Techniques D'analyse Physico-Chimique I

Dr Soufiane BOUDJEMAA
Techniques d’Analyse Physico-Chimique I
Introduction
L’analyse chimique est l’ensemble de procédures permettant l’identification (analyse
qualitative pour la détermination de la nature) et la quantification (dosage quantitatif) de la
composition d’un échantillon. L’analyse chimique immédiate est la séparation des corps purs
d’un mélange. Un procédé de séparation est une technique permettant de transformer un
mélange de substances en deux ou plusieurs composants distincts. Ses buts peuvent être
divers ; la purification, la concentration et le fractionnement.
Un mélange peut être sous deux forme, hétérogène lorsqu’ il forme deux ou plusieurs
phases, homogène lorsqu’il forme une seul phase, le premier mélange hétérogène sa
séparation effectue dans un appareillage a décantation, le second mélange homogène nécessite
la mise en œuvre de procédés parfois complexes.
I. Généralités sur les méthodes de séparations
On peut séparer les mélanges hétérogènes par des moyens physiques, il existe plusieurs
techniques de séparation des mélanges. Les techniques les plus utilisées sont : la décantation,
la centrifugation et la filtration.
1. La décantation
Au laboratoire, la décantation est le plus souvent réalisée dans une ampoule à décanter
(décanteurs).
Cette technique n’est pas rapide, pour accélérer le phénomène on peut faire tourner
rapidement le récipient dans lequel se trouve le mélange hétérogène dont on souhaite séparer
les constituants : cette technique s’appelle la centrifugation.
2. La centrifugation
2. 1. Définition
La centrifugation est un procédé de séparation des composés d'un mélange en fonction
de leur différence de densité (de taille et de masse) en les soumettant à une force
centrifuge. Le mélange à séparer peut être constitué soit de deux phases liquides, soit de
particules solides en suspension dans un fluide. L'appareil utilisé est une machine tournante à
grande vitesse appelée centrifugeuse.
Pour un déplacement moléculaire sur une petite distance il est nécessaire d’appliquer des
accélérations beaucoup plus importantes que la force de gravité (g).
L'accélération, (g), provoquée par la rotation est :
 = 2. x = (2n/60)2. x
avec  : vitesse angulaire (rad/s); Figure. La centrifugation

n : nombre de tours par minute (rpm), exprime la vitesse de rotation
x : distance à l'axe de rotation
2. 2. Matériel de centrifugation
La centrifugeuse est l’appareil utilisé pour la centrifugation. La centrifugeuse est constituée
d’un axe de rotation enfermé dans une chambre de centrifugation (Fig ). Les échantillons à
centrifuger doivent être équilibrés deux à deux. Chaque couple doit être placé symétriquement
par rapport à l’axe de rotation.
Figure 8. Centrifugeuse.
2. 3. Types de centrifugation
Il existe deux principaux types de centrifugation.
A) La centrifugation différentielle
Elle se base sur les différences de vitesse de sédimentation entre particules qui diffèrent par
densité et dimensions. Le principe de ce type de centrifugation est de séparer les différents
constituants à l’aide de plusieurs cycles de centrifugation à accélération croissante.
Exemple: Isolement des organites cellulaires. Tout d’abord au cours d’une première
centrifugation, les constituants les plus lourds sont isolés. Puis, en augmentant la vitesse de
sédimentation les constituants de densité croissante seront séparés (Tab1. Fig. 9).
Tableau 1. Conditions de sédimentation de quelques constituants cellulaires.
Constituants cellulaires Conditions de sédimentation
Noyau 10 minutes à 500 g

Mitochondries, lysosomes, peroxysomes 10 minutes à 5000 g
Réticulum endoplasmique, appareil de Golgi 1 heure à 100000 g
B) La centrifugation en gradient de densité

Dans cette méthode, les particules sédimentent au sein d’un gradient de densité. A
l’équilibre, elles se stabilisent dans la zone du gradient où la densité est gale à la siennes.
Figure. Fraction sur gradient de saccharose discontinu.
3. Filtration
La filtration est une méthode mécanique utilisée pour séparer un solide d’un liquide ou
d’un gaz en faisant passer le mélange par une membrane ou un chiffon fin, par l’aide d’un
entonnoir.
Figure. Filtration simple
La phase solide (on l'appelle le résidu) reste dans le filtre.

La phase liquide (on l'appelle le filtrat) traverse le filtre et tombe dans le bécher.
La filtration est un procédé de séparation permettant de séparer les constituants d’un

mélange qui possède une phase liquide et une phase solide au travers d’un milieu poreux
(trous).
Il existe trois types de filtration:

3. 1. Filtration gravimétrique (filtration par gravité)
Dans cette méthode, l’entonnoir de laboratoire équipé d’un papier filtre est utilisé. La
différence de pression est créée par la hauteur du liquide sur le filtre.
Figure. La filtration par gravité.

La filtration gravimétrique présente les inconvénients suivants:
La filtration est lente.

La difficulté de récupération de la phase solide isolée, surtout lorsqu’elle est peu abondante.
La séparation est incomplète: le solide retient une quantité non négligeable de liquide.
3. 2. Filtration sous vide

La vitesse de filtration est augmentée par la création d’une dépression en aval du matériau
filtrant (Fig.). C’est le mode de filtration utilisé d’une manière courante pour les verres frittés
et les membranes filtrantes. Des entonnoirs Büchner spéciaux adaptés sur une fiole à
succion, dans laquelle on crée une dépression, sont utilisés.
Figure. La filtration sous vide.
3. 3. Filtration sous pression

La vitesse de filtration est augmentée en exerçant une pression sur le liquide à filtrer en
amant du matériel filtrant représenté par une membrane filtrante (Fig. 7).
Figure 7. La filtration sous pression.

II. Séparation par rupture de phase

III. Osmose & dialyse

1. Osmose (Phénomène de diffusion)
L’osmose est un phénomène physique de diffusion. L’osmose est un cas particulier de
diffusion liquide, lorsque deux solutions de concentrations différentes sont mises de part et
d'autre d'une membrane "semi-perméable", c'est-à-dire laissant passer le solvant (en général
de l’eau) et non le soluté.
Figure 1. Schéma d’un osmomètre ; une ampoule de verre contenant un soluté (en orange) est
plongée dans un solvant (eau, en vert clair). Une membrane semi-perméable sépare les deux
compartiments ; Le solvant a diffusé au travers de la membrane cellulaire et dilué la solution jusqu'à
ce que la pression hydrostatique de la colonne équilibre la pression osmotique.
Figure 1. Expérience de Dutrochet (1809).
Figure 2. Mise en évidence de la pression osmotique.
Une membrane hémi-perméable (ne laissant passer que le solvant) est nécessaire pour
obtenir le phénomène d’osmose.
π = R .C .T
π = R.C.a
π = R.T. i C
∆T = K c × C (Loi de Raoult)
∆T: Abaissement du poit de congélation
K c : constante cryoscopique du solvant
Pos = R × T × C et ∆T = K c × C
Pression osmtique Pa : Pos = 12.25 × 105 × ∆T

2. Dialyse
IV. Extraction par voie chimique
1. Définitions
L’extraction et la séparation consistent à isoler une ou plusieurs espèces chimiques de leur milieu d’origine.
2. Principe
L’extraction par voie chimique consiste en l’utilisation d’un réactif (minéral dans la plupart
des cas) pour séparer sélectivement un composé d’un mélange.
Soit un composé organosoluble à caractère acide AH insoluble ou très peu soluble dans
l’eau (c’est à dire réagissant avec les bases pour donner un sel) et un composé neutre N
organosoluble (ne réagissant pas avec les bases ni avec les acides) en solution dans un solvant
organique (pratiquement insoluble dans l’eau). L’objet de la manipulation est de séparer ces
deux produits. Pour cela, si, dans une ampoule à décanter, on agite vigoureusement (dans le
but d’augmenter la surface de contact des deux phases) la solution éthérée avec une solution
de soude, il y a réaction selon :
3. Mécanisme
Cela se traduit par le passage de l’acide (sous forme de sel) dans la phase aqueuse. Le
produit neutre reste dissous dans la phase organique non miscible à l’eau. Par simple
séparation de phase, on réalise la séparation chimique de AH et N.
AH (sous la forme de sel Na+ A-) peut être extrait de la phase aqueuse par acidification avec
une solution aqueuse d’HCl (on observe une précipitation de AH)
V. Extraction par un solvant non miscible

1. Définitions
L’extraction liquide-liquide permet d’extraire une substance dissoute dans un solvant, à
l’aide d’un autre solvant, appelé solvant d’extraction, dans lequel elle est plus soluble. Le
solvant initial et le solvant d’extraction ne doivent pas être miscibles.
Considérons un soluté A en solution dans l'eau à extraire par une phase organique non-
miscible à l'eau. Lorsque les deux phases liquides sont en contact il s'établit un équilibre de
partage pour A (figure 1).
Figure. Équilibre de partage d'un soluté A entre deux phases liquides non-miscibles
(aqueuse et organique)
Cet équilibre est caractérisé par une constante thermodynamique Kp appelée le coefficient
de partage : Kp=[Aorg]/[Aaq].
L'extraction sera d'autant plus efficace que le coefficient de partage est grand.
Le choix du solvant répond alors à trois critères :

1) l'espèce à extraire doit y être très soluble (plus soluble dans ce solvant extracteur que dans l’eau) ;
2) le solvant extracteur et l’eau ne sont pas miscibles (ils forment 2 phases)
3) le solvant extracteur ne doit pas réagir chimiquement avec l'espèce à extraire.
2. Mise en œuvre de l'extraction liquide-liquide

Au laboratoire de travaux pratiques, on travaille sur des volumes de solution à extraire de
l'ordre de la centaine de ml au plus. On utilise pour cela des ampoules à décanter (fig. ).
Figure. Protocole d'extraction liquide-liquide à l'aide d'une ampoule à décanter
4. Rendement d'extraction
4.1. Détermination expérimentale
La méthode la plus simple et la plus précise de calculer le rendement d'une extraction
consiste à doser soit la quantité d'espèce passée dans la phase organique, soit la quantité
d'espèce restant dans la phase aqueuse, connaissant la quantité totale d'espèce mise en jeu :
R = qorg = norg / ntotale où R = qorg = (ntotale - naq) / ntotale
qorg : la quantité d'espèce passée dans la phase organique
Le résultat peut être donné en valeur absolue (entre 0 et 1) ou en pourcentage (entre 0 % et 100 %)
4.2. Calcul théorique

Le rendement théorique d'une extraction peut se calculer à partir du coefficient de partage
(Kp) de l'espèce concernée.
La formule de rendement s'obtient à partir de la définition du coefficient de partage :
Kp = Corg / Caq = (norg / Vorg) / (naq / Vaq)

On peut en déduire que : qorg = Kp / (Kp + Vaq / Vorg);
On peut aussi en déduire la quantité d'espèce restant dans la phase aqueuse :qaq = Vaq / (Kp · Vorg+ Vaq),
Sachant que la quantité extraite et la quantité restant dans la phase aqueuse sont liées par la relation :
qaq + qorg = 1
Il est intéressant de réaliser plusieurs extractions successives en fractionnant le volume total
de solvant, on obtient ainsi un rendement supérieur à celui que l'on obtiendrait en réalisant
une seule extraction avec la totalité du volume de solvant :
qorg = 1 - qaq = 1 - (Vaq / (Kp · Vorg + Vaq))n
Où n représente le nombre de cycles d'extractions réalisés
Exemple :
On peut montrer que pour un volume donné de solvant d'extraction, il est plus efficace de
procéder en plusieurs extractions avec des fractions de ce volume qu'en une seule fois.
À titre d'exemple, considérons l'extraction de n0 mole de A en solution dans aqueuse de
volume Vaq par un volume Vorg de solvant organique. La relation

VI. Séparation par changement d’état

1. Rappel de notions générales
1. 1. Les différents états
On distingue pour l’eau et les autres substances trois états différents:
L’état solide, l’état liquide et l’état gazeux:
▸ État solide Par exemple, à température ambiante (autour de 25 °C) et à pression

atmosphérique (autour de 1, 013. 105 Pa), nous pouvons citer: le fer, le verre, les os, la glace.
▸ État liquide Par exemple, à température ambiante et à pression atmosphérique, nous
pouvons citer le lait, le gel douche, l’eau liquide.
▸ État gazeux Par exemple, à température ambiante et à pression atmosphérique, nous
pouvons citer l’air, le gaz de ville, la vapeur d’eau.
1. 2. Les changement d’état
L’eau peu changer d’état selon la température et sous l’action du soleil et du vent Schéma
résumant les différent changements d’état possibles:
Figure 15.
Voici les définitions correspondantes :
 Fusion : passage de l’état solide à l’état liquide.
 Vaporisation : passage de l’état liquide à l’état gazeux.
 Liquéfaction : passage de l’état gazeux à l’état liquide.
 Solidification : passage de l’état liquide à l’état solide.
 Sublimation : passage de l’état solide à l’état gazeux.
 Condensation : passage de l’état gazeux à l’état condensé (solide ou liquide). La cinétique de

ce phénomène est décrite par la relation de Hertz-Knudsen.
2. sublimation
La sublimation est le passage direct d’un état solide à un état gazeux.
Lors d’une sublimation l’agitation des entités chimiques s’accroit brutalement celles-ci
peuvent alors se déplacer librement sans contrainte de contact.
Figure 13. Sublimation
La sublimation peut être représentée par une équation de changement d’état du type:
Espèce chimique (s) → Espèce chimique (g)
Exemple : Sublimation de la glace: H2O(s) → H2O(g)
La sublimation est une transformation physique endothermique, elle se fait en recevant de
l’énergie thermique du milieu extérieur.
Le changement d’état inverse de la sublimation est la condensation
3. Distillations
3. 1. Principe de la distillation
La distillation est un procédé de séparation d’un mélange de substances liquides dont les
températures d'ébullition sont différentes. Elle permet de séparer les constituants d'un
mélange homogène. Sous l'effet de la chaleur ou d'une faible pression (loi des gaz parfaits),
les substances se vaporisent successivement, et la vapeur obtenue est liquéfiée pour donner le
distillat.
La distillation permet de séparer les constituants d'un mélange solide-liquide (S –L) ou

liquide –liquide (L –L).
Il existe deux types de distillation:
- Distillation simple - Distillation fractionnée
3.2. Distillation simple

La séparation se fait grâce à la différence de volatilité (capacité à s’évaporer selon la
température) entre les constituants.
Le bouilleur porte à ébullition le mélange ;
 Les vapeurs du composé le plus volatil montent plus facilement ;
Le condenseur transforme les vapeurs en liquide par condensation ;
Le distillat a une concentration plus élevée en composé le plus volatil.
Figure . Schéma d’une simple distillation

Elle se résume en deux actions :
Chauffer un liquide impur ou un mélange de liquides pour les transformer en vapeurs par ébullition. 
Condenser ensuite les vapeurs par refroidissement et isoler les liquides purs.
Tout dépendra donc des températures d'ébullition des produits. Si les températures ne sont
pas trop élevées (T < 120°C), une distillation sous pression atmosphérique suffit. Par contre,
si la température des composés devient trop importante, il faut recourir à un artifice: diminuer
la pression. En effet, si la pression diminue, la température d'ébullition (Teb) d'un liquide
diminue aussi.
3. 3. Distillation fractionnée
On utilise aussi le terme de rectification. La séparation s’effectue par fractionnement. Le
principe est le même que la distillation simple mais se distingue par l'utilisation d'une colonne
de séparation, qui permet une meilleure discrimination des constituants du mélange.
Lorsque les vapeurs montent dans la colonne leur température diminue (éloignement de la
source chaude). Elles ont tendance à se reliquéfier au contact des pointes de la colonne de
Vigreux.
Le mélange étant devenu plus riche en composé volatil qu’à l’origine, sa température
d’ébullition diminue.
Le mélange entre à nouveau en ébullition et les vapeurs continuent à monter dans la colonne.
La colonne à distillée est le lieu d’un équilibre liquide-vapeur où il y a une succession de
vaporisation liquéfaction. En haut de la colonne le mélange contient beaucoup plus de
composé le plus volatil.
Figure . Schéma d’une simple distillation fractionnée

Remarque : La reliquéfaction peut se faire par différents systèmes : des pointes (Vigreux),
des hélices ou cylindre de verre, des anneaux métalliques ou en plastiques, des tresses
métalliques.
Exemple de traitement d’un mélange :

La technique de distillation permet de séparer un mélange d’alcool et d’eau, l’alcool à une
température d’ébullition plus basse que l’eau alors elle s’évaporera en premier. Les vapeurs
d’alcool seront recueillies et refroidies, cette condensation permettra de récupérer l’alcool

(distillat) dans un autre contenant. L’eau (résidu) restera dans le contenant initial.
3. 4. Le diagramme isobare d’équilibre liquide-vapeur d’un mélange binaire

3. 4. 1. Courbe d’analyse thermique
Lorsque l’on chauffe un mélange d’une certaine proportion de 2 composés miscibles on
obtient une courbe d’analyse thermique.
Figure . Chauffe un mélange de 2 composés miscibles
Lorsque le corps est pur c’est-à-dire que la proportion est de 100% de l’un des composés et
0% de l’autre alors la vaporisation se fait à température constante, ont dit que l’on a un palier
de changement d’état.
Figure . Chauffe un corps est pur
3. 4. 2. Diagramme isobare d’équilibre liquide-vapeur

Lorsque l’on a les courbes d’analyse thermique pour plusieurs proportions (ou fractions
molaires ou titres massiques) de mélange alors on peut construire le diagramme isobare
d’équilibre liquide vapeur.
Figure . Diagramme isobare d’équilibre liquide-vapeur de 2 corps purs X et Y
Les 2 graphes sont côte à côte. On repère sur la courbe d’analyse thermique les cassures
délimitant la phase de changement d’état. On trace les parallèles aux abscisses partant de ces
cassures. On trace la verticale correspondant à la proportion de la courbe d’analyse.
L’intersection basse donne la température d’apparition de la première bulle lors de la
vaporisation. L’intersection haute donne la température d’apparition de la première goutte lors
de la condensation. On recommence pour plusieurs courbes d’analyses thermiques afin de
tracer le diagramme isobare d’équilibre liquide-vapeur du mélange de 2 corps purs X et Y.
Entre les 2 courbes le mélange se trouve dans les 2 états qui coexistent : on a à la fois des
bulles de vapeur et des gouttes de liquide.
La proportion peut être indiquée en fraction ou en pourcentage, qui peuvent représenter :
 La fraction massique (ou titre massique) :

𝑚𝑋 𝑚𝑌
𝑥𝑋𝑚𝑎𝑠𝑠𝑖𝑞𝑢𝑒 = 𝑜𝑢 𝑥𝑌𝑚𝑎𝑠𝑠𝑖𝑞𝑢𝑒 =
𝑚𝑋 + 𝑚𝑌 𝑚𝑋 + 𝑚𝑌
 Ou la fraction molaire :
𝑛𝑋 𝑛𝑌
𝑥𝑋𝑚𝑜𝑙𝑎 𝑖𝑟𝑒 = 𝑜𝑢 𝑥𝑌𝑚𝑜𝑙𝑎𝑖𝑟𝑒 =
𝑛𝑋 + 𝑛𝑌 𝑛𝑋 + 𝑛𝑌
 Relation pour passer de l’une à l’autre :

𝑥𝑋𝑚𝑎𝑠𝑠𝑖𝑞𝑢𝑒
𝑥𝑋𝑚𝑜𝑙𝑎𝑖𝑟𝑒 = 𝑀 𝑀
1 − 𝑀𝑋 × 𝑥𝑋𝑚𝑎𝑠𝑠𝑖𝑞𝑢𝑒 + 𝑀𝑋
𝑌 𝑌
3. 4. 3. Cas de la présence d’un azéotrope

On appelle azéotrope ou mélange azéotropique la fraction molaire ou massique pour
laquelle le mélange se comporte comme une espèce chimique pure (avec un palier).
2 cas à l’azéotrope la température de changement d’état est minimum graphe de gauche ou
passe par un maximum graphe de droite.
Figure 13. Diagramme isobare d’équilibre d’un mélange azéotropique.

VII. Techniques chromatographique

1. Historique
La chromatographie (du grec chroma: couleur et graphein: écrire) a été inventée par le
botaniste Mikhail Tswett dans les années 1900. La première chromatographie a été réalisée
par ce botaniste en 1905. Il a réalisé la séparation de pigments végétaux de la chlorophylle sur
une colonne remplie de carbonate de calcium avec de l’éther de pétrole. Des bandes colorées
qui se déplacent le long de la colonne à des vitesses propres sont obtenues.
Figure 1. Expérience de M.S. TSWETT pour la séparation des composants de la chlorophylle
2. Techniques chromatographique
La chromatographie est une méthode séparative qui permet l’identification et le dosage
des différents composés d’un mélange. Le principe est basé sur les différences d’affinité des
composés du mélange avec la phase stationnaire et la phase mobile.
Le chromatogramme traduit la variation du soluté dans l’éluant en fonction du temps.

Nous avons à retenir avant tout que : Chromatographie = Séparation.
Les méthodes chromatographiques peuvent être classées selon le support de la phase

stationnaire en:
A) Chromatographie sur colonne :
la chromatographie en phase gazeuse (CPG).
la chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC).
Chromatographie sur colonne de silice.

B) Chromatographie sur surface :
la chromatographie sur couche mince (CCM).
Chromatographie sur papier
3. Chromatographie sur Couche Mince (CCM)

La CCM est la plus simple des méthodes chromatographiques. Elle consiste à placer sur
une feuille (papier, silice ou autre….) une tache et de la laisser éluer en la trempant dans un
solvant ou un mélange de solvant (appelé éluant), l’éluant diffuse le long du support. La
tache migre sur la feuille plus ou moins vite selon la nature des interactions qu'elle subit de la
part du support et de l'éluant.
Réalisation de la chromatographie CCM:

Les composés se déplacent donc alternativement de la phase stationnaire à la phase
mobile, l’action de rétention de la phase stationnaire étant principalement contrôlée par des
phénomènes d’absorption.
Les principaux éléments d’une séparation chromatographique sur couche mince sont:
– La cuve chromatographique.
– La phase stationnaire : une couche d’environ 0,25 mm de gel de silice (amidon).
– L’échantillon : environ un microlitre (ml) de solution diluée (2 à 5 %) du mélange à analyser,
déposer en un point repère situé au-dessus de la surface de l’éluant.
– l’éluant (phase mobile): un solvant pur ou un mélange: il migre lentement le long de la plaque
en entraînant les composants de l’échantillon.
Après migration les taches doivent être révélées; c'est la détection qui peut se faire soit :
Pulvérisation d'un réactif caractéristique 
Par immersion dans un bain de permanganate de potassium 
Par pulvérisation de vapeur de diiode 
Par observation à la lumière Ultra-Violet (UV) si la plaque de silice comporte un
indicateur de fluorescence.
Figure . Schéma d’une CCM
Exploitation du chromatogramme
Le chromatogramme correspond à l'aspect de la plaque à l’issue de la chromatographie (voir
Fig.) On détermine, pour chacun des constituants qui ont migré, un rapport frontal 𝐑 𝐟 par :
𝐃
𝐑𝐟 =
𝐝
d : désigne la distance parcourue par la substance (en utilisant le haut de la tache)

D : désigne la distance parcourue par le front de l'éluant (à partir de la ligne des dépôts)
La valeur du 𝐑 𝐟 est caractéristique d'une substance. Elle dépend de la composition de
l'éluant utilisé.
Figure . Aspect de la plaque élution

4. Chromatographie en phase gazeuse (CPG)

La CPG repose sur l’équilibre de partage des analytes entre une phase stationnaire et
une phase mobile gazeuse. La séparation des analytes repose sur la différence d’affinité de
ces composés pour la phase mobile et pour la phase stationnaire.
Le mélange à analyser est vaporisé puis transporté à travers une colonne renfermant une
substance liquide ou solide qui constitue la phase stationnaire. Le transport se fait à l'aide d'un
gaz inerte, appelé gaz vecteur (le plus souvent He ou N2), qui constitue la phase mobile.
Appareillage :
Un appareil de chromatographie en phase gazeuse comporte trois parties: un injecteur, une
colonne et un détecteur, comme indiqué sur le schéma ci-dessous:
Figure : Schéma simplifié du chromatographe en phase gazeuse


5. Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC)

C’est une technique de séparation analytique de molécules présentes dans un mélange.
Les composés à séparer (solutés) sont mis en solution dans un solvant. Ce mélange est
introduit dans la phase mobile liquide (éluant). Suivant la nature des molécules, elles
interagissent plus ou moins avec la phase stationnaire dans un tube appelé colonne
chromatographique.
La phase mobile poussée par une pompe sous haute pression, parcourt le système
chromatographique. C'est ce que l'on a appelé la chromatographie liquide sous haute pression
(HPLC).
Appareillage :
Schéma du principe du fonctionnement du chromatographe en phase liquide haute
performance (HPLC).
Figure 13: Schéma d’un système d’HPLC
6. Grandeurs chromatographiques
6.1 Rapport de distribution K du soluté
Les séparations chromatographiques sont basées sur la répartition des solutés dans deux phases :
Soluté A (phase mobile) ↔ solute A (phase stationnaire)
La constante d'equilibre de cette reaction est appelee: coefficient de partage K

KA = [A]stat / [A]mob
[A]stat = concentration en mol/Ldu solute A dans la phase stationnaire = [A]S
[A]mob = concentration en mol/Ldu solute A dans la phase mobile = [A]M
[A]org = conc. dans la phase organique greffee sur un support.

6.2. Thermodynamique de la chromatographie

Les relations de la thermodynamique s'appliquent aux équilibres de distribution.
soluté A (phase mobile) ↔ solute A (phase stationnaire)
KA = [A]S / [A]M
ΔG° = - RT.ln K
ΔG° = ΔH° - TΔS°
Equation de van't Hoff : dlnK / dT = ΔH° / RT2 permet de calculer l'effet de la

température sur le temps de rétention.
6.3. Temps de rétention du soluté
Fig. Courbe d'élution ou Chromatogramme d'un mélange a 2 constituants
tM : est le temps nécessaire pour qu'une molécule de la phase mobile traverse la colonne.
tR : temps de rétention d'un constituant retenu par la PS.
 t'R= tR-tM = temps de rétention réduit

v = L / tR = vitesse moyenne de déplacement du soluté (L=longueur de la colonne)
u = L / tM = vitesse moyenne des molecules de la phase mobile (cm/s).
v = u.f (fraction de temps passe par le solute dans la phase mobile)
 VM = V0 = volume de la PM dans la colonne = vol. mort.

VM = tM . D
D : est le débit de la phase mobile (flow rate) c'est un volume par unité de temps: cm3/s ou m/.s
u = D / S (S = section de la colonne) (cm3/s /cm2).
 VS = volume de la PS = V (colonne vide) -VM
 VR = volume d'élution ou de rétention du soluté = volume de la PM nécessaire pour
entrainer le soluté jusqu'a la sortie de la colonne = VR = tR . D
 V'R = VR -V0 = volume de rétention réduit du soluté (adjusted retention volume)
6 .4. Facteur de rétention

Un compose de masse mT se repartit en mM dans la phase mobile et mS dans la phase
stationnaire. Leur rapport est indépendant de mT. Il est appelé facteur de rétention (k'A) :
k'A = mS / mM = CS. VS / CM. VM = KA .VS / VM
k'A : facteur de rétention ou facteur de capacité

avec le rapport de phase β = VM /VS : KA = β. k'A
Si k'A =0 le soluté migre aussi vite que le solvant;
si K = ∞ le soluté reste sur la colonne.
On démontre : k'A = (tR - tM ) / tM = t'R/ tM donc KA = β . t'A / tM
si k'A > 20 ou 30; durée d'élution très longue.

En HPLC, la séparation est optimale pour 2 < k' < 10 afin que le temps de passage des
constituants ne soit pas trop long; k' = 5 = valeur "idéale".
6.5. Facteur de sélectivité ou de séparation (α)

α = KB / KA= k'B / k'A= (tR(B) - tM) / (tR (A) - tM ) = t'R(B) / t'R (A)
α = rapport de distribution du constituant B le plus retenu sur le rapport de distribution du
er
constituant A le moins retenu (1 pic).
Le facteur de sélectivité (α) exprime la position relative de 2 pics sur le chromatogramme.
6.6. Courbe de Gauss

Les pics chromatographiques ont une allure gaussienne. L'aire des pics est calculée en
assimilant le pic à un triangle.
Figure. Courbe de Gauss

6. 7. La théorie des plateaux

La théorie des plateaux est utilisée pour expliquer la forme des pics. En 1941, Martin et
Synge ont considère la colonne de chromatographie comme une colonne de distillation,
constituée de « plateaux théoriques ».
Au niveau de chaque plateau, l'équilibre est réalise entre les deux phases. Il y a échange de
matière horizontalement, jusqu'a ce que KA = [A]stat / [A]mob soit atteint. Il n'y a pas
d'échange vertical.
Figure. Les plateaux théoriques dans une colonne chromatographique.
Les pics d'élution peuvent être assimilés à des courbes de Gauss. Les caractéristiques
géométriques de la courbe de Gauss (Fig.1) permettent de calculer, pour un soluté donné, N à
partir du chromatogramme.
N = 16 (tR / l)2
l : largeur du pic à la base
N : nombre de plateaux théoriques de la colonne.
N = 5,54 (tR / ω)2
ω : largeur du pic à mi-hauteur.
Pour comparer entre elles des colonnes de différentes longueurs on définit la hauteur
équivalente à un plateau théorique.
N = L/ H
H : hauteur équivalente à un plateau théorique (HEPT).
L : longueur de la colonne.
En HPLC les HEPT sont comprises entre 0,001 et 1 mm.

L’efficacité des colonnes chromatographiques augmente si le nombre de plateaux
théoriques augmente ou si la HEPT diminue à longueur constante.
6.8. Résolution des pics

La résolution est la grandeur qui caractérise l'aptitude d'un système chromatographique
(colonne, solutés, solvants) à séparer 2 solutés.
Plus la résolution est grande, meilleure est la séparation Deux pics sont bien résolus, si R ≥ 1,5
7. La théorie cinétique
L’équation de Van Deemter (1956) : H = A + B/u + C.u
La courbe représentant l’équation de Van Deemter est donc une hyperbole ou A, B, C sont
des constantes.
u : vitesse moyenne de la phase mobile. u = L/tM
A : diffusion turbulente due aux hétérogénéités dans l'écoulement.
B : facteur de la diffusion moléculaire dans la phase mobile.
C : dépend de la résistance au transfert de masse en phase liquide.
Le tracé de la courbe HEPT en fonction de la vitesse moyenne du gaz vecteur, permet de

déterminer le débit minimum donnant la meilleure efficacité de la colonne.
Figure. Courbe de Van Deemter.

Variation de la hauteur d’un plateau théorique en fonction de la vitesse moyenne de la phase mobile
Aux faibles valeurs de u, le terme B/u prédomine (la courbe devient asymptote à une droite
de pente négative) et explique la perte d’efficacité vers les très faibles vitesses. Aux grandes
vitesses, le terme C.u prédomine (la courbe devient asymptote à une droite de pente positive)
et explique la perte d’efficacité aux très grandes vitesses. Dans la région intermédiaire, le
terme A est prépondérant et H passe par un minimum (Hmin). Elle montre que la variation
de H en fonction de u passe par une valeur minimale calculée en cherchant la valeur de u

correspondant à l’annulation de la dérivée première de cette fonction :
VIII. Techniques électrophorétiques

L’électrophorèse est une technique permettant de déplacer des ions (molécules ayant perdu
leur neutralité électrique) sous l’effet d’un champ électrique. Ceux-ci migrent vers leur électrode
respective: Les anions migrent vers l’anode et les cations migrent vers la cathode.
Appareillage :
L’appareillage usuel est constitué de:
- Un générateur du courant continu stabilisé relié aux électrodes de la cuve. Ce courant crée un
champ électrique qui va permettre de faire migrer les molécules.
- Une cuve d’électrophorèse fermée (horizontale ou verticale) et éventuellement thermostatée
comportant deux compartiments. Chaque compartiment est rempli du tampon de migration.
- Des accessoires comme le support d’électrophorèse, les plaques de verre pour couler le gel et
les peignes pour creuser des puits dans le gel, dans lesquels les composés à analyser seront
déposés.
Figure 14 : Appareillage d’électrophorèse
Exemple d’application
L’électrophorèse des protéines sériques permet la séparation des protéines du sang, sous
l’influence d’un champ électrique. Elle permet de mettre en évidence des protéines anormales et
de détecter une augmentation ou une baisse anormale de protéines dans le sang. L’augmentation
de certaines protéines peut indiquer un syndrome inflammatoire. Cette dernière est réalisée grâce
à un prélèvement sanguin, en général au pli du coude. Le sérum est ensuite déposé sur acétate de
cellulose ou sur gel d’agarose. Les protéines migrent sous l’influence d’un champ électrique de la
cathode vers l’anode.

Techniques D'analyse Physico-Chimique I

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Dr Soufiane BOUDJEMAA

Techniques d’Analyse Physico-Chimique I

I. Généralités sur les méthodes de séparations

avec  : vitesse angulaire (rad/s); Figure. La centrifugation

Constituants cellulaires Conditions de sédimentation

Noyau 10 minutes à 500 g

B) La centrifugation en gradient de densité

Figure. Fraction sur gradient de saccharose discontinu.

Figure. Filtration simple

La phase solide (on l'appelle le résidu) reste dans le filtre.

La filtration est un procédé de séparation permettant de séparer les constituants d’un

Il existe trois types de filtration:

Figure. La filtration par gravité.

La filtration est lente.

3. 2. Filtration sous vide

Figure. La filtration sous vide.

3. 3. Filtration sous pression

Figure 7. La filtration sous pression.

II. Séparation par rupture de phase

III. Osmose & dialyse

Figure 1. Expérience de Dutrochet (1809).

Figure 2. Mise en évidence de la pression osmotique.

Pression osmtique Pa : Pos = 12.25 × 105 × ∆T

IV. Extraction par voie chimique

V. Extraction par un solvant non miscible

Le choix du solvant répond alors à trois critères :

2. Mise en œuvre de l'extraction liquide-liquide

Figure. Protocole d'extraction liquide-liquide à l'aide d'une ampoule à décanter

4.2. Calcul théorique

Kp = Corg / Caq = (norg / Vorg) / (naq / Vaq)

On peut en déduire que : qorg = Kp / (Kp + Vaq / Vorg);

qorg = 1 - qaq = 1 - (Vaq / (Kp · Vorg + Vaq))n

Où n représente le nombre de cycles d'extractions réalisés

À titre d'exemple, considérons l'extraction de n0 mole de A en solution dans aqueuse de

volume Vaq par un volume Vorg de solvant organique. La relation

VI. Séparation par changement d’état

▸ État solide Par exemple, à température ambiante (autour de 25 °C) et à pression

 Condensation : passage de l’état gazeux à l’état condensé (solide ou liquide). La cinétique de

Figure 13. Sublimation

La distillation permet de séparer les constituants d'un mélange solide-liquide (S –L) ou

3.2. Distillation simple

Figure . Schéma d’une simple distillation

Figure . Schéma d’une simple distillation fractionnée

Exemple de traitement d’un mélange :

d’alcool seront recueillies et refroidies, cette condensation permettra de récupérer l’alcool

3. 4. Le diagramme isobare d’équilibre liquide-vapeur d’un mélange binaire

Figure . Chauffe un mélange de 2 composés miscibles

Figure . Chauffe un corps est pur

3. 4. 2. Diagramme isobare d’équilibre liquide-vapeur

Figure . Diagramme isobare d’équilibre liquide-vapeur de 2 corps purs X et Y

 La fraction massique (ou titre massique) :

 Relation pour passer de l’une à l’autre :

3. 4. 3. Cas de la présence d’un azéotrope

Figure 13. Diagramme isobare d’équilibre d’un mélange azéotropique.

VII. Techniques chromatographique

Figure 1. Expérience de M.S. TSWETT pour la séparation des composants de la chlorophylle

Le chromatogramme traduit la variation du soluté dans l’éluant en fonction du temps.

Les méthodes chromatographiques peuvent être classées selon le support de la phase

Chromatographie sur colonne de silice.

3. Chromatographie sur Couche Mince (CCM)

Réalisation de la chromatographie CCM:

Figure . Schéma d’une CCM

d : désigne la distance parcourue par la substance (en utilisant le haut de la tache)