Compte rendu des travaux pratiques de

biochimie

Introduction:
La chromatographie est une technique d'analyse pour sparer les
constituants d'un mlange.
On tudie maintenant la chromatographie de gel-filtration sur
Sephadex G50.
La chromatograpie de tamisage molculaire ou gel-filtration met a
profit la difference de masse molculaire existant entre des
substances, mais a linverse dun tamisage ordinaire, les grosses
molcules seront lues de la colonne avant
les petites
molecules.
En effet les grosses molcules ne pnetrant pas dans le gel et
traversent plus rapidement le support chromatographique, alors
que les plus petites entrent dans le pores du gel et seront
retardes .
Les molcules sont donc lues dans
molculaires dcroissentes.

lordre des masses

1.Principe
Application de la gel-filtration sur Sphadex G50 pour sparer la
Srumalbumine(protine de masse molculaire 68000) du glucose
(MM=180)
Aprs lution , la Srumalbumine est dtecte par raction
colore avec le ractif au bleu de Coomassie el le glucose par le
mthode enzymatique.

2.Materil et ractifs:

 Colonne de Sephadex G50 quilibre dansl leau(diameter

0,9 cm/hauteur 17 cm)
Mlange etudier :Srumalbumine(BSA 1%)+ Glucose 0,1%
Ractif au bleu de Coomassie
Ractif Glucose enzymatique

3.Mode opratoire
Nous avons imin leau au dessus de la colonne(sans
laisser scher la surface du gel) et on depose au sommet de
la colonne 0,5 ml de solution a analyser (glucose+BSA) en
vitant de remettre le gel en suspension.
On laisse la solution pntrer dans le gel aprs on rajoute de
leau au sommet
Lluat on a rcupr dans 30 tubes a hemolyse par
fractions de 0.5 ml/tube/3 minutes
Quand nous avons complt toutes les tubes a hemolyse on
effectue les 2 ractions suivantes:
a) Rction au bleu de Coomassie
On a pris 0,1 ml dluat partir des differentes tubes pour
voir lapparition et le disparition de la protine et on a
ajout aussi 0,7 ml deau et 0.1 ml de bleu de Coomassie.
On a obtenu le Vo(volume luant)=6 ml (5,2 le volume
pour 8 tubes d'hemolyse tests jusqu'a l'apparition du
protine + 0,8 deau)
b) Raction enzymatique
Cette raction nous permet de voir lapparition et le
disparition du glucose
On prend 0,4 ml dluat partir des differents tubes et on
ajoute 1 ml de glucose enzymatique dans chaque tube
danalyser.
Le volume obtenu est Vt=13,8 ml
Vt=Vo+Vi
Vo=6 ml

Vi=7,8 ml(3, 8 le volume collect dans des diffrents

tubes dhemolyse tests+4 ml deau)
Vt=6 ml+ 7,8 ml=13,8 ml