Travaux pratiques de Cytogénétique

Comment réaliser un Caryotype

Pr HARDIZI Houyam
Module de biotechnologie
Université Internationale Abulcasis des sciences de la santé
 Cytogénétique - Historique

▪ 1956 : caryotype humain (46 chromosomes)

▪ 1959 : J. Lejeune : 1ère anomalie décrite : trisomie 21
▪ 1970 : découverte du banding
▪ 1980 : technique des caryotypes en prométaphase (microdélétions)
et collaboration avec la biologie moléculaire (localisation génique)
▪ 1985 : techniques d ’hybridation in situ fluorescente permettant
l’étude des anomalies chromosomiques et la localisation des gènes.
▪ 1990 : RT-PCR, CGH, CGH array
▪ 2000 : Puces à ADN « microarrays, transcriptome,
bioinformatique….
▪ 2010: NGS (Next Generation Sequencing)
2
 Les échelles du génome
• Génome haploïde : 3x109 pb
Cytogénétique
• chromosome 1: 2,5 X 108 pb
• chromosome X : 1,5x 108 pb
• chromosome 21 : 5x107 pb Cytogénétique
• une bande : 1 -2 x107 pb moléculaire
• une sous-bande : 1 à 5x106 pb
• un centimorgan : 1x106 pb Génétique

• YAC : 1x106 à 5x104 pb

• fragment cloné dans un cosmide : 5x104 pb

• gène moyen : 2x104 pb
Génétique
• exon : 0,5 - 1 x103 pb
moléculaire
• nucléotide : 1pb
 Plan
I. Introduction
II. Types de prélèvements
III. Culture cellulaire
IV. Blocage en métaphase
V. Choc hypotonique
VI. Fixation étalement
VII. Techniques de coloration et marquage des chromosomes
VIII. Classement des chromosomes métaphasiques
IX. Avantages et limites
Qu’est ce qu’un chromosome?
 Introduction
• Le caryotype (ou caryogramme) est l'arrangement standard de
de l'ensemble des chromosomes présent dans une
cellule, à partir d'une prise de vue microscopique.

• Les chromosomes sont photographiés et disposés selon un format standard : par paire
et classés par taille, et par position du centromère.

• On réalise des caryotypes dans le but de détecter des aberrations chromosomiques

(telles que la trisomie 21) ou d'identifier certains aspects du génome de l'individu,
comme le sexe (XX ou XY).
• Notons qu'un caryotype se présente sous forme de photographie.
 Introduction
• Chromosomes visibles que pendant une
courte période du cycle cellulaire : la
métaphase ou la prométaphase

• Toutes les techniques visent à obtenir un

maximum de cellules bloquées à ce stade

• Les cellules en multiplication active soit

spontanément soit par une culture (le
plus souvent)
Types de prélèvements
1. Prélèvement sanguin

2. Biopsie ostéomédullaire

3. Biopsie cutanée

4. Liquide amniotique, villosités choriales

5. Prélèvement ganglionnaire ou tumoral

Prélèvements

Cellules à haut index mitotique:

- Cellules du trophoblaste
- Cellules de la moelle sanguine et cellules cancéreuses

Cellules à bas index mitotique:

- Lymphocytes sanguins
- Cellules amniotiques

10
Indications du caryotype
1/Chez le nouveau-né

• Nouveau-né mort-né ou décédant à la naissance.

• Nouveau-né vivant présentant un tableau clinique évocateur d ’une aberration chromosomique.

• Nouveau-né vivant présentant un tableau malformatif ou dysmorphique atypique.

Indications du caryotype
2/ Chez l ’enfant
• Chez le garçon : handicap mental moyen ou profond
• Chez la fille : -retard de croissance
-hernie de la gonade
3/ Chez l ’adolescent
• Anomalies de la puberté
Indications du caryotype
4/ Chez l ’adulte:

• Naissance d ’un enfant présentant une anomalie chromosomique.

• Fausses couches spontanées à répétition.

• Stérilité masculine.

• Ménopause précoce.
 Indications du caryotype
5/ Indication du caryotype en hématologie cancérologie

Le processus cancéreux est très souvent associés à des remaniements

chromosomiques, parfois spécifiques. Exemple: t(9;22) dans la LMC
Intérêt du caryotype
◦ Diagnostique

◦ Pronostique

◦ Thérapeutique

◦ Suivi de l’évolution : disparition du clone sous traitement et/ou

rémission, rechute, acutisation.

Acutisation: transformation d’une maladie de l’état chronique à l’état aigu.

LMC: Leucémie Myéloïde Chronique
Techniques avant obtention de
caryotype

15
Prélèvement sanguin
Protocole :

▪ Prélèvement sur tube hépariné

▪ Mise en culture en flacon Falcon

Culture cellulaire
• Stérilité +++: Travailler sous hotte à flux laminaire
• Milieu de culture : milieu synthétique enrichi en
➢ Héparine
➢ Antibiotiques
➢ Antifungiques.
➢ Sels minéraux
➢ Glucose
➢ Acides aminés
➢ Sérum de veau fœtal.
➢ phytohémaglutinine (stimulation des lymphocytes T)
 Cultures cellulaires
• Le volume de sang à ensemencer dépend de l’âge du patient,

il est différent également chez la femme enceinte.

• Les tubes sont placés horizontalement à l'étuve à 37 C.

• L'incubation a lieu en règle durant 72 h

• Temps de culture variable en fonction du type cellulaire et de la

quantité du matériel biologique.

Arrêt de la culture
• Agent bloquant du fuseau mitotique (colchicine ou sulfate de vinblastine)

• Permet de bloquer les cellules en métaphase (empêchant la progression de la

cellule vers l’anaphase)

• Deux heures avant la fin de la culture, les divisions sont arrêtées par l'addition
dans chaque tube d'une solution de colchicine.
• Les tubes sont remis à l'étuve à 37 C.
20
Choc hypotonique

Indispensable à l ’obtention d ’un étalement

correct des chromosomes

• KCl ou MgCl2

• éclatement des membranes cellulaires et dispersion des

chromosomes
Fixation des préparations
métaphasiques
• Trois fixations avec un mélange éthanol/acide acétique

• On obtient un culot de cellules fixées que l ’on remettra en suspension pour

l ’étape suivante : étalement sur lame

NB: chaque fixation est suivie d’une centrifugation

Etalement des préparations
chromosomiques sur lame

L ’étalement a pour but d ’obtenir des métaphases avec des chromosomes bien
séparés et non réfringents

Faire tomber une ou 2 gouttes de suspension cellulaire sur une lame

Etape dépendante des conditions atmosphériques enceinte thermostable

Etalement des préparations
chromosomiques sur lame
Faire tomber une ou 2 gouttes de suspension cellulaire sur une lame
Etalement des préparations
chromosomiques sur lame

Etape dépendante des

conditions atmosphériques

enceinte thermostable
Coloration et marquage des
chromosomes métaphasiques
1 ) Technique directe
◦ a/Giemsa

permet de:
• compter les chromosomes
• Classer les chromosomes en fonction de la taille et de
l ’index centromérique (IC)
• IC= p/p+q
Lorsque l'on colore des
préparations chromosomiques avec
du Giemsa, les chromosomes
prennent un aspect rose violacé à
peu près homogène sur toute leur
longueur.
On ne peut donc distinguer les
chromosomes les uns des autres
que par leur taille et leur forme.
Coloration et marquage des
chromosomes métaphasiques
On utilise donc des techniques de marquage
particulières qui permettent d'obtenir une coloration
inhomogène des chromosomes par le Giemsa et
l'apparition de bandes.
 Coloration et marquage des
chromosomes métaphasiques
2 ) Techniques de marquages

• Ces techniques son basées sur le principe de la dénaturation de l’ADN par la

chaleur ou les agents chimiques permettant la mise en évidence d’une striation
en bandes transversales

• Puis on colore les lames au Giemsa

Coloration et marquage des
chromosomes métaphasiques
2 ) Technique de marquage
Il existe deux principales techniques de marquage en bandes des chromosomes
(banding), utilisées en routine :
Permet la mise en évidence d’une striation en bandes transversales ( alternance de
bandes sombres et de bandes claires).

➢Bande G
➢Bande R
 Coloration et marquage des
chromosomes métaphasiques
Bande G

• Coloration au Giemsa après dénaturation

à la trypsine
o Avantage : technique rapide
o Inconvénients : les télomères
apparaissent peu colorés
• Technique qui fait partie des méthodes
de marquage les plus employées
actuellement
 Coloration et marquage des
chromosomes métaphasiques
Bandes R

• Coloration au Giemsa après dénaturation

thermique en mileu salin à pH déterminé
résultat en négatif des bandes G
o Avantage : les télomères sont bien colorés
o Inconvénients : technique longue et
dépendante de nombreux paramètres
Comparaison des chromosomes en bandes G (à gauche) et en bandes R (à droite) pour chaque chromosome
 Coloration et marquage des
chromosomes métaphasiques
3/Techniques de marquage complémentaires

Bandes C : cette coloration permet de mettre en évidence l' hétérochromatine constitutive, qui
correspond à des régions non codantes du génome comme les régions centromériques ( mise en
évidence des constriction primaire et secondaire ).
NOR : cette technique consiste en un dépôt de nitrate d'argent qui met en évidence les
organisateurs nucléolaires. Ces structures correspondent aux régions du génome contenant les
gènes qui codent pour les ribosomes( intérêt dans les translocation robertsonienne ) .
Bandes T : une dénaturation thermique poussée ne laisse persister le marquage qu’au niveau des
télomères.
Bandes Q : obtenues après coloration par la moutarde de Quinacrine. Sous UV les chromosomes présentent
des bandes fluorescentes, de même que les bandes G( n’est plus utilisée ).
Coloration NOR :imprégnation argentique
Observation au microscope
• Visualisation des lames au microscope optique

• 20 métaphases au moins sont photographiées et analysées

• Logiciel de saisie d ’image et logiciel d ’analyse

Aperçu au microscope
objectif 10 x
Aperçu au microscope
objectif 100 x
Classement du caryotype
Caryotype humain : 46 chromosomes

Autosomes : 1 au 22
Gonosomes: X et Y

◦ Femme : 46,XX
◦ Homme : 46,XY
 Classement du caryotype
1) Critères de classements :

Plusieurs critères vont permettre de reconnaître et de classer les chromosomes :

• La taille : Par convention, les chromosomes sont classés du plus grand au plus petit.

• L’index centromérique (IC) : c'est-à-dire le rapport entre la taille du bras court et la

taille totale du chromosome (p/p+q)

Classement du caryotype
1) Critères de classement :
L’index centromérique permet de reconnaître trois familles de chromosomes :
chromosomes métacentriques
◦ IC=0.5 (chr 1,3,16,19,20)

chromosomes submétacentriques
◦ IC=0.4 (chr 2,6,7,X,8,9,10,11,12)

chromosomes subtélocentriques
◦ IC=0.2 (chr 4,5,17,18,Y)

chromosomes acrocentriques
◦ IC= 0 (chr 13,14,15,21,22)
 Classement du caryotype
1) Critères de classement :

En fonction de la taille et de la position du centromère,

les chromosomes sont classés en 7 groupes :

Le groupe A : Les grands médians et submédians 1, 2, 3.

Le groupe B : Les grands distaux 4, 5.
Le groupe C : Les médians et submédians moyens 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 et X.
Le groupe D : Les grands acrocentriques 13, 14 et 15
Le groupe E : Les petits submédians 16, 17 et 18.
Le groupe F : Les petits médians 19, 20.
Le groupe G : Les petits acrocentriques 21, 22 et Y.
Classement du caryotype
1) Critères de classement :
• Fonction de leur taille

• de leur index centromérique

• la reconnaissance après marquage de chaque chromosome : nombre et

répartition des bandes spécifique à chaque paire chromosomique

• Nomenclature internationale définit pour chaque chromosome des régions

chromosomiques qui comporte des bandes et des sous-bandes
50
Avantages et limites

Avantages :

• Vision globale des anomalies génétiques,

• Détection des anomalies chromosomiques numériques et structurales,

• Précision du caractère complexe ou non des anomalies.

Avantages et limites
Limites :

• Nécessité quasi absolue de travailler sur un échantillon fraichement prélevé

• Technique longue et relativement peu sensible

• Résolution de l’ordre de 10 millions de paires de bases

Avantages et limites
Limites :

• Problèmes de résolution :

– anomalies parfois non visibles, de taille inférieure au seuil de

résolution de la cytogénétique

– mauvaise qualité des métaphases obtenues

Que doit on chercher sur un caryotype?
Que doit on chercher sur un caryotype
• Anomalie de nombre
Que doit on chercher sur un caryotype
• Anomalie de nombre: exemples
• Anomalie des autosomes: Trisomie 21, 13, 18
• Anomalie des gonosomes:
o Syndrome de Turner 45,X
o Syndrome de Klinefelter 47,XXY
o XXX , XXXX, XYY
• Triploïdie 69,XXX
• Tétraploïdie 92,XXXX
Que doit on chercher sur un caryotype
• Anomalie de structure:
• Concernant un seul chromosome
o Inversion péricentrique, paracentrique
o Délétion intercalaire, terminale
o Anneau
o Isohromosome
• Concernant deux chromosomes
o Translocation robertsonienne
o Translocation réciproque
Que doit on chercher sur un caryotype
• Anomalie de structure: exemple
• une translocation t(9;22)
• présente dans la leucémie myéloïde chronique
• sujet à une thérapie ciblée.
Leucémie myéloïde chronique
• Chez les patients atteints de leucémie myéloïde chronique, on trouve dans 95 % des cas une

translocation réciproque entre le chromosome 9 et le chromosome 22.

• Le point de cassure sur le chromosome 22 (chromosome Philadelphie) génère un oncogène

qui stimule la prolifération incontrôlée de leucocytes, ce qui conduit à une leucémie

myéloïde chronique.
Un peu de lecture

• La leucémie myéloïde chronique (LMC) qui conduit à une

prolifération incontrôlée des leucocytes est le résultat

d'une anomalie des cellules myéloïdes dans la moelle

osseuse.

• La cause de cette anomalie est une translocation

récipoque entre le chromosome 9 et le chromosome 22

(translocation Ph).
 Un peu de lecture

La leucémie myéloïde chronique (LMC) qui conduit à une prolifération incontrôlée

des leucocytes est le résultat d'une anomalie des cellules myéloïdes dans la
moelle osseuse. La cause de cette anomalie est une translocation récipoque
entre le chromosome 9 et le chromosome 22 (translocation Ph).

Cette translocation amène à la formation du chromosome Philadelphie. Le nom

vient de la ville de Philadelphie (PA, USA), où le chromosome réarrangé
responsable de la maladie fut décrit pour la première fois. La formation du
chromosome de Philadelphie implique qu'une grande partie du bras q (bras long)
du chromosome 22 est transloqué sur le bras du chromosome 9, tandis qu'une
petite partie du bras long du chromosome 9 est transférée sur le chromosome 22.
Le petit chromosome 22 (22q-) résultant = chromosome Philadelphie peut être
mis en évidence par un caryotype.
 Un peu de lecture

1. Une cassure a lieu dans le gène abl sur le chromosome 9 et une

autre cassure dans le gène bcr sur le chromosome 22. Le gène abl
est un proto-oncogène.

2. La translocation (translocation Ph) provoque la fusion de ces

deux gènes bcr/abl. Par sa fusion avec un autre gène le proto-
oncogène abl est alors transformé en oncogène.

3. Par conséquent un nouvel ARNm est produit: bcr/abl-ARNm.

4. Une protéine de fusion bcr/abl est ainsi synthétisée et a alors
une activité tyrosine kinase en dessus de la normale qui stimule
une surprolifération d'un clone de cellules de la moelle osseuse
précurseur des cellules du sang.
Comment décrire une anomalie ou
l’emplacement d’un point de cassure
66
 21 q 22.1
N°chromosome région: 1 - 4
bras bande
sous-bande 67
Nomenclature
ISCN
 Nomenclature
ISCN
➢Les régions, bandes et sous-bandes sont
numérotées en partant du centromère

➢le centromère est désigné par 10:

✓ p10 pour la partie dirigée vers le bras court
✓ q10 pour la partie dirigée vers le bras long
 Nomenclature
ISCN
Désignation d’un point
Chr 1 bras court région 3 bande 6 sous-bande 3

1p36.3
4 items sont requis :
• no du chromosome
• symbole du bras
• no de la région
• no de la bande

(le numéro de la bande et celui de la sous-bande

sont séparés par un point)
Comment décrire une anomalie ou
l’emplacement d’un point de cassure
• Patient de sexe masculin présentant une trisomie 21: 47, XY, +21

• Patiente de sexe féminin présentant un syndrome de Turner: 45, X

• Patient de sexe masculin présentant un syndrome de Klinefelter: 47, XXY

• Patient présentant une translocation robertsonienne en chromosome 13 et

chromosome 14: 45, XY, t(13;14).
 ANOMALIES DE STRUCTURE
Deux chromosomes
t robertsonniennes (rob ou der)
perte

recollement

rob(13;14)(q10;q10)
ou
der(13;14)(q10;q10)
phénotype normal mais conséquences méiotiques
t(13, 14)
ANOMALIES DE NOMBRE

Non disjonction méiotique

aneuploïdie homogène
Méiose:

Phénomène mitotique particulier qui ne se réalise que

dans les cellules germinales existant dans les gonades
(ovaires et testicules).

Méiose est un phénomène de réduction de la diploidie

2n →n

Phénomène indispensable et préalable à la fécondation

(n’+n ’’→2n)
non disjonction
méiotique MI

MI

MII
non disjonction
méiotique MII

MI

MII
ANOMALIES DE NOMBRE

Non disjonction mitotique

aneuploïdie en mosaïque
Mitose:

Étape de la division cellulaire en 2 cellules

filles.

Permet la multiplication cellulaire par

division binaire des cellules chez les
eucaryotes.
 non disjonction
mitotique postzygotique

mosaïque
 Anomalies de la méiose

Monosomie
Trisomie Monosomie

Fécondation
 Anomalies chromosomiques
en mosaïque: non disjonction post zygotique

Cellule embryonnaire,
fœtale …

Mosaïque
Exercice 1

Veuillez décrire
l’emplacement du point de
cassure indiqué
7q31.3
 Exercice 2
Chez un nouveau né, on réalise un caryotype.
La formule chromosomique est la suivante: 46,XX; 47,XX,+21
1. De quel type d’anomalie s’agit -il?
2. A quel stade de division cellulaire a eu lieu l’anomalie? Veuillez justifier
votre réponse.
 Exercice 3
Un couple se présente pour des fausses couches à répétition.
1. Quelle est la conduite à tenir.
 Exercice 3
Un couple se présente pour des fausses couches à répétition.
Résultat du caryotype montre les formules suivantes:
Madame : 46,XX
Monsieur: 45,XY,t(13,14)
 Exercice 3
Un couple se présente pour des fausses couches à répétition.
Résultat du caryotype montre les formules suivantes:
Madame : 46,XX
Monsieur: 45,XY,t(13,14)
Avez-vous une réponse à la problématique du couple? Veuillez expliquer
votre réponse par un schéma
t(13, 14)
Je vous remercie.