Note 

: 16,5

LAPORTE Léonie
LEMOUZY Pierre

Compte-rendu de biologie végétale

Tp9 Réaction de Hill

I. Introduction

La réaction de Hill est une oxydo-réduction qui se déroule durant la photosynthèse, découverte en
1937 par Robert Hill.

Cette réaction se déroule lors de la photosynthèse. Lors de la photosynthèse, il y a formation de

glucides, donc de glucose, grâce à l’arrivée de CO2 et à la libération de O2
On représente la photosynthèse par une formule :

lumière
6CO2 + 6H2O → C6H12O4 + 6O2
Dioxyde eau molécule dioxygène
de carbone organique

Robert Hill a donc mis en place la séparation du dégagement d’O2 et de la fixation du CO2, pour
prouver un échange de protons et d’électrons. Pour cela, il a utilisé des fragments de chloroplastes
ainsi qu’un accepteur d’électron produit par la photolyse de l’eau.
Hν

chloroplastes
H2O --------->1/2 O2 + 2H+ + 2e-

Donc dans la réaction de Hill, il y a un échange de protons et d’électrons. Pour le mettre en

évidence Robert Hill a utilisé une molécule nommée DCPIP, que l’on utilisera aussi dans le Tp.
Cette molécule va engendrer un changement de couleur lorsqu’elle capteras des électrons, à
l’origine il a une coloration bleu, mais en présence d’échange d’électron et de protons, il deviendra
incolore.

II. L’isolement de chloroplaste d’Épinard

Dans cette manipulation, nous allons extraire les chloroplastes des feuilles d’épinard par
centrifugation, tout en les gardant fonctionnels.
Cela a pour but de créer une solution de suspension de chloroplastes.

Protocole:

Nous allons peser 50g d’épinard préalablement conservé au réfrigérateur (à l’obscurité), retirer les
grosses nervures, puis les découper en morceaux d’environ 1cm2 pour enfin les broyer avec un
mortier dans un bac de glace pour conserver la température froide. Le retrait des nervures et le
découpage en petits morceaux permettra un broyage plus simple et plus efficace.)
De plus, nous avons ajouté du sable de fontainebleau pour facilité le broyage, puis nous avons
ajouter au fur et a mesure 125mL de « milieu d’extraction » froid.
Le « milieu d’extraction » se compose de :
- 0,4 M de saccharose, qui a pour rôle de faire éclater les cellules dans d’isoler les
chloroplastes
- 0,03 M de KCL, qui a pour rôle d’apporter des ions (K+ et Cl-) qui permet de garder les
chloroplastes fonctionnels.
-0,02 de tampon de Tricine, qui a un rôle de détergeant
- KOH qui a pour rôle d’ajuster le pH à 7,5

Le milieu d’extraction a donc pour but de converser l’intégrité de notre solution de chloroplastes de
façon à ce qu’il reste fonctionnels.

Nous avons ensuite filtré avec une compresse le contenu du mortier pour récupérer le liquide du
broyage et jeter les rester des tissus non broyés. Nous finirons par pressé la compresse avec nos
doigts pour récupérer le maximum de liquide.

Puis, nous avons réparti le filtrat dans deux tubes à centrifugation, que nous avons ensuite peser et
équilibrer pour qu’il est la même masse, c’est important pour la centrifugation.

Nous avons ensuite centrifuger nos 2 tubes à 500g pendant 5 minutes. Lors de la centrifugation, il
est important de respecter la symétrie axiale, les tubes de même masses doivent être en face.

Suite à cette première centrifugation, nous avons récupérer les surnageant dans le but de les
centrifuger à nouveau, et nous avons jeter les culots (partie collée au fond du tube).
Nous avons jeter les culots car ils contiennent les noyaux des chloroplastes cassés, donc non
fonctionnels.
Nous avons ensuite, re équilibrer les tubes avec le surnageant pour les centrifuger à nouveau à
2000g pendant 15 minutes.

Suite à cette seconde centrifugation, cette fois-ci nous avons garder les culots et jeter les
surnageants.
Nous avons garder les culots après la deuxième centrifugation car c’est dans les culots que se
trouvent les chloroplastes que l’on a pour but d’isoler.
Nous mettons les culots dans 10mL de milieu d’extraction froid, et nous agitons délicatement avec
une baguette en verre et nous les conservons à l’abris de la lumière afin d’assurer leur intégrité

Conclusion partielle :
Nous avons du effectuer 2 centrifugations de façon à mieux isoler les chloroplastes qui se trouvait
au départ dans le surnageant et suite à la deuxième centrifugation ils ont été regroupés dans le culot.

III. Dosage de la chlorophylle dans la suspension de chloroplastes

Nous avons pour but dans cette partie de déterminer la concentration de chlorophylle dans la
suspension de chloroplastes précédemment obtenue. Pour cela, nous utiliserons de l’acétone.
Nous déterminerons la concentration de cette dilution (acétone + suspension de chloroplastes) de
par spectrophotométrie qui nous permet de déterminer sa Densité Optique (DO). Par la suite, cela
nous permettra également de calculer sa concentration de chlorophylle avec la loi de Beer-Lambert
à partir de la DO trouvé précédemment.

Nous cherchons à connaître la concentration en chlorophylle de notre suspension dans le but de

calculer le volume de la suspension à dilué avec le milieu d’extraction afin de mettre en évidence la
réaction de Hill.

Protocole :

Nous avons mis 0,1mL de la suspension-mère de chloroplastes dans une fiole jaugée de 25mL, que
l’on complète avec de l’acétone à 80% jusqu’au trait de jauge.
Nous utilisons de l’acétone parce que c’est un solvant qui permet d’extraire les chlorophylles des
chloroplastes en détruisant la membrane des chloroplastes.
Avant de mesurer la densité optique, nous devons faire un blanc d’acétone à 80% pour régler le O
de DO.
De plus, c’est le solvant que l’on a mélangé à notre suspension et on cherche à déterminer la densité
de notre suspension et non de l’acétone.
Nous avons donc ensuite mesurer la densité optique au spectrophotomètre à une longueur d’onde de
652nm.

Nous avons choisis 652nm car cette longueur d’onde se trouve au niveau du bleu-violet, et c’est les
couleurs les plus adaptées à la photosynthèse qui nous permet de d’étudier que les chlorophylles.

On obtient alors une DO égale à 0,369

Nous pouvons donc calculer la concentration avec la loi de Beer-Lambert :

C = DO
ε.l
avec C = concentration de la substance en mg/mL
DO = densité optique (= 0,369)
l = trajet optique de la cuve en cm (=1 cm)
ε = coefficient d’extinction en mL/cm/mg (= 36mL/mg)

Donc C = 0,369 = 0,01025mg/mL-1

36 x 1
La concentration en chlorophylle de notre suspension est donc égale à 0,01025mg/mL

Conclusion partielle :
Nous avons diluer la suspension mère avec de l’acétone dans le but de trouver la concentration en
chlorophylle de notre suspension, calculé avec la DO.

IV. Mise en évidence de la réaction de Hill

Dans cette dernière partie, nous allons enfin pouvoir mettre en évidence la réaction de Hill en
séparant 9 tubes à essais avec des milieux d’incubations différentes dans le but de trouver les
facteurs modifiant la réduction du DCPIP, donc qui ont une influence sur la photosynthèse.

Le but de cette dernière partie est comme on l’a dit précédemment de mettre en évidence la réaction
de Hill en mesurant la DO de la molécule de DCPIP.
Si il y a un flux d’électrons et de protons alors, il y a photosynthèse

La DO du DCPIP permet de témoigner de la présence ou non de ce flux.

Lorsque la valeur de la DO de la forme oxydée (couleur bleu) du DCPIP est supérieur à la valeur de
la DO de la forme réduite (incolore) du DCPIP alors il y a présence de ce flux.

On utilise également du DCMU qui empêche la photosynthèse donc fait que le DCPIP reste à l’état
oxydé (donc le DCPIP garde sa couleur bleu)
Cela permet de comparer une DO avec photosynthèse et sans.

Un autre facteur de variation entre nos 9 tubes différents est l’intensité de la lumière pour voir
l’effet de la lumière sur le changement de couleur du DCPIP et également voir l’effet de la lumière
sur la photosynthèse.

Nous mesurerons donc la DO de nos 9 tubes aux contenus différents.

Composition de nos 9 tubes :

Tube n° Tampon Tricine Milieu d’extraction Solution de Solution de Suspension diluée de

0,02 (mL) (mL) DCMU (mL) DCPIP (mL) chloroplastes (mL)
1 3 1 0 1 0
2 4 0,5 0 0 0,5
3 4 0 0 0 1
4 et 5 3 0,5 0 1 0,5
6 et 7 3 0 0 1 1
8 et 9 0 0 3 1 1

Nous allons calculer le volume de suspension de chloroplastes à diluer dans 10 mL de milieu

d'extraction. Pour calculer ce volume nous devons d'abord calculer la concentration C2 De
chlorophylle contenu après cette dilution. Pour cela, nous utilisons la concentration de chlorophylle
calculé dans la deuxième partie C1 et le facteur de dilution (ici 250 car on a diluer dans la deuxième
partie 0,1 ml de la suspension de chloroplastes sortie des deux centrifugation avec 25 ml d'acétone)

C2 = C1 x facteur de dilution (250)

C2 = 0,01025 x 250 = 2,5625
C2 = 2,5625

Calcul du volume de suspension de chloroplastes sortant des deux centrifugation à diluer avec 10
ml du milieu d'extraction :

Ci x Vi = Cf x Vf

Vi = Cf x Vf
Ci

Vi = 0,02 x 10
2,5625
Vi = 0,078 mL = 78µL
on arrondie à 80µL

Nous diluons donc 80µLde la suspension de chloroplastes dans 10mL du milieu d’extraction

Protocole :

Nous faisons donc nos 9 tubes avec le tampon Tricine, la solution DCPIP, la solution de DCMU et
le milieu d’extraction.
Après avoir réalisé nos 9 tubes, il ne reste que la suspension mère dilué de chloroplastes à rajouter.
Pour cela, on utilise une pipette automatique avec un cône adaptée au volume nécessaire (une
P1000) et on rajoute 0,5 mL pour les tubes 2,4 et 5 et 1 mL pour les tubes 3,6,7,8 et 9.

Lorsqu'on a fini la réalisation de neuf tubes et qu'ils sont complets, on expose à la lumière forte soit
à 150 watts les tubes 4,6 et 8 (contenant tous les trois du de DCPIP).
Au même moment, nous plaçons les tubes 5,7 et 9 sous une lumière ambiante.

Ensuite nous sommes allés au spectrophotomètre pour mesurer la DO des tubes 1,2 et 3 à 600 nm
(nous avons préalablement fais un blanc)
Nous avons choisis 600 nm comme longueur d’onde car c’est la ou il y a le pic d’absorbance du
DCPIP sous sa forme dite oxydé.

Nous commencerons à mesurer les autres mesures de DO au spectrophotomètre lorsque le tube 6

sous la lumière forte perd sa coloration bleue.

Calcul DO initiale :

Les tubes 1, 2 et 3 sont des tubes témoins permettant de connaître la DO ou du DCPIP pour le tube
1 et les tubes 2 et 3 permettent de connaître la DO des chloroplastes selon leur volume (0,5 ml ou 1
ml) dans les tubes
D’après la loi de Beer-Lambert l'absorbance d'un mélange est égale aux sommes des absorbances de
ses composants

DO tube 4 = DO tube 1 + DO tube 2 = 0,732

DO tube 5 = DO tube 1 + DO tube 2 = 0,732
DO tube 6 = DO tube 1 + DO tube 3 = 0,768
DO tube 7 = DO tube 1 + DO tube 3 = 0,768
DO tube 8 = DO tube 1 + DO tube 3 = 0,768
DO tube 9 = DO tube 1 + DO tube 3 = 0,768
Modification de la DO = DO intiale – Do mesurée
Tube Composition et Conditions DO DO Modification de
initiale calculée mesurée la DO
1 DCPIP, pas de chloroplastes X 0,710 X
2 0,5mL de suspension de X 0,022 X
chloroplastes, pas de DCPIP
3 1mL de suspension de X 0,058 X
chloroplastes, pas de DCPIP
4 0,5mL de suspension de 0,732 0,497 0,235
chloroplastes éclairement fort
5 0,5mL de suspension de 0,732 0,650 0,082
chloroplastes, éclairement faible
6 1mL de suspension de 0,768 0,295 0,473
chloroplastes, éclairement fort
7 1mL de suspension de 0,768 0,518 0,250
chloroplastes, éclairement faible
8 1mL de suspension de 0,768 0,742 0,026
chloroplastes, éclairement fort,
DCMU
9 1mL de suspension de 0,768 0,654 0,114
chloroplastes, éclairement faible,
DCMU

Interprétation :

°tube 1 :
Le tube 1, ou tube témoin ne change pas de couleur, il ne contient pas de suspension mère de
chloroplastes donc le DCPIP contenu dans le tube reste sous sa forme oxydé.

°tube 2 et 3
C'est deux tubes ne contiennent pas de DCPIP, ils nous servent donc principalement à calculer les
DO initiales
En revanche, on remarque que plus le volume de suspension de chloroplastes est élevé plus la DO
mesurée est élevé. Par exemple, pour le tube 2 (0,5 ml de suspension mère) on obtient 0,022, tandis
que pour le tube 3 à 1mL de suspension mère on obtient 0,058

°tube 4,5,6 et 7
Les tubes 4, 5, 6 et 7 ne possède pas de DCMU, mais ils contiennent du DCPIP. Ces 4 tubes ont le
même volume de DCPIP.
Seul le volume de suspension mère est différent, 1mL pour le tube 6 et 7 et seulement 0,5mL pour le
tube 4 et 5.
On remarque que la modification de la DO des tubes 6 et 7 est plus importante que celle des tubes 4
et 5. On peut donc en déduire que la quantité de suspension mère est à l'origine de ce résultat. Plus
la concentration de suspension mère est élevée plus la quantité de photosynthèse est importante

Ces 4 tubes ont également été mis à la lumière, à l’éclairement fort pour le tube 4 et 6 et à
l’éclairement faible pour le tube 5 et 7.
On remarque que la modification de la DO Et plus importante pour les tubes quatre et six que pour
les tubes cinq et sept.
Nous remarquons également que la DO mesurée des tubes 5 et 7 est plus élevée que celle des tubes
4 et 6.
On sait que plus la lumière est dite forte plus la réaction de Hill est importante, plus l'absorption est
faible. Ce qui explique le fait que les DO mesurée des tubes 5 et 7 soit plus élevée que les DO
mesurée des tubes 4 et 6 car les tubes 5 et 7 été exposés à un éclairage fort. Donc la photosynthèse à
pu ce faire.

°tube 8 et 9
Ces tube quant à eux, possède du DCMU donc le DCPIP reste sous forme oxydé ce qui veut dire,
pas de photosynthèse, car on sait que le DCMU casse la chaîne de transporteur d'électron.
L’éclairage fort ou ambiant ne fait donc ici aucune modification.

Conclusion partielle:
On n'en conclut donc que la réaction de Hill est d'autant plus importante et fonctionnel lorsque l'on
a un éclairage fort et que le DCPIP n'est pas inhiber par le DCMU. De plus, plus il y a de
suspension mère, donc de chloroplastes, plus la photosynthèse est importante.

Conclusion générale:

Pour finir, avec ce TP on peut dire que pour qu’il y est photosynthèse, on a besoin de la présence de
chloroplastes (qui présente l'élément photosynthétique soit : la chlorophylle) et de lumière
Nous savons également que lors de la photosynthèse, il y échange de protons et d’électrons.
Donc, Robert Hill a mis en évidence cette réaction en utilisant du DCPIP qui prouve la présence de
protons et d’électrons.