Technique D'analyse

M1 Microbiologie
Technique d’analyse et imagerie moléculaire
LEULMI N.
Partie 1
La matière est soit un corps pur, soit un
mélange.
Les mélanges sont soit hétérogènes, soit homogènes.
On peut séparer les mélanges à l’aide de nombreuses techniques.
La sédimentation, la filtration et la distillation sont les techniques de séparation rapides

les plus répandues.
Définition de la
purification
En chimie, la purification est la séparation de

substances chimiques dans le but de décontaminer des
substances.
Plusieurs moyens de
purification :
1
Définition
La filtration est une méthode mécanique

utilisée pour séparer un solide d’un liquide ou
d’un gaz en faisant passer le mélange par une
membrane ou un chiffon fin, par l’aide d’un
entonnoir,
Principe
La filtration est une séparation selon le

diamètre des particules solides de différentes
tailles, qui sont dispersées dans un liquide. La
différence de pression force le liquide à passer
à travers le filtre alors que les particules solides
restent à la surface.
Filtrat
Les filtres
Filtre
d’épaisseur Filtre
membranaire
L’utilisation de l’un de ces deux types dépend du but de

l’expérience, de la qualité et la quantité du matériel à filtrer.
Ils peuvent être utilisés séparément ou ensemble, selon les
besoins. Les filtres doivent être inerte chimiquement et
physiquement vis-à-vis du liquide à filtrer; insolubles et ne
subissent aucun changement d’état physique
Les filtres
Filtre
d’épaisseur
Ils retiennent les particules dans un réseau de fibres (papier,

amiante, cellulose, coton, fibre de verre, etc.) ou de canalicules
(verre fritté, sable, charbon, etc.).
L’efficacité d’un filtre en profondeur augmente avec son
épaisseur par contre elle diminue lorsque la pression appliquée
sur le filtre augmente,
Les filtres
Filtre
membranaire
Les plus utilisés sont les membranes millipores (Fig. 1). Ils sont
constitués d’une fine lame plastique percée de pores calibrés. Les
membranes filtrantes sont constituées de cellulose, d’acétate de
cellulose, de nitrate de cellulose ou de téflon.
Le diamètre des pores est faible, et varie de 5 à 35 nm pour
l’ultra-filtration et de 0.1 à 8 µm pour la microfiltration.
Les filtres
Filtre
membranaire
**Les membranes de la microfiltration permettent une filtration

rapide, malgré le faible diamètre des pores, cela est dû à leur
faible épaisseur et à la forte densité des pores (1010 pores/cm2
).
**Ces membranes ne sont constituées que par 15 à 35% de leur
volume par de la matière, le reste étant occupé par des pores.
Les filtres
Filtre
membranaire
Probleme de la
filtration
?
Le colmatage
qui est le phénomène qui s’oppose à la
filtration :
La pénétration des particules dans les
interstices [petits espaces vides entre les
parties du filtre] de la matière filtrante
provoque le phénomène du colmatage.
Ceci modifie la porosité et ralentie la
filtration.
L’adsorption
Il résulte de la charge électrique qui

possède la matière filtrante. Ceci induit la
rétention de certains produits par le
filtre malgré que leurs dimensions
permettent leur passage à travers les pores
du filtre.
Les méthodes de filtration
Filtration par
gravité
Dans cette méthode, l’entonnoir de laboratoire équipé d’un

papier filtre est utilis. La différence de pression est créée
par la hauteur du liquide sur le filtre.
Filtration par
gravité
.
Filtration sous
vide
Dans cette méthode, La vitesse de filtration est augmentée

par la création d’une dépression en aval du matériau filtrant
(Fig. ).
C’est le mode de filtration utilisé d’une manière courante
pour les verres frittés et les membranes filtrantes
Filtration sous
pression
La vitesse de filtration est augmentée en exerçant une

pression sur le liquide à filtrer en amant du matériel filtrant
représenté par une membrane filtrante (Fig. ).
La filtration sous pression évite le moussage et l’évaporation
du solvant; elle est d’un emploi fréquent dans l’industrie, .
Ultrafiltration
C’est une séparation de macromolécules en solution

dans une phase dispersante.
Il s’agit d’une membrane avec une porosité très faible

(25 nm) qui peut retenir les protéines et les acides
nucléiques.
Elle permet la concentration des solutions de

macromolécules et l’élimination de la plupart des
contaminants de petite masse moléculaire (sels,
glucides),
2
Centrifugation
Technique de séparation
Introduction sur la
sédimentation
La sédimentation est une technique d’analyse
permettant de séparer une dispersion d’un solide au sein
d’un liquide ou une dispersion d’un liquide au sein d’un
autre liquide non miscible et de densité différente.
Cette séparation peut se faire d’elle-même sous l’action

de la pesanteur lorsque la dispersion est formée d’une
substance plus dense que le liquide (décantation).
La centrifugation permet de remplacer l’accélération de

la pesanteur (g) par une accélération centrifuge
développée par un rotor tournant à grande vitesse (6 à
10000 tours par minute).
Centrifugation
La centrifugation est une technique qui permet la séparation
des composés d’un mélange en fonction de leur densité sous
l’action d’une force centrifuge.
Elle permet de récupérer un précipité (culot) et un

surnageant. Le mélange à séparer peut être constitué de
deux phases liquides ou de particules solides en suspension
dans un liquide.
L’ultracentrifugation utilise des vitesses de rotation encore

plus grandes (allant jusqu’à 75000 tours par minute) et
permet la sédimentation de particules
ultramicroscopiques.
Principe de Centrifugation
La centrifugation permet de séparer des constituants de

taille et de masse très différentes contenus dans un liquide.
Les constituants contenus dans un échantillon sont soumis

à deux forces:
La gravité: C’est la force qui s’exerce du haut vers le

bas.
La poussée d’Archimède: C’est la force qui s’exerce du

bas vers le haut.
Matériel de
Centrifugation
La centrifugeuse est l’appareil utilisé pour la centrifugation. La centrifugeuse est
constituée d’un axe de rotation enfermé dans une chambre de centrifugation.
A l’exception des centrifugeuses de paillasse dont la vitesse de rotation et le temps

d’utilisation sont relativement limités, il est nécessaire d’empêcher l’échauffement
des échantillons. Pour cela, la chambre de la centrifugeuse doit être réfrigérée (Fig.
)
. Les échantillons à centrifuger doivent être équilibrés deux à deux. Chaque couple
doit être placé symétriquement par rapport à l’axe de rotation.
Matériel de
Centrifugation
4
Introduction
• L’insuffisance rénale chronique est la résultante de la perte
progressive des fonctions des reins.
•
• Elle est la conséquence commune de la réduction du
parenchyme rénale fonctionnel au cours de maladies très
diverses affectant les reins ou les voies excrétrices.
• Lorsque le niveau de la fonction rénale devient inférieur à

un seuil critique, défini comme l’insuffisance rénale
terminale (IRT), le maintien de l’homéostasie n’est plus
possible et le recours au traitement de suppléance par
dialyse ou transplantation s’impose.
Introduction
• Avec le succès de la dialyse, l’insuffisance rénale
terminale cesse d’être mortelle et la qualité de vie
de ces malades est nettement améliorée.
• La dialyse a pour objectif de suppléer

temporairement à la fonction rénale défaillante.
Elle permet d’éliminer les toxines qui s’accumulent
dans l’organisme et de maintenir l’équilibre de
l’eau et la composition du sang.
La dialyse est un principe d’épuration sanguine.
C’est une méthode d’échanges entre deux solutions,

le sang et un liquide appelé « dialysat », au travers
d’une membrane semi perméable.
Cette membrane possède de multiples trous ou pores
permettant le passage des molécules d’eau et de
solutés de petit poids moléculaire (les solutés de poids
moléculaire élevé comme les protéines plasmatiques,
ne peuvent pas traverser cette membrane).
Les mécanismes impliqués dans la dialyse : la diffusion et
l’ultra-filtration
1/ La diffusion
Le transfert des solutés par diffusion au travers de la
membrane de dialyse relève d’un mouvement des molécules
contenues dans la solution.
Si la molécule rencontre un pore dont la taille correspond à

la sienne, elle traversera la membrane.
Le « gradient de concentration » du soluté de part et
d’autre de la membrane est le déterminant principal de la
diffusion des molécules : plus la solution a une
concentration élevée plus les molécules traversent la
membrane en direction de la solution dont la
concentration en solutés est la plus basse.
Les déchets de bas poids moléculaire (urée, créatinine,

potassium, etc.) qui s’accumulent dans le sang du
malade entre deux séances, sont éliminés avec le dialysat
en fin de séance.
2/ L’ultra filtration
Il s’agit du transfert des molécules d’eau à travers la membrane

sous l’effet d’une pression hydrostatique (dans le cas de
l’hémodialyse),
Cette technique permet d’éliminer l’eau (constituant une charge
hydrosodée), accumulée par le patient oligurique (production
anormalement basse d’urine par l’organisme) ou anurique
(absence d’urine) entre deux dialyses.
Deux types
Dialyse
péritonéale Hémodialyse
Hémodialyse
• Il s’agit d’une technique d’épuration par circulation
extracorporelle du sang à travers une membrane semi-
perméable.
• Le rein artificiel est composé de trois éléments :

l’hémodialyseur dans lequel s’effectue l’échange, le
dialysat "solution électrolytique vectrice des échanges"
et une circulation extracorporelle.
• Cette technique nécessite d’avoir un abord au sang. La

séance de dialyse est assurée par un appareil de dialyse,
Le moniteur générateur d’hémodialyse.
• Le traitement par Hémodialyse est réparti en 3
séances par semaine. Chacune durant environ
4 heures.
Dialyse péritonéale
• Le principe de la dialyse péritonéale est le même

que celui de l’hémodialyse : le sang du patient est
mis au contact d’une solution tampon de dialyse au
travers d’une membrane semi-perméable.
• Le sang reste toutefois dans l’organisme et la

membrane semi-perméable est le péritoine du
patient.
• La solution de dialyse est introduite dans la cavité
péritonéale par un cathéter en silicone.
Master 1 Microbiologie, Technique d’analyse et imagerie moléculaire, Chargée de cours : Dr. LEULMI N.
Référence : Document de Dr. BENABDALLAH Hassiba, Université Farhab abbes.
Chapitre 1 : methode de fractionnement et de purification (partie 02)

La chromatographie
Définition
La chromatographie est une méthode de séparation des constituants présents dans des
mélanges variés. Elle sert en analyse pour purifier, identifier et quantifier des composés au
sein d’échantillons divers.
Le principe de base repose sur les équilibres de concentration qui apparaissent lorsqu’un
composé est mis en présence de deux phases non miscibles, l’une dite stationnaire, est
emprisonnée dans une colonne ou fixée sur un support et l’autre, dite mobile, se déplace au
contact de la première.
Si plusieurs composés sont présents, ils se trouvent entraînés à des vitesses différentes,
provoquant leur séparation.
Principe
La chromatographie est une méthode physique de séparation basée sur les différentes
affinités d’un (des) composé(s) à l’égard de deux phases (stationnaire et mobile). Le principe
de cette technique est basé sur la migration différentielle des divers solutés contenus dans
un échantillon analysé.
L’échantillon est entrainé par la phase mobile au travers de la phase stationnaire qui a
tendance à retenir plus ou moins les composés de l’échantillon à l’aide d’interactions.
Une fois la phase stationnaire traversée, les composés sont élués. Les différents composants
de l’échantillon ont généralement une affinité différente pour l’une et l’autre des deux phases.
Il en résulte une différence de vitesse de progression des produits et donc d’élution. Ceci
permet de les séparer les uns des autres voire de les identifier. Cette vitesse de séparation est
fortement indépendante de la nature des phases mobile et stationnaire.
Types de chromatographie
Les méthodes chromatographiques peuvent être classées selon le support de la phase

stationnaire en:
- Chromatographie sur colonne (HPLC, CPG, et les colonnes de silice).
- Chromatographie sur surface (chromatographie sur couches minces ou CCM,
chromatographie sur papier).
Elles peuvent être classées aussi selon la nature de la phase mobile en:
- Chromatographie en phase gazeuse (CPG).

- Chromatographie en phase liquide (CPL):
 Chromatographie de partage centrifuge (CPC).
 Chromatographie liquide haute pression (ou performance) (HPLC).
1
Dr. LEULMI N.
1. Chromatographie sur colonne :
C’est une méthode de séparation des constituants d’un mélange par migration dans un
dispositif constitué de deux phases:
- La phase stationnaire: support solide.
- La phase mobile: le solvant.
La vitesse de déplacement des composés dans la colonne dépend de:  L’affinité à la phase
stationnaire: plus que l’affinité à la phase stationnaire est grande, plus que le déplacement des
composés dans la colonne est très lent.
 La solubilité dans la phase mobile (plus que le composé est très soluble dans la phase
mobile, plus que son déplacement dans la colonne est très vite).
Le choix du type de chromatographie et du support dépend de la nature des composés à

séparer.
A) Eléments chromatographiques
Les éléments de la chromatographie sont: L’échantillon, la phase stationnaire, la phase

mobile, la colonne, la pompe, le détecteur, le collecteur de fractions et l’enregistreur.
L’échantillon: C’est la solution qui contient les composés à analyser.
La phase stationnaire: C’est un gel constitué de granules qui se trouve dans une colonne.
Les granules peuvent: être poreuses, porter une charge ionique ou un site d’affinité.
2
Dr. LEULMI N.
Tableau : Les différents types de granules en fonction des différents types de

chromatographie.
 La phase mobile: C’est un liquide qui se déplace à travers la phase stationnaire, en

entraînant avec lui les composés de l’échantillon. Elle doit être soluble et interagir
avec les composés de l’échantillon et non pas avec la phase stationnaire.
 La colonne: C’est le support de la phase stationnaire (gel ou résine). A travers lequel,

la phase mobile passe. Elle peut être en verre, en plastique ou en inox et de différentes
dimensions (Fig.01 )
Figure 01 : la colonne chromatographique
La pompe: Elle permet de régler le débit de la phase mobile à travers la colonne (Fig.02).
Figure02 : La pompe.
3
Dr. LEULMI N.
 Le détecteur: Il évalue la quantité de chacun des composés séparés et envoie un

signal électronique vers l’enregistreur (Fig.03). Par exemple, les protéines sont
détectées grâce à un détecteur UV-visible.
Figure03 : le détécteur
 L’enregistreur: Il dessine les pics en fonction de leur intensité (fig. 04).
Figure 04 : l’enregistreur.
 Le collecteur de fractions: permet de collecter les fractions de l’échantillon.
B) Mode opératoire
Il consiste à: - Préparer le gel. - Remplir la colonne. - Equilibrer la colonne. - Injecter
l’échantillon. - Effectuer l’élution. - Récupérer les fractions. - Analyser le
chromatogramme. - Régénérer le gel.
Exemple : . Chromatographie échangeuse d’ions
Elle permet la séparation de molécules chargées (La séparation est en fonction de la charge
électrique). La phase stationnaire est un solide ayant des propriétés particulières que l’on
appelle un échangeur d’ions constitué par une résine porteuse de groupements ionisés
négativement ou positivement, exerçant des interactions électrostatiques (ioniques) avec des
composés (protéines) ionisées.
Les échangeurs d’ions sont des macromolécules insolubles portant des groupements
ionisables ayant la propriété d’échanger de façon réversible certains de leurs ions au
contact d’autres ions provenant d’une solution.
4
Dr. LEULMI N.
C’est une séparation des composés basée sur des interactions ioniques réversibles entre une
phase stationnaire appelée échangeur d’ion, des contres ions échangeables ou mobiles et un
soluté ou protéine chargé.
Applications
La chromatographie échangeuse d’ions est utilisée au laboratoire, depuis la préparation de

l’eau déminéralisée jusqu’à l’analyse de traces ioniques dans un échantillon. Elle s’applique à
l’analyse et à la séparation de sels minéraux, d’acides aminés, de peptides, de protéines, de
nucléotides, d’acides nucléiques, de lipides et de glucides ionisés.
5
Dr. LEULMI N.
Master 1 Microbiologie,Université Abbes laghrour khenchela
Chargée de cours : Dr. LEULMI N., Technique d’analyse et imagerie moléculaire
Chapitre 1 : Méthode de fractionnement et de purification (la suite

de la partie 02)
La chromatographie
2/ La Chromatographie liquide à haute performance (CLHP)

Parmi les techniques chromatographiques dont la phase mobile est un liquide, la
chromatographie liquide à haute performance est la plus connue. La CLHP ou sous acronyme
anglais HPLC (High Performance Liquid Chromatography), un type de chromatographie qui
permet de séparer des mélanges complexes avec une excellente résolution. Cette technique a
majoritairement été utilisée pour l’analyse des molécules bioactives notamment les
antibiotiques car elle présente de nombreux avantages. De part de sa large gamme
d’application, sa simplicité de mise en œuvre, sa reproductibilité et la présence d’une gamme
étendue de phases stationnaires commercialement disponibles permettant de moduler les
interactions avec le soluté. La CLHP dérive de la forme la plus ancienne de la
chromatographie liquide sur colonne dont les performances, en termes de sélectivité et de
résolution, se sont trouvées grandement améliorées par la miniaturisation et l’utilisation de
phases stationnaires très élaborées.
La phase mobile est généralement composée d'un mélange d'au moins deux solvants, ce qui
permet d'en faire varier la polarité. Selon le type de la phase stationnaire, la CLHP peut être
utilisée selon plusieurs modes de séparation en fonction des caractéristiques physico-
chimiques des molécules à séparer dont le mode dit phase normale (PN), et le mode dit phase
inverse (PI).
En CLHP en phase normale désigné sous l'acronyme anglais NP-HPLC (NP, Normal Phase),
la phase stationnaire est polaire constituée de gel de silice. Lors de l'injection d'une solution,
les produits polaires sont retenus dans la colonne, contrairement aux produits apolaires qui
sortent en tête. En CLHP en phase inverse désigné selon l'acronyme anglais RP-HPLC (RP,
Reversed Phase), elle est majoritairement composée de silice greffée par des chaînes linéaires
de 8 ou 18 atomes de carbones (C8 et C18).
Cette phase est apolaire et nécessite donc un éluant polaire constitué d’un mélange d'une
phase aqueuse et d'un solvant miscible avec celle-ci (acétonitrile ou méthanol).
RP-HPLC est la stratégie le plus communément utilisé dû à la qualité des séparations
obtenues. De nombreux antibiotiques y compris les polyéthers ionophores de polarité variée
peuvent être efficacement analysés par HPLC en phase inverse.
La colonne représente le cœur de l’appareil, le plus souvent en acier, dont la longueur et le

diamètre présentent des différences selon les modèles. En effet, de nombreux progrès ont été
effectués concernant les colonnes chromatographiques de par la volonté d’augmenter la
capacité de pics et de réduire considérablement le temps des analyses. Le support des
colonnes majoritairement utilisé est le gel de silice formé de grains de diamètre variant de 1,5
1
à quelques dizaines de micromètres. Ces grains présentent à leur surface des pores de
diamètres différents (80 à 300 μm) à travers desquels la phase mobile circule.
Afin que la composition de l'éluant programmée se rend dans la colonne chromatographique

le plus rapidement possible, l'instrument est configuré avec une pompe à haute pression qui
peut atteindre 20 000 kPa (200 bars). Les pompes équipées d’un système de gradient
permettant d'effectuer une programmation de mélange de solvants. La séparation peut être
effectuée en mode isocratique lorsque la composition en solvants de la phase mobile
demeure constante. Au cours de l’élution par gradient, la composition de la phase mobile
varie durant l'analyse.
-Si la phase stationnaire est polaire, les composés polaires seront plus retenus que les
composés non polaires.
-Si la phase stationnaire est apolaire, les composés apolaires seront plus retenus que les
composés polaires.
…………………………………………………………………………….
Figure : Les organes d’une chaine HPLC.
Dans des conditions chromatographiques données, trois méthodes d'étalonnages différents

peuvent être utilisées, chacune avec ses propres avantages et ses limites. Ces méthodes
entrent, également, dans l'analyse quantitative : étalon externe, étalon interne et la méthode
des ajouts dosés (Standard addition method).
La méthode d’étalon externe est la plus simple des trois méthodes. La précision de cette
méthode dépend de la reproductibilité du volume d'injection. Pour effectuer ce procédé, il est
nécessaire d’effectuer une courbe d’étalonnage à partir d’une solution standard. L'injection
ultérieure du même volume de l’échantillon à dosé, permet de connaître la concentration
recherchée de l'échantillon à doser.
2
Plusieurs types de détection sont disponibles, détecteur de type UV d’une seule longueur
d’onde à la fois et le détecteur à barrette de diodes (DAD) de plusieurs longueurs d’ondes à la
fois, l’évaporateur à diffusion de lumière, le détecteur d’indice de réfraction, le détecteur à
ionisation de flamme (FID), etc. En effet, le détecteur UV-Visible et le détecteur évaporateur
à diffusion de lumière représentent les principaux détecteurs, généralement, utilisés pour
étudier les antibiotiques.
 Détecteur à UV-Visible
Le détecteur UV-Visible d’une seule longueur d’onde à la fois permet d’obtenir le spectre des
composés examinés sous la forme d’un tracé de la transmittance ou de l’absorbance.
L’étude des spectres d’un grand nombre de molécules a permis d’établir des corrélations entre
structures et positions des maxima d’absorption. Les groupes fonctionnels des composés
organiques (cétones, amines, dérivés nitrés, etc.) responsables de l’absorption en UV/Vis sont
appelés groupements chromophores. La sensibilité de ce type de détecteur dépend de la
concentration du milieu absorbant, du trajet optique de la cellule et du coefficient d’extinction
molaire des composés à analyser. Cette étude permet de détecter les composés aromatiques,
qui absorbent entre 240nm et 260nm (figure 11).
La fonction du monochromateur est de sélectionner une longueur d'onde parmi le spectre

du rayon incident. Les plus simples sont composés de filtres ne laissant passer qu'une seule
longueur d'onde; il est possible d'en utiliser plusieurs afin d'obtenir différentes longueurs
d'onde. Cependant leurs possibilités sont limitées: les filtres sont peu précis dans leur
sélection et ne sont utilisables que dans le domaine visible. De plus, balayer le spectre entier
nécessite une multitude d'interventions.
Figure 11 : Instrumentation dans l’UV/Visible.
Plusieurs appareils modernes opèrent avec une barrette de diodes de détection (DAD, Diode
Array Detector), qui permettent de mesurer l'absorbance à plusieurs longueurs d'onde
simultanément (figure 12). Ce dernier permet non seulement d’obtenir un chromatogramme,
mais il fournit des renseignements spectraux pouvant servir à s’assurer de l’identité des
composés séparés.
3
Figure 12 : principe du détecteur à barrette de diodes.

 L’évaporateur à diffusion de lumière (acronyme en anglais ELSD, Evaporative
light scattering detection)
Ce détecteur a été reporté pour la première fois par une équipe australienne en 1966 comme
une alternative au détecteur conventionnel utilisé en chromatographie liquide. Depuis ces
vingt cinq dernières années, ELSD a acquis une notoriété bien établie grâce à plusieurs études
théoriques basées sur des recherches fondamentales et à de nombreuses applications
développées dans différents domaines.
Cette technique a pour principe de la détermination de la quantité de lumière diffusée par

des particules de soluté après une étape d`évaporation. La phase mobile passe à travers un
nébuliseur où elle est mélangée avec de l’azote, puis elle est évaporée à travers un tube
chauffé. Un laser va irradier les particules ainsi formées (1/10ème de μm à quelques μm) et
une photodiode va détecter la lumière diffusée. Les particules diffusent la lumière dont les
longueurs d’onde se situent dans le domaine du visible. La diffusion dépend du rayon des
particules et de longueur d’onde du rayonnement incident (figure 13).
Figure 13 : Schéma représentatif de détecteur évaporateur à diffusion de lumière.
4
Cette technique se différencie par rapport aux autres modes de détection par la capacité à
signaler des molécules non chromophores, des molécules qui n’ont pas une absorbance
en UV. Elle peut en effet détecter des composés comme les sucres et certains antibiotiques.
La maîtrise du couplage en ligne, devient un outil précieux. Le couplage de chromatographie
liquide-spectrométrie de masse (LC-MS), chromatographie liquide-spectrométrie de masse
tandem (acronyme anglais, LC-MS/MS), chromatographie liquide-spectroscopie infrarouge
(acronyme anglais, LC-IR) et la chromatographie liquide-résonance magnétique nucléaire
(acronyme anglais, LC-NMR) permettent, ainsi, d‘obtenir des informations structurales sur les
molécules séparées et d‘évaluer leur pureté.
Notion de temps
-t0 :est le temps du début de l'injection.
-Le temps mort tm : est le temps mis par un composé non retenu par la phase stationnaire
pour traverser la colonne (temps passé dans la phase mobile).
-Le temps de rétention est une grandeur caractéristique d’un analyte dans des conditions
opératoires données, c’est le temps écoulé entre l’injection et le maximum du pic du
composé élué, noté tr et exprimé en minutes. On utilise ce paramètre pour identifier les
composés dans un chromatogramme. Il varie en fonction du débit de la phase mobile et de
leur composition, de la température d'élution et de la nature de colonne utilisée. Le temps de
rétention tr d’un soluté est fonction de son affinité avec l’éluant d’une part et avec la phase
stationnaire d’autre part. A un instant t, le soluté est à la concentration Cm dans la phase
mobile et à la concentration Cs dans la phase stationnaire, leur rapport est appelé coefficient
de partage noté K.
-Volume de rétention
C’est le volume de la phase mobile nécessaire pour éluer un composé d’un mélange à
analyser. Ce volume est caractéristique d’un seul composé dans des conditions opératoires
données. Il est lié au temps de rétention tr d’un soluté et au débit d’écoulement de la phase
mobile. Le volume de rétention est noté Vr.
5
Chapitre 02 : électrophorèse
Définition
C’est une des nombreuses techniques de séparation et d’analyse de particules chargées par
migration différentielles sous l’action d’un champ électrique. Des particules chargées
(ADN, ARN, protéines) sont donc placées dans un champ électrique créé par une tension
continue et se déplacent vers le pôle de signe opposé à leur charge à une vitesse
proportionnelle à cette charge. Si on dépose une espèce anionique (chargée négativement),
elle migrera vers l’anode (+) et une espèce cationique (chargée positivement) du côté de la
cathode (-).
Principe
L’électrophorèse est une technique permettant de déplacer des ions (molécules ayant perdu
leur neutralité électrique) sous l’effet d’un champ électrique. Ceux-ci migrent vers leur
électrode respective: Les anions migrent vers l’anode (chargée positivement) et les cations
migrent vers la cathode (chargée négativement).
Facteurs influençant la mobilité électrophorétique
Plusieurs facteurs peuvent influencer la mobilité électrophorétique
 +Nature de la molécule
La taille e la charge de la molécule influencent le processus électrophorétique. En effet, les

petites molécules migrent facilement mais leur mobilité dépend des autres substances
dissoutes susceptibles de les solvater et de diminuer leur vitesse. De même, la charge des
molécules influence directement leur mobilité. La charge est en fonction du pH pour les
molécules ionisables, de la force ionique et de la formation éventuelle de complexes. Le
signe de la charge détermine le sens de migration et sa vitesse.
 Composition ionique du tampon (conducteur électrique); d’électrophorèse
La présence d’ions étant nécessaire au passage du courant, un compromis est obtenu avec
une force ionique comprise entre 0.05 et 1 mol/l. Le pH influe sur l’ionisation des acides
faibles et bases faibles, pour lesquels il s’avère nécessaire de travailler dans un milieu
tamponné. A pH et force ionique identiques, deux tampons de nature différente ne produisent
pas toujours des mobilités électrophorétiques identiques. Certaines substances ajoutées au
tampon de migration modifient aussi les comportements électrophorétiques.
Ainsi:
 La présence d’EDTA ou d’acide citrique favorise par complexation la séparation de certains

ions minéraux.
 Les ions boratés forment avec les sucres des complexes chargés rendant ainsi possible leur
séparation.
1
 L’addition d’urée modifie le comportement électrophorétique des macromolécules par

rupture de liaisons hydrogène.
 Support
Certains supports possèdent des propriétés adsorbantes et peuvent fixer les molécules de
solvants ou de solutés. Il en résulte un ralentissement de la migration entrainant un
élargissement des zones sur l’électrophorégramme. Ces propriétés adsorbantes sont liées à la
présence de certains groupements fonctionnels comme les hydroxyles.
 Champ électrique
Il représente la chute de potentiel par unité de longueur entre deux électrodes séparées par
une distance. Le champ électrique est fourni par un générateur de courant continu. Le
support de ce champ est constitué par un tampon de pH dont les ions conduisent le courant
d’un pôle à un autre. Ce support peut être liquide: on parle alors d’électrophorèse en
veine liquide. Dans une large majorité des cas, on utilise un support poreux stabilisant la
phase liquide: on parle alors d’électrophorèse sur support ou d’électrophorèse de zones.
Le mélange à séparer est déposé sur un support poreux imprégné de tampon. Ce support peut
être du papier, un dérivé de cellulose, de l’amidon, de l’agarose, du polyacrylamide, etc.
Le support doit être homogène et inerte. Les particules à séparer peuvent être de nature et de
taille très différentes: des composés organiques ou minéraux, de la taille d’une cellule ou de
celle d’un ion. Cette méthode est souvent utilisée pour séparer des acides nucléiques, des
petits peptides ou des protéines.
2
 Types d’électrophorèse
L’électrophorèse peut être en des conditions non dénaturantes ou en des conditions

dénaturantes (SDS-PAGE).
1/Electrophorèse en des conditions non dénaturantes
Les molécules sont séparées dans leur état le plus proche possible de leur état natif. La
vitesse de migration dépend de la charge native de la molécule et de sa structure
tridimensionnelle.
2/Electrophorèse en des conditions dénaturantes
Les molécules sont soumises à un traitement dénaturant avant la séparation

électrophorétique, détruisant la structure tridimensionnelle native. La séparation est donc
en fonction de la masse moléculaire. Les agents de dénaturation sont le SDS (Sodium
Dodécyl Sulfate) et le β-mercaptoéthanol qui réduit les ponts disulfures des protéines.
Le SDS (Fig. 1) est un dénaturant doux et un surfactant, il agit sur les protéines de plusieurs
façons:
- Si la protéine est oligomérique, ses sous unités sont séparées les unes des autres.
- Il se fixe sur les protéines, les tapissant de charge négative (Fig. 2). Les protéines
transformées en manopolyanions, possèdent toutes la même mobilité électrophorétique. La
charge négative globale permet la migration vers l’anode, mais les molécules sont
séparées uniquement en fonction de leur masse moléculaire.
3
Figure 01 : Structure de SDS.
Un agent dénaturant
Enveloppe les chaines polypepetidique des protéines de charge négative
Même charge
Donc la migration dépend donc de la masse de protéine et pas de la charge
Figure 02 : Action du SDS sur les protéines.
4
Selon le support électrophorétique, il existe deux types d’électrophorèse:
 Electrophorèse en veine liquide (électrophorèse libre)
Il s’agit de la première méthode élecrophorétique décrite. La solution échantillon est placée

dans un tube en U et recouverte d’une solution tampon de densité plus faible que celle de
l’échantillon pour éviter les courants de convection. Les électrodes sont placées dans le tube
où l’on applique le champ électrique. La migration dans ce cas s’effectue au sein d’un liquide
constitué par une solution tampon de pH et de concentration convenable dont les ions
conduisent le courant d’un pôle à un autre. Ce type de d’électrophorèse présente de multiples
inconvénients (Appareillage couteux, mise en œuvre longue et délicate, séparation incomplète
des particules).
 Electrophorèse de zone sur support (deux types : horizontal ou vertical)
Les mobilités obtenues en ce type d’électrophorèse sont plus faibles que celles de
l’électrophorèse en veine liquide. Ce type utilise un support poreux stabilisant la phase
liquide. Le mélange à séparer est déposé sur un support convenable, homogène, poreux, inerte
et imprégné de tampon. Ce support peut être du papier, un dérivé de cellulose, de l’amidon, de
l’agarose, du polyacrylamide (PAGE), etc.
5
Les différents types d’électrophorèse de zone sont souvent nommés en fonction du type de
support (papier, ester de cellulose, gel, etc.). Electrophorèse sur papier, sur acétate de
cellulose, sur gel (amidon, agar, agarose, polyacrylamide).
Les fractions séparées par électrophorèse de zone migrent comme des zones individuelles. La
taille des pores pour le support en gel peut influencer la vitesse de migration (ralentissement
du déplacement des grosses molécules).
A) Appareillage d’électrophorèse
L’appareillage usuel est constitué de (Fig. 3):
 Un générateur du courant continu stabilisé relié aux électrodes de la cuve. Ce courant

crée un champ électrique qui va permettre de faire migrer les molécules.
 Une cuve d’électrophorèse fermée (horizontale ou verticale) et éventuellement

thermostatée comportant deux compartiments. Chaque compartiment est rempli du
tampon de migration.
 Des accessoires comme le support d’électrophorèse, les plaques de verre pour couler le gel
et les peignes pour creuser des puits dans le gel, dans lesquels les composés à analyser seront
déposés.
Figure : Appareillage d’électrophorèse.
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Cuve pour électrophorèse

Un support ou le gel est coulé
Peigne : pour la formation de puits ou se sont déposés des échantillons
Le gel est soumis à un champ électrique
B) Mode opératoire
Il consiste à:
- Préparer le gel de concentration et le gel de séparation.
- Couler le gel de séparation entre des plaques de verre fixées sur un support suivi par le
gel de concentration.
- Déposer un peigne entre ces plaques.
- Retirer le peigne après polymérisation du gel (formation des puits).
- Déposer l’échantillon et les marqueurs de masse moléculaire dans les puits.
- Placer les plaques de verre contenant le gel polymérisé dans une cuve d’électrophorèse.
- Remplir la cuve avec le tampon de migration.
- Mettre en marche le générateur de courant.
- Enlever le gel à partir des plaques à la fin de la migration.
- Colorer puis décolorer le gel.
- Analyser le gel.
-Préparation du gel
Elle consiste à préparer deux gels: un gel de séparation dont les pores sont serrés et un gel de
concentration dont les pores sont lâches.
Le gel de polyacrylamide est une macromolécule réticulée utilisée comme support

d’électrophorèse. C’est un copolymère d’acrylamide qui forme des chaînes et de NN’-
méthylène bis-acrylamide qui assure le potage entre les chaînes de polyacrylamide (Fig. 4).
La polymérisation de l’acrylamide nécessite la présence de deux catalyseurs: Le TEMED (N,

N, N’, N’-tétraméthyléthylène diamine: TMEDA) et le persulfate d’ammonium
[(NH4)2S2O8] qui deviennent des anions hyperactifs en présence de lumière. La porosité du
gel varie en fonction du taux de l’acrylamide, de bis-acrylamide, du TEMED (Fig. 5) et du
persulfate d’ammonium. Plus que le pourcentage d’acrylamide est élevé, plus que la densité
des chaînes est élevée et les mailles du réseau sont serrées. Par conséquence, plus le
pourcentage d’acrylamide est élevé, moins les molécules volumineuses peuvent migrer. Donc,
plus que la masse moléculaire du composé est élevée, plus que la migration est lente.
7
Figure 05 : Structure chimique de TEMED.
Le gel de séparation permet la séparation de la solution à analyser. La densité typique de ce

gel peut être 6, 8, 10, 12, ou 15%. Plus le gel est dense meilleure sera la séparation des
composés. Le gel de concentration est coulé en haut du gel de séparation et sa densité est de
l’ordre de 5%. Il permet une entrée homogène de l’échantillon dans le gel de séparation.
Préparation de l’échantillon: L’échantillon est soumis à l’action de plusieurs composés:
 Le β mercaptoéthanol: Composé qui exerce une action dénaturante sur les protéines
oligomériques en rompant les ponts disulfures ce qui désorganise leur structure
tridimensionnelle. Les sous unités des protéines sont donc dissociés.
 Le SDS: Composé capable de venir se fixer sur la périphérie des chaînes de protéines tout
en leur conférant une charge négative.
 Le sucrose ou le glycérol: Qui donnent une densité à l’échantillon permettant ainsi à ce

dernier d’être déposé facilement au fond des puits.
 Le bleu de bromophénol: Est également utilisé comme marqueur coloré afin de vérifier le
bon déroulement d’une électrophorèse sur gel de polyacrylamide ou en gel d’agarose. En
8
conséquence, les protéines sont dénaturées (elles ont perdu leur structure tridimensionnelle) et
n’ont plus de ponts disulfures (elles sont sous une forme monomérique).
Les marqueurs de masse moléculaire: La détermination de la masse moléculaire des

protéines inconnues nécessite l’utilisation des protéines standards de masse moléculaire
connue.
Le tampon de migration: Il contient des électrolytes qui sont responsables du transport du

courant électrique. Si la concentration de ces électrolytes est faible, la totalité du courant est
transportée par le soluté et une faible proportion est transportée par les électrolytes, ce qui
entraine la migration des protéines et donc leur séparation. Le tampon d’électrophorèse est
constitué de glycine qui joue le rôle de conducteur de courant.
La coloration: Une fois la migration électrophorétique terminée, le gel est démoulé, séché
puis plongé dans un colorant. Les protéines sont révélées par une coloration spécifique (par
exemple avec le bleu de Coomassie).
La décoloration: Une succession de bains dans la solution de décoloration permet d’éliminer

la coloration du fond de façon à faire apparaître les bandes correspondant aux diverses
protéines séparées. Les protéines sont fixées dans le gel par une solution qui contient du
méthanol et de l’acide acétique.
C) Applications l’électrophorèse est utilisée pour vérifier la pureté d’une fraction

chromatographique et pour déterminer la masse moléculaire d’une protéine inconnue à l’aide
des protéines standards.
 Détermination de la masse moléculaire
Le fait que le SDS rende négatives les protéines permet de les séparer en fonction de leur
taille (masse moléculaire) et non pas en fonction de leurs charges. Il existe une relation de
linéarité entre le logarithme de la masse moléculaire et le déplacement électrophorétique
(Rf) au sein du gel. Cette technique est utilisée pour déterminer la masse moléculaire
d’une protéine inconnue.
Dans les mêmes conditions, on soumet la protéine à analyser à une électrophorèse, la

connaissance de son déplacement (Rf) et l’extrapolation de ce Rf sur la droite: Log M = f
(Rf), permettent la détermination de sa masse moléculaire. A l’aide de marqueurs
protéiques (protéines pures de masse moléculaire connue), on trace la droite d’étalonnage
Log M=f (Rf). Le rapport frontal (Rf) représente le rapport de la distance parcourue par la
protéine sur la distance parcourue par le front de migration (Fm).
Autres types d’électrophorèse
Il existe d’autres types d’électrophorèse: Electrophorèse bidimensionnelle,

isoélectrofocalisation, électrophorèse en champ pulsé et immunoélectrophorèse.
Electrophorèse bidimensionnelle C’est une méthode de séparation des protéines selon leur
point isoélectrique (pHi) et leur masse moléculaire. La séparation se fait en deux dimensions:
9
**La première dimension consiste à séparer les protéines selon leur pHi par
isoélectrofocalisation (IEF) et la deuxième dimension
consiste à séparer les protéines selon leur masse moléculaire par électrophorèse en présence
de SDS.
10
Chapitre : électrophorèse
Focalisation isoélectrique
Définition
C’est une technique de séparation des protéines les uns des autres en fonction de leur point
isoélectrique.
Une cellule éléctrophorétique + un faible % de l’acrylamide (pour éviter que la porosité

affecte la vitesse de migration) + des ampholytes (pour créer un gradient de pH).
Le déplacement des molécules dans le gel doit effectuer en fonction de leur point
isoélectrique seulement.
Les ampholytes : ce sont des petites molécules chargées, on les met sur le gel et se disposent
sous l’effet d’un champ électrique les uns à la suite des autres dans l’ordre de leur points
isoélectrique pour créer un gradient de pH.
- Dispositif de l’isofocalisation
c’est un système formé d’un gel de polyacrylamide à faible pourcentage et pour générer le
gradient de pH, on ajoute des ampholytes dans le mélange de gel avant sa polymérisation.
-L’extrémité du gel coté pH acide de gradient est prolongé dans un réservoir acide contenant
acide fort. L’autre extrémité coté pH alcalin du gel et prolongé dans un réservoir alcalin
contenant une base forte. Après l’application d’un courant électrique, les molécules migrent.
Cette migration se fait selon le pHi.
Principe de l'isoélectrofocalisation des protéines

Les protéines sont des composés amphotères en raison des fonctions acides/bases qu'elles
portent : -COOH/-COO- du carbone terminal, des glutamates, des aspartates, -NH2/-
1
NH3+ de l'azote terminal et des lysines, =N-/=NH+- des histidines, N-C(=NH)-N / N-

C(=NH2+)-N des arginines ...D'où le schéma fondamental :
-pHi (noté souvent pi) = point isoélectrique = pH pour lequel la charge nette d'une protéine
donnée est nulle.
pour pH<pHi la charge nette est positive (de plus en plus) ;
pour pH>pHi, elle est négative (de plus en plus).
(la valeur du pHi est influencée par la force ionique du milieu et par l'état conformationnel
natif ou dénaturé.
photo
-il faut bien noter que chaque ampholyte a son pHi précis. Le pH de mélange de ces
ampholytes est égal à 7. Une fois le courant électrique introduit. Les ions H+ et OH- migrent
de tampon vers le gel. Du fait que le coté proche du pole positif deviens plus acide et celui de
pole négatif devient plus basique. Le pH de milieu va donc être changer du coup, les
ampholytes vont migrer au fur et à mesure en fonction de leur pHi soit vers le pole négatif ou
positif et ils vont à leurs tours influencer le pH du gel.
Un gradient de pH se met en place peu à peu et chaque ampholyte va s’arrêter et se focaliser

dans la zone là ou sont pHi égal au nouveau pH du milieu.
-Parlant de notre échantilon, après le dépôt de l’échantillon, les protéines vont migrer selon le
gradient de pH induit par les ampholytes sous l’effet d’un champ électrique. Jusqu’àce qu’ils
focalisent chacune sur son point ou son pHi égal le pH sur le gel, la, il arrêtent la migration.
Donc, si un mélange de protéine est soumis à une électrophorèse dans une matrice ayant un
gradient de pH. Le pH augmente lentement de l’anode vers la cathode. Chaque protéine va
migrer jusqu’à l’endroit ou le pH est égal à son pHi (c’est-à-dire lorsque leur charge nette est
nulle).
2

Technique D'analyse

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M1 Microbiologie

Technique d’analyse et imagerie moléculaire

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Chapitre 1 : methode de fractionnement et de purification (partie 02)

Les méthodes chromatographiques peuvent être classées selon le support de la phase

- Chromatographie en phase gazeuse (CPG).

1. Chromatographie sur colonne :

- La phase stationnaire: support solide.

- La phase mobile: le solvant.

Le choix du type de chromatographie et du support dépend de la nature des composés à

Les éléments de la chromatographie sont: L’échantillon, la phase stationnaire, la phase

L’échantillon: C’est la solution qui contient les composés à analyser.

Tableau : Les différents types de granules en fonction des différents types de

 La phase mobile: C’est un liquide qui se déplace à travers la phase stationnaire, en

 La colonne: C’est le support de la phase stationnaire (gel ou résine). A travers lequel,

Figure 01 : la colonne chromatographique

 Le détecteur: Il évalue la quantité de chacun des composés séparés et envoie un

 L’enregistreur: Il dessine les pics en fonction de leur intensité (fig. 04).

 Le collecteur de fractions: permet de collecter les fractions de l’échantillon.

Exemple : . Chromatographie échangeuse d’ions

La chromatographie échangeuse d’ions est utilisée au laboratoire, depuis la préparation de

Chapitre 1 : Méthode de fractionnement et de purification (la suite

2/ La Chromatographie liquide à haute performance (CLHP)

La colonne représente le cœur de l’appareil, le plus souvent en acier, dont la longueur et le

Afin que la composition de l'éluant programmée se rend dans la colonne chromatographique

Figure : Les organes d’une chaine HPLC.

Dans des conditions chromatographiques données, trois méthodes d'étalonnages différents

La fonction du monochromateur est de sélectionner une longueur d'onde parmi le spectre

Figure 11 : Instrumentation dans l’UV/Visible.