Types de séparation par force centrifuge.

1. Centrifugation différentielle. En centrifugation différentielle, la séparation s'effectue

principalement selon la taille des particules. Ce type de séparation est couramment utilisé
pour la récupération de culots et l'obtention de préparations partiellement pures d'organelles
sub-cellulaires et de macromolécules. Pour étudier les organelles sub-cellulaires, il faut
rompre les tissus ou les cellules afin de libérer leur contenu. Ce mélange brut de cellules
fractionnées se nomme homogénat. Pendant la centrifugation d'un homogénat de cellules, les
particules plus grosses sédimentent plus rapidement que les plus petites constituant ainsi la
base de l'obtention de fractions d'organelles brutes par centrifugation différentielle. Un
homogénat de cellules peut être soumis à une série de forces g et de durées croissante afin de
générer des culots d'organelles partiellement purifiées.

Lorsqu'un homogénat de cellules est soumis à une force centrifuge de 1000 x g pendant 10
minutes, des cellules intactes ainsi que des culots de noyaux lourds se déposent au fond du
tube. Le surnageant peut ensuite être soumis à une force de 10 000 x g pendant 20 minutes
afin de précipiter des organelles sub-cellulaires de vitesse intermédiaire comme les
mitochondries, les lysosomes et le microorganismes. Certaines de ces organelles sédimentées
peuvent être obtenues avec une pureté partielle et sont normalement contaminées par d'autres
particules. Un nettoyage répété des culots au moyen d'une suspension dans un solvant
isotonique suivi d'une nouvelle sédimentation peut réussir à éliminer les contaminants de plus
petite taille (Figure 1). L'obtention d'organelles sub-cellulaires partiellement purifiées par
centrifugation différentielle sert d'étape préliminaire à des purifications plus avancées
réalisées au moyen d'autres types de séparation par force centrifuge (séparation par gradient
de densité).
2. Centrifugation par gradient de densité. La centrifugation par gradient de densité est la
méthode indiquée pour la purification d'organelles sub-cellulaires et de macromolécules. Les
gradients de densité peuvent être réalisés en superposant des couches de milieu à gradient, du
sucrose par exemple, dans un tube de façon à ce que la couche la plus lourde se trouve au
fond et la plus légère sur le dessus, en continu ou non. La fraction cellulaire que l'on cherche à
séparer est ensuite placée sur la couche supérieure et centrifugée. La séparation par gradient
de densité peut être classée en deux catégories : 2a. La séparation zonale (taille). et 2b. La
séparation isopycnique (densité).

2a. La séparation zonale (taille)

La séparation zonale se base sur la taille des particules et la masse plutôt que sur la densité
des particules. La figure 2 illustre un procédé de séparation zonale ainsi que les critères
essentiels à sa réussite. Certaines applications courantes comprennent la séparation
d'organelles cellulaires comme les endosomes ainsi que la séparation de protéines, tels les
anticorps. Par exemple, les classes d'anticorps ont toutes des densités très similaires mais des
masses qui diffèrent. Par conséquent, la séparation basée sur la masse réussira à séparer les
différentes classes alors que la séparation basée sur la densité n'y arrivera pas.

Certains types de rotor sont plus appropriés à ce type de séparation que d'autres. Voir les
catégories de rotor (ci-dessous) et le tableau 2.
Critères d'une centrifugation zonale réussie :

 La densité de la solution échantillon doit être inférieure à celle de la portion présentant

la plus faible densité du gradient.
 La densité de la particule échantillon doit être supérieure à celle de la portion
présentant la plus forte densité du gradient.
 La longueur de trajet du gradient doit être suffisante pour permettre la séparation.
 Le facteur temps est aussi important. Si vous effectuez des lots trop longs, la totalité
des particules pourrait sédimenter dans le fond du tube.

2b. Séparation isopycnique

Dans ce type de séparation, une particule de densité spécifique sera entraînée vers le fond
pendant la centrifugation jusqu'au point où la densité de la solution environnante est identique
à celle de la particule. Une fois ce quasi-équilibre atteint, la durée de la centrifugation n'a
aucune influence sur la migration de la particule. Un exemple courant de cette méthode est la
séparation des acides nucléiques dans un gradient CsCl. La figure 3 illustre un procédé de
séparation isopycnique ainsi que les critères essentiels à sa réussite. Différents milieux à
gradient peuvent être utilisés pour les séparations isopycniques. Leurs applications
biologiques apparaissent au tableau 2.

https://www.coleparmer.com/tech-article/centrifugation-basics?tlg=fr-FR
Utilisation

Beaucoup d'expériences en biochimie exigent une ou plusieurs étapes de centrifugation.

La centrifugation est utilisée dans trois principaux domaines :

 la séparation de différentes espèces les unes des autres :

o dans le quotidien : essorage de la salade (ex:essoreuse à salade), essorage
du linge (ex:machine à laver), extraction du jus des fruits et légumes7
o dans l'industrie alimentaire: séparation de la crème du lait (écrémage),
élimination des particules de la bière ou du vin (clarification), extraction des
huiles et des matières grasses (extraction de l'huile d'olive), extraction du miel
(apiculture) ;
o dans les laboratoires : pour récupérer un précipité, pour séparer des éléments
figurés dans le sang (globules rouges, globules blancs, plaquettes en suspension
dans le plasma sanguin),
o séparation de composés cellulaires pour étude biochimique oumoléculaire ;
o dans le domaine du nucléaire : pour enrichir l’uranium avec l'isotope léger
235U ;
 l'analyse chimique:

o centrifugation analytique ;

 la mise en forme des matériaux :

o coulée par centrifugation pour les métaux et le béton ;
o moulage par centrifugation pour les matières plastiques et les matériaux
composites ;
o fabrication de la barbe à papa.

Application à la biochimie

Les centrifugeuses sont couramment utilisées par les laboratoires de biologie, afin de
séparer des cellules,

des protéines, ou encore de purifier des virus.

Fractionnement cellulaire

On utilise fréquemment la centrifugation différentielle pour séparer les composantes

cellulaires.
Évidemment les vitesses exactes et les durées de centrifugation peuvent varier en
fonction du type de tissus,

du tampon ou d'autres facteurs.

Typiquement, on peut sédimenter les noyaux à 1-2000 xg durant 5-10 minutes. Les
mitochondries et les

chloroplastes tombent à environ 10-15000 xg durant 10-15 minutes. Les "microsomes",

petites vésicules

produites lors de l'homogénéisation et la fragmentation des compartiments

membranaires comme le Golgi

ou le réticulum endoplasmique, membrane plasmique. Etc. peuvent sédimenter après

une trentaine de

minutes à 15-30000 xg. Il faut comprendre que les "microsomes" ne sont pas des
particules qui existent en

tant que telles dans une cellule intacte. Ce sont des artefacts de la méthode du bris de la
cellule. Ils

contiennent néanmoins le contenu enzymatique ou autre composante des structures

cellulaires (Golgi,

réticulum) à partir desquelles ils sont formés.

Les ribosomes sont obtenus à 100,000 xg après 1 ou 2 heures. Le surnageant résiduel

contient le matériel

cytosolique. La centrifugation différentielle ne donne que des préparations

grossièrement purifiées.

https://fac.umc.edu.dz/snv/faculte/BA/2020/4Techniques%20de%20s
%C3%A9paration.pdf

Applications médicales

Les centrifugeuses ont de multiples applications dans de nombreux domaines, seule leur
utilisation en

laboratoire de biologie médicale nous intéressera ici. Elles permettent :

 en biochimie: la séparation du plasma ou du sérum sur lesquels seront

pratiqués différents
  dosages, la clarification des urines pour dosages spécifiques, etc.
 en hématologie: la détermination de l’hématocrite, les dosages des facteurs
plasmatiques de la coagulation.
 en immunohématologie: détermination des anticorps irréguliers, des
groupes sanguins, lavage des hématies pour les débarrasser du plasma,
etc.
 en bactériologie: pour la cytologie de liquides de différentes origines,etc.
 en parasitologie: pour des épreuves de concentration des parasites,etc.
 en toxicologie, pharmacologie,etc.: la fréquence d’utilisation des
centrifugeuses est moindre dans ce domaine

https://biologiesansfrontieres.org/wp-content/uploads/2018/04/Fiche-infos-
BSF-Humatem-Centrifugeuse.pdf

photo d’application :

https://microbiologynote.com/types-of-centrifuge/