1. Rsum Le but de lexprience tait dapprendre faire les deux manires de fractionnement cellulaire : soit le diffrentielle ou en gradient de densit.

. Nous avons utilis un morceau de foie de rat que nous avons centrifug en premier lieu plusieurs reprises, nous avons obtenu aprs chaque centrifugation des culots de plus en plus petits. Et en deuxime lieu, nous avons cr un gradient de densit entre la solution A et B et nous avons ajout la fraction C1, par aprs nous avons centrifug pour obtenir 5 couches ou chacune contient les organites de mme densit que le liquide. Notre principale conclusion pour la centrifugation diffrentielle est que le culot qui est plus lourd se sdimente au fond de lprouvette et le lysat reste en haut. Dans le cas de la centrifugation en fonction du gradient de densit est que chaque phase contient des particules qui ont la mme densit que la phase liquide. 2. Introduction: Dans ce laboratoire, nous avons abord le fractionnement cellulaire par centrifugation diffrentielle. Cela consiste sparer des constituants de leur cellule grce lhomognisation ou en dchiquetant la membrane cellulaire avec des produits chimiques ou en utilisant une force physique. Lhomognisation, quant elle, cest une mthode qui se fait des vitesses de plus en plus fortes pour que les fractions soient de plus en plus petites, de moins en moins denses et soient sdimentes. Cest pour cela que nous avons un culot au fond de lprouvette remplie de surnageant. On peut aussi appeler le culot, un surnageant. Le fractionnement cellulaire se fait de deux manires, la premire est la centrifugation diffrentielle ou en milieu homogne, la deuxime est la centrifugation en gradient de densit. Pour la premire mthode, cela consiste effectuer une srie de centrifugation successive vitesse de plus en plus leves. Par aprs, on rcupre le culot et le surnageant, et comme dit prcdemment les particules seront de plus en plus petites et moins denses et elles seront sdimentes au fond de lprouvette. Pour la deuxime

mthode, cela consiste sparer les organelles en fonction de lencombrement seulement si cest faible gradient, et en fonction de la densit si cest fort gradient. Dans cette exprience, nous aurons manipuler un fragment du foie de rat qui sera le tissu duquel nous allons sparer lhomognat du lysat. Pour la centrifugation dans un milieu homogne, nous utiliserons le saccharose isotonique qui servira le bleu de mthylne 0,05% dans du saccharose isotonique servira colorier les constituants de chaque phase du rsultat de la premire et deuxime partie. Pour la centrifugation base sur le gradient de densit, nous utiliserons la solution A qui consiste en un mlange de la solution mre de Percoll 50%(V/V) avec du saccharose 0,25M, la solution mre a une densit de 1,15g/mL. Nous utiliserons aussi une solution B qui consiste en un mlange de la solution-mre de Percoll 70%(V/V) et avec du saccharose 0,25M. La seringue, quant elle, servira faire passer la solution B et dans la solution A sans mlanger les solutions, ainsi nous pourrons effectuer la centrifugation diffrents gradient de densit. Le but exprimental de ce laboratoire est de nous familiariser avec la centrifugation diffrentielle et gradient de densit, de pouvoir diffrencier lhomognat et le lysat et dexaminer les diffrentes phases que cela soir pour la centrifugation diffrentielle ou sur gradient de sucrose.

4. Rsultats
Figure#1. Fraction H (microscopie photonique, grossissement 100X, coloration bleu de mthylne)     Grosses morceaux de tissus, bleu fonc Dbris cellulaires, bleu fonc Vaisseaux sanguines Fond bleu-gri

Figure#2. Fraction C1 (microscopie photonique, grossissement 40X, coloration bleu de mthylne)  Dbris des cellules, bleu fonc  Noyaux

Figure#3. Fraction S1 (microscopie photonique, grossissement 40X, coloration bleu de mthylnes)  Fond bleu claire  Petits granulations bleus et blanc

Figure#4. Fraction C2 (microscopie photonique, grossissement 100X, coloration bleu de mthylnes)  Organelles de petite dimension

Figure #5. Fraction S2 (microscope photonique, grossissement 100X, coloration bleu de mthylne)  Particules de trs petite dimension

Figure #6. Dessin de tube conique aprs la centrifugation en gradient de densit

Figure #7. Fraction a la surface (microscope photonique, grossissement 40X, coloration bleu de mthylne)

Figure#8. Fraction dans la solution A de densit 1.09 g/ml (microscope photonique, grossissement 40X, coloration bleu de mthylne)

Figure# 9. Fraction a linterface entre les solutions A et B (microscopie photonique, grossissement 10X, coloration bleu de mthylne

Figure #10. Fraction dans la solution B de densit 1.11 g/ml (microscope photonique, grossissement 40X, coloration bleu de mthylne)  Bande transparente

Figure#11. Fraction du culot (microscope photonique, grossissement 100X, coloration bleu de mthylne)

5. Discussion
5.1. Centrifugation en milieu homogne Le broyat de foi de rat obtenu dans un milieu de saccharose isotonique glac (0.25M), contenait des organes cellulaires, des particules et des gros morceaux de tissu. Avec une apparence dune soupe, il avait une couleur rose - orange. La sparation des particules a t effectue sur la basse de vitesse de sdimentation, en fonction de leurs taille. Aprs le premier lavage de 5 secondes la vitesse maximale, ont t limines les grosses particules qui nont pas t broyes et on obtient une fraction solide, le culot et une partie liquide, le surnageant qui constitue lhomognat H. Le culot est de couleur orange - pche, tandis que le surnageant a la mme couleur, mais plus claire. lobservation au microscope photonique de cette fraction, 100X, avec une coloration de bleu de mthylne 0.05 %, celle-ci prsente des grosses fragmentations colores en bleu fonces, ce qui reprsente selon la littrature, des dbris cellulaires, des morceaux de tissu et de vaisseaux sanguines, mme des noyaux [1] (Figure # 1) Aprs une centrifugation de l`homognat de 10 min la vitesse maximale, a t obtenu le culot C1 et le surnageant S1. Les deux fractions ont gardes la mme couleur de pche comme lhomognat H, mais plus claire. Le culot C1 a prsent des points rouges. Les fractions ont t observes au microscope photonique un grossissement 40X, avec coloration bleu de mthylne. Dans le culot C1 ont t visualis des

granulations bleu fonc qui reprsentent des dbris de cellule, des morceaux de tissus, mais aussi des noyaux, drythrocytes (globules rouges) et dautres organelles. Selon la littrature, cette fraction est enrichie en mitochondries, mais contiennent aussi des lysosomes et de peroxysomes. [1] (Figure #2). Le surnageant S1 a prsent des granulations plus petits et moins fonce, bleus et blancs, sur un fond bleu claire, probablement des organelles qui ne se sont pas encore sdimentes (Figure #3). Aprs la dernire centrifugation de la fraction S1 pendant 30 min une vitesse de 10 000 g, ont t obtenues les fractions C2 et S2. A lobservation un grossissement de 100X, le culot C2 a prsent une rgion des petits points bleus. Selon la littrature, aprs une centrifugation des dizaines des minutes une grande vitesse, est obtenue une fraction solide qui renferme des fragmentes des RE rugueux et lisse, dappareil Golgi, des microsomes [2] (Figure#4). Le surnageant S2 a prsent aussi des petits points bleus, chose qui a dmontr que mme aprs cette dernire tape de centrifugation il existe encore des organelles non-sdimente et donc quon na pas obtenu un "cytosol" claire (Figure#5). Il faut probablement une autre rcupration de surnageant et une autre centrifugation une grande vitesse pendant des heures, pour obtenir un surnageant qui contient la fraction soluble en cytosol [1]. Pour isoler des particules de densit infime ou des macromolcules hydrosolubles, la force centrifuge doit tre comprise entre 100 000 g et 500 000g [2]. A t observe que les fractions obtenues par centrifugation zonale ne sont parfaitement pures, parce que diffrentes particules peuvent avoir la mme vitesse de sdimentation. Cette vitesse est dfinie par le coefficient de sdimentation qui dpende de la taille, de la forme et de la masse de particule. Cest pour cela que par exemple, la zone enrichie en mitochondrie contient aussi des lysosomes et des peroxysomes. On peut calculer la vitesse de rotation (en rpm) pour atteindre une acclration donne (une force centrifuge donne), en connaissant la valeur du rayon du rotor de la centrifugeuse, soit en utilisant une quation mathmatique (1), soit en utilisant des nomographes

 y y y RCF- la force centrifuge relative r - le rayon du rotor (cm) N- la vitesse de rotation (rvolutions per min)

, ou

Pour obtenir une force centrifuge de 8500 g, en sachant que le rayon du rotor de la centrifugeuse est de 10 cm, il faut une vitesse de rotation N de 8500 rev/min

   Le mme rsultat on obtient ci on utilise un nomographe pour la dtermination de la force centrifuge relative qui comprenne trois chelles pour le rayon du rotor, la force centrifuge relative et la vitesse de rotation. Il suffit de tracer une droite qui unit les valeurs connues et on obtient la troisime (mthode dabaque). 5.2. Centrifugation en gradient de densit La fraction C1 a t dpose sur un gradient de densit form dans un tube centrifuger, des couches superpose de solutions de saccharose de moins en moins concentres. Donc avant de la centrifugation on avait au dessus des couches de saccharose, une couche qui reprsente un mlange dorganites. Pendant la centrifugation chaque organite va migrer et va simmobiliser dans la couche de densit gale a la sienne [3] (Figure #6). La foi est un organe trs vascularis, donc il contient aussi des cellules sanguines. Aprs la centrifugation ont t obtenues plusieurs fractions. Chaque fraction a t observe au microscope photonique. A la surface a t obtenue une bande de couleur rouge-brun pale (Figure #7). Il sagit des lymphocytes, des cellules blanches du sang, qui sont des cellules ovodes, nucles, dont le noyau de grande taille denviron 7 m, qui

occupe quasiment tout le corps cellulaire. Selon la littrature la bande de lymphocytes a une densit denviron 1.063 g/ml (1.057 g/ml-1.067 g/ml). La bande suivante (solution A de densit 1.090 g/ml) a une couleur rose pale et visualis au microscope au grossissement 40X, ne montre aucune particule, donc il sagit dune bande de saccharose (Figure #8). A l`interface entre les solutions A et B des densits diffrentes, a t forme une bande de couleur jaune-transparente. Selon la littrature il sagit dune zone qui contient des rythrocytes ou hpatocytes. Les hpatocytes sont des cellules rouges, anucl, de taille plus petite que les globules blanches, mais qui se sparent un niveau de densit de 1.098 g/ml (1.089 g/ml- 1.105 g/ml) (Figure #9). Les globules blancs sont beaucoup moins nombreux dans le sang que les globules rouges; les globules rouges sont 4 5 millions/mm3, tandis que les globules blancs sont 4 8000/mm3. Cest le raison pour laquelle ne prsente la mme densit de sparation. La bande suivante, dans la solution B, de densit de 1.11 g/ml a t transparente ; on suppose quil sagit d`une bande de saccharose (Figure#10). Au fond de lprouvette on a obtenu le culot de couleur rouge fonc. On suppose que sont des morceaux des vaisseaux sanguins qui donnent cette couleur. A lobservation au microscope un grossissement de 40X on a observ des noyaux et dautres organelles (Figure #11). Les mitochondries, les lysosomes et les peroxysomes se sparent aux densits plus grandes que 1.11 g/ml, donc est possible quon retrouve ce type dorganites dans le culot.

6. Conclusion
La centrifugation diffrentielle nous a permis des sparer diffrentes types des composes cellulaires (diffrentes organelles, leucocytes, rythrocytes). Les fractionns cellulaires obtenues par centrifugation en gradient de saccharose sont plus nettes que celles obtenues par centrifugation a la vitesse de sdimentation. La centrifugation est une mthode couramment utilise en laboratoire (biochimie, bactriologie, hmatologie, srologie) pour sparer ou analyser des fractions ou des structures sub-cellulaires, des composantes cellulaires, des macromolcules (des protines), ou encore de purifier des virus. Un exemple d'application est l'tude du trafic

intracellulaire ou la purification des mitochondries qui sont spares des noyaux. Les vitesses et les dures de centrifugation peuvent varier en fonction du type de tissus, du tampon ou d'autres facteurs.

7. Rfrences
[1]. Science exprimentale et connaissance du vivante : la mthode et les concepts par Pierre Vignais et Paulette Vignais, pg 223 [2]. Biologie cellulaire par Marc Maillet, pg 47 [3]. Biologie moleculaire de la cellule Par David Baltimore,Harvey Lodish,Arnold Berk,Collectif,,S. Laurence Zipursky,Laurence-S Zipursky,Paul Matsudaira,James Darnell, pg.166 4 . Protocoles de laboratoire denseignement BIOLOGIE CELLULAIRE session automne 2011, pg.4