en enzyme

 N.B. Il y a de nombreuses situations dans lesquelles la relation s’éloigne cependant

de la linéarité (dénaturation de l’enzyme au cours de l’analyse, présence
d’activateurs ou d’inhibiteurs de l’enzyme dans l’échantillon, etc.).
2- Effet de la concentration en substrat sur la 8
vitesse de la réaction

=> Pour simplifier l’analyse: comparaison des vitesses initiales des réactions qui se
déroulent lorsque différentes [S] sont utilisées, tout en gardant [E] constante.

Vitesse initiale (V0)= la vitesse mesurée juste après la mise en contact de l’enzyme et
d’une concentration donnée de son substrat. Nous la désignerons simplement par V dans
les équations suivantes.
Découverte de l’équation de Michaelis et Menten 9
qui caractérise comment V (la vitesse initiale) évolue en fonction de [S]

E = Enzyme S = Substrat P = Produit

k1 à 4= constantes de vitesse des différentes étapes

k1 k3
E + S ES E +P
k2 k4

L’étape la plus lente dans ces processus est la dissociation et transformation du complexe ES en E + P;
C’est l’étape limitante.
La vitesse globale de la réaction de transformation de S en P est égale à la vitesse de
l’étape limitante :
V = k3 [ES]

Cependant, [ES] n’est pas facilement mesurable donc il est nécessaire de trouver une autre façon
d’exprimer ce terme [ES]
Comment l’équation V = k3 [ES] peut-elle être exprimée autrement et de façon à
mettre en évidence la relation entre V et [S]? 10
[ES] dépend des réactions 1,2 et 3

1 3
k1 k3
E + S ES E + P
k2 k4
Vitesse négligeable au début
de l’expérience donc non prise
2 en compte ci-dessous

BILAN des réactions qui impliquent ES :

Vitesse de formation : k1 [E] [S]

Vitesse de dissociation (par libération de S): k2 [ES]
Vitesse de dissociation (par libération de P): k3 [ES]

A l’équilibre : k1 [E] [S] = k2 + k3 [ES]
Vitesse de formation de ES
ce qui s’écrit aussi:
Vitesse « globale »
de dissociation de ES
k1 ([E totale] - [ES]) [S] = (k2 + k3) [ES]
car à tout moment, la concentration totale
d’enzyme [E totale] = [E] + [ES]
et donc [E] = [E totale] - [ES]
 11

Pour rappel, nous cherchons à exprimer [ES] en d’autres termes => réarrangement
mathématique pour isoler ce terme [ES]

[ES] = [E total] [S]

[S] + k2 + k3
= Km= constante de Michaelis-Menten
k1 = rapport des constantes de vitesses (k2 + k3)/k1
 Notez que, si nous regardons uniquement à la première étape de la réaction, nous
analysons l’association/dissociation de deux molécules (E et S) 12
 Rappel du cours précédent:

k1
R (récepteur) + L (ligand) complexe RL
k2
[E] [S] [ES]

KD = la constante de dissociation à l’équilibre ou constante d’affinité (une valeur de KD faible

indique une affinité élevée)
KD est le rapport de k2/k1 (N.B. ces constantes sont souvent appelées k-1 et k+1 dans une « simple » étude de
liaison).
 La constante de Michaelis et Menten (Km) dépend
de l’affinité entre E et S.
 Comme k3 est une valeur faible par rapport à k1
et k2 (k3 =constante de vitesse de l’étape
KD = k2 et Km = k2 + k3 limitante), il est généralement admis que Km est
k1 k1 une mesure de l’affinité entre l’enzyme et le
substrat. C’est une approximation acceptable. N.B.
les unités de Kd et Km sont des unités de
concentration.
Terminons maintenant le développement qui visait à modifier l’équation présentée à la dia 9: 13
V = k3 [ES].
En remplaçant [ES] par l’équation finale de la dia 11, nous obtenons:

V= k3 x [E totale] x [S] N.B. [E totale] et [S] connues par l’expérimentateur.

[S] + Km

= Equation de Michaelis-Menten

et Vmax= k3 x [E totale]
Vmax est obtenue lorsque toutes les enzymes sont
occupées à transformer le substrat.
 k3 x [E totale]
14
V= Vmax x [S]
[S] + Km
L’équation permet de prédire l’évolution de la vitesse initiale de la réaction en fonction de [S].
3 Enseignements à tirer de l’équation de Michaelis-Menten:
(Par ex. [S] = 1000 nM et Km = 1 nM).

1) Lorsque la concentration du substrat est largement supérieure à Km ( [S]>>>>>Km ), la valeur

de Km devient négligeable dans l’équation. V est alors égale à Vmax.

V = Vmax x [S] = Vmax x 1 = Vmax

[S] + Km

- La vitesse maximale est atteinte lorsque toutes les molécules d’enzyme sont occupées à
transformer le substrat. Les molécules de substrat « saturent » les enzymes ([S]>>>>>Km).
- Si [S] est modifiée, la vitesse reste constante et égale à Vmax (du moins tant que [S] reste très
supérieure à km). Dans ces conditions, la réaction se déroule selon une cinétique d’ordre 0.
 V= Vmax x [S] 15
[S] + Km
2) Lorsque [S] est largement inférieure à Km ( [S]<<<<<Km ), la valeur de [S] devient
négligeable au dénominateur par rapport à Km.

V = Vmax x [S] lorsque [S] <<<< Km

Km

- Dans cette équation, nous remarquons que la Vitesse de la réaction est

proportionnelle à la concentration en substrat
- Nous en déduisons que la réaction suit cinétique d’ordre 1 lorsque [S] <<<< Km.
 V = Vmax x [S] 16
[S] + Km
3) Lorsque [S] = Km :
V = Vmax
2

- Ceci met en avant que Km est la concentration en substrat à laquelle la vitesse

de la réaction est égale à la moitié de la vitesse maximale

- Km dépend de l’affinité entre E et S et caractérise l’efficacité catalytique de

l’enzyme.
Le graphe ci-dessous illustre l’évolution de la Vitesse initiale d’une réaction (en ordonnée) en 17
fonction de la concentration en substrat engagée dans cette réaction (abscisse). Les 3 grands
enseignements à tirer de l’équation de Michaelis et Menten sont visualisés sur ce graphe.

Zone linéaire au début du
graphe:
Cinétique d’ordre 1
V est proportionnelle à [S]
lorsque [S] <<<< Km
Par ex., si [S] double, la
Vitesse de la réaction
double également.
Cinétique d’ordre 0:
V=Vmax
Lorsque [S] >>> Km
Par ex., si [S] double (ou
diminue de moitié), la
Vitesse de la réaction
reste égale à Vmax (V0
est constante). Nous
sommes dans la zone du
plateau.
Km

Km est la concentration en substrat à laquelle la vitesse de

la réaction est égale à 50% de Vmax (Vmax/2)
 V= Vmax x [S] 18
[S] + Km
Lorsque les étapes d’une réaction sont nombreuses (avec une multitude de
constante de vitesse k), on appelle kcat la constante de vitesse de l’étape
limitante.
L’équation de Michaelis-Menten s’écrit alors:

V= kcat x [E total] x [S]

[S] + Km
= Vmax
3- Inhibition d’une réaction 19

enzymatique
- Un inhibiteur interfère avec l’activité d’une enzyme => ralentit ou
stoppe la réaction

- Processus réversible ou irréversible

N.B. De nombreux médicaments sont en fait des inhibiteurs enzymatiques. Par exemple, l’Aspirine
inhibe la première enzyme impliquée dans la synthèse des prostaglandines, des molécules qui sont
notamment impliquées dans la nociception.
 20
Inhibition compétitive
Il y a compétition entre S et I (l’inhibiteur)
k1 k3 pour la liaison au niveau du site actif de
l’enzyme car ces deux molécules ont des
structures chimiques proches (mais pas
k2 identiques).

L’enzyme existe en solution, soit sous forme

libre (E), soit sous forme d’un complexe
avec le substrat (ES), soit sous forme d’un
complexe avec l’inhibiteur (EI).
k’2 k’1
Seul le complexe ES mène à la formation
du produit (P).
Les enzymes qui sont occupées par
l’inhibiteur ne participent pas à la
réaction. Par conséquent, la vitesse
globale de la réaction de transformation
de S en P est ralentie en présence de I,
par rapport à la réaction qui se déroule en
absence de l’inhibiteur.
A une concentration relativement faible en En augmentant [S], il est possible de
substrat par rapport à celle de l’inhibiteur, déplacer l’inhibiteur => l’inhibition est
21
les molécules d’inhibiteur prennent la place « surmontable »
des molécules de substrat sur l’enzyme

Substrat
Enzyme

Substrat

Inhibiteur Inhibiteur

Si, lorsque l’inhibiteur est enlevé, il y a retour à la situation basale => l’inhibition est dite
réversible (en cas de liaison covalente de l’inhibiteur sur l’enzyme, le processus est irréversible et insurmontable)
 Les concentrations relatives de S et I, et l’affinité de l’enzyme pour 22
ces deux molécules, déterminent le degré d’inhibition.

K+1 K+1
E + S ES E + I EI
K-1 K-1

A l’équilibre: k+1 [E] [S] = k-1 [ES] A l’équilibre: k+1 [E] [I] = k-1 [EI]

KD = k-1/k+1 = [E] [S] Ki = k-1/k+1 = [E] [I]

[ES] [EI]
KD= constante de dissociation à Ki= constante de dissociation à l’équilibre de
l’équilibre (affinité) l’inhibiteur (constante d’inhibition)

Une KD faible signifie une affinité élevée Une Ki faible signifie une affinité élevée de
de l’enzyme pour le substrat l’enzyme pour l’inhibiteur

En présence de l’inhibiteur compétitif, [ES] diminue vu que l’inhibiteur prend la place du

substrat => KD augmente
 Dans une inhibition compétitive, l’inhibiteur (I) prend la place du substrat (S) sur l’enzyme 23
=> la vitesse globale de la réaction de production de P s’en trouve ralentie.

Sans inhibiteur : V= Vmax x [S] Equation de Michaelis-Menten

[S] + Km

Avec inhibiteur: Vi= Vmax x [S] Equation de Michaelis-Menten modifiée pour

[S] + K’m prendre en considération l’impact de
l’inhibiteur compétitif: diminution de l’affinité entre
E et S (KD augmente et donc K’m augmente)

K’m = Km ( 1 + [I] )
Ki
K’m d’autant plus élevée que [I] est élevée et que la constante de dissociation à l’équilibre du complexe
enzyme-inhibiteur Ki est faible (ce qui signifie une affinité élevée entre l’enzyme et l’inhibiteur).
La Vmax de la réaction est inchangée. A concentration élevée de S, l’inhibiteur peut être déplacé de
ses sites de liaison, donc toutes les enzymes peuvent être occupées par S (inhibition surmontable).
Illustration d’une inhibition compétitive réversible et surmontable: 24
Remarquez que K ’m > Km. Le substrat a été déplacé de son site de liaison par l’inhibiteur.
Notez également que Vmax est identique pour les réactions avec et sans inhibiteur.

Sans inhibiteur

Avec inhibiteur compétitif

Inhibition surmontable. Si
[S] suffisamment
augmentée, il est
possible d’atteindre la
vitesse maximale
obtenue en absence
d’inhibiteur. Le substrat
Km K’m « chasse » l’inhibiteur.

Km= [S] à laquelle V = Vmax/2 K’m= [S] à laquelle V = Vmax/2,

en présence de l’inhibiteur
 25
Le degré d’inhibition est déterminé en calculant le rapport des vitesses initiales des réactions
qui se déroulent en absence (V) et en présence de l’inhibiteur (Vi):

Sans inhibiteur : V= Vmax x [S]

[S] + Km

Avec inhibiteur: Vi= Vmax x [S]

[S] + K’m

donc Vi = [S] + Km Chiffre entre 0 et 1. Par ex., un rapport de 0,3 signifie que
la vitesse résiduelle est de 30% par rapport à la situation
V [S] + K’m
sans inhibiteur. Autrement dit, l’inhibition est de 70%.

N.B. Lorsque [S] est très élevée par rapport aux constantes Km et K’m, le rapport Vi/V se rapproche de 1.
Ceci illustre qu’à concentration élevée, le substrat peut déplacer l’inhibiteur de son site de liaison sur
l’enzyme. Il « gagne » la compétition et la vitesse maximale en présence ou en absence d’inhibiteur est
alors identique (Le rapport = 1 donc 0% d’inhibition à concentration très élevée en S).
A faible concentration en substrat, le degré d’inhibition dépend de [I], Km et Ki.
Inhibition non compétitive 26
L’inhibiteur (I) se lie sur un site différent du site
orthostérique c.-à-d. du site de liaison du substrat
k1 k3
Il n’y a pas de compétition entre S et I pour la liaison sur
k2 l’enzyme=> Pas de modification de KD

L’enzyme existe en solution, soit sous forme libre (E), soit

sous forme de complexes: (ES), (EI), ou (ESI). Ce
complexe (ESI) est possible car S et I se lient sur des sites
différents.

E Les enzymes qui sont occupées par l’inhibiteur voient

leur activité catalytique réduite. Plus précisément, c’est

I la constante de vitesse k3 de la réaction de

transformation de S en P (au sein de ES) qui est
diminuée.

Modified from:
N.B. Il est considéré que la constante Km n’est pas
modifiée car la contribution de k3 est minime dans le
rapport k2+K3/k1.
Comme Vmax = k3 x [E totale],
Vmax est diminuée en raison de la diminution de k3 (ou de kcat, la constante correspondant à 27
l’étape limitante si plusieurs étapes).
Km est inchangé (pas de compétition pour la liaison à l’enzyme)

Sans inhibiteur : V= Vmax x [S]

[S] + Km

Avec inhibiteur: Vi= V’max x [S] avec V’max < Vmax

[S] + Km

L’équation suivante permet d’estimer la diminution de la Vitesse maximale en présence de

l’inhibiteur non compétitif:

V’max = Vmax => V’max d’autant plus ralentie que la concentration de

1 + [I] l’inhibiteur est élevée et que son affinité pour l’enzyme
Ki est élevée (reflétée par un Ki faible).
 28
Le degré d’inhibition est calculé tel que décrit précédemment, par le rapport de Vi/V:

Sans inhibiteur : V= Vmax x [S]

[S] + Km

Avec inhibiteur: Vi= V’max x [S]

[S] + Km

donc Vi = V’max
V Vmax

Le degré d’inhibition est indépendant de la concentration en substrat, il dépend seulement

de la valeur de V’max, qui dépend de [I] et Ki

 L’inhibition non-nompétitive est NON surmontable par ajout de plus de

substrat (il n’est pas possible de déplacer l’inhibiteur avec S)
Illustration d’une inhibition non compétitive insurmontable: 29
Remarquez que la constante Km n’est pas modifiée. Le substrat n’est pas déplacé de son site
de liaison par l’inhibiteur. Notez par contre que V’max est diminuée par rapport à Vmax.

Inhibiteur
Vmax
Sans inhibiteur

V’max
Avec inhibiteur non-compétitif
(insurmontable)

Substrat
Km
Km

Même si la concentration de substrat S est augmentée, il ne sera pas possible de « chasser »

l’inhibiteur qui se lie à un site différent
 30

Notez que l’inhibition non compétitive peut être réversible. Enlever

l’inhibiteur du système peut mener à la dissociation de l’inhibiteur
et de l’enzyme s’ils ne sont pas liés de façon covalentes. (Il est
également possible de « chasser » l’inhibiteur de son site de liaison en ajoutant un autre ligand
de haute affinité pour le site de liaison de l’inhibiteur).

Si l’inhibiteur non compétitif forme un complexe « dead-end »

avec l’enzyme (liaison covalente) => irréversible
Inhibition mixte 31

Il existe des inhibiteurs qui agissent à la fois sur Vmax et Km

=> comportement non-compétitif et compétitif

 Régulation allostérique 32
Exemple:
 De petites molécules peuvent jouer
un rôle de modulateur (effecteur)
allostérique:
 Le modulateur se lie à un site de
liaison allostérique sur l’enzyme (c.-à-
d. différent du site de liaison du La présence du modulateur allostérique
substrat)
stabilise l’un ou l’autre état.
 La liaison du modulateur induit une
modification du comportement de
l’enzyme (celle-ci est généralement
une enzyme qui peut exister dans 2
états, par ex. de haute affinité ou de
faible affinité pour le substrat, ou de
niveau d’activité haut/bas)
 Si Km est diminuée ou Vmax
augmentée (ou les deux) =>
modulateur allostérique positif
 Si Km est augmentée ou Vmax =Km « apparent »
diminuée (ou les deux) =>
modulateur allostérique négatif
4- Effet de la température 33

La loi d’Arrhénius nous apprend que le logarithme de la constante

de vitesse d’une réaction (k) évolue inversement avec la
température (donc k est d’autant plus élevée que la température
est élevée)

Q10 = l’augmentation de vitesse qui est observée pour une

augmentation de température de 10°C.
Q10 est proche de 2 pour une réaction enzymatique classique.

Attention, si la température est trop élevée, elle peut perturber la

stabilité de l’enzyme => dénaturation possible