Département : Sciences de la Vie

Filière d’ingénieur : Management de la qualité et la sécurité de

la production Agro-alimentaire

Compte rendu des travaux pratiques de la biochimie

métabolique

Réalisé par les étudiantes :

AOBAD Soumia
ERRAMI Kaoutar

Année universitaire : 2022-2023

Introduction :
L'uréase est un enzyme qui divise l’urée (catalysant l'hydrolyse de l'urée) en ammoniac et en
dioxyde de carbone ou en carbamate d'ammonium et carbonate ; étant donné que la réaction
se déroule en solution aqueuse, des ions carbonate d'hydrogène se forment également dans
certains cas.

Les deux réactions types sont :

 H2N-CO-NH2 + H2O → 2 NH3 + CO2.

 H2N-CO-NH2 + 2 H2O → 2 NH4+ + CO32-.

L'hydrolyse de l'urée a lieu en deux étapes. Dans la première étape, de l'ammoniac et du

carbamate sont produits. Le carbamate s'hydrolyse spontanément et rapidement en ammoniac
et en acide carbonique. L'activité uréase augmente le pH de son environnement lorsque
l'ammoniac est produit, qui est basique.

L'uréase appartient au groupe des amidases et se trouve souvent dans les graines de plantes,
les bactéries, les crabes et les mollusques bivalves marins.

TP 1 : Extraction de l’uréase, mesure de son activité enzymatique

en fonction du temps et dosage des protéines d’extrait

Objectif :
Le but principal de ce travail pratique c’est l’extraction de l’enzyme uréase à partir des grains
de Soja, et la mesure de l’activité enzymatique de cet enzyme. Pus le dosage des protéines de
l’extrait.

I. Extraction de l’uréase à partir de la graine de soja

Mode opératoire :

L'extraction de l’uréase sera faite à partir de la graine de soja, selon le mode opératoire
suivant :

Tout d’abord, nous avons pesé 5g de la farine de soja, puis les mettre dans un mortier ; nous
avons ajouté doucement 15 ml d’eau distillée en mélangeant au fur et à mesure de l’ajout ;
ensuite on a laissé la préparation gonfle pendant quelques minutes et on a ajouté 20 ml d’eau
distillée. Toute ce processus est effectué dans la glace.

La glace est utilisée pour éviter la dénaturation de l’enzyme et toute réaction enzymatique,
puisque le surnageant contient non seulement l’uréase, mais aussi autres enzymes.

En fin, nous avons mets la farine dans la centrifugeuse (7500 rpm pendant 15 minutes)

Après 15 minutes ;

Nous avons récupéré le surnageant sous la couche de graisse et au-dessus du culot dans une
éprouvette de 30 ml et on 'a mesuré le volume recueilli.
 II. La mesure de l’activité enzymatique

Mode opératoire :

Dans un bécher de 100 ml, on a mets 1 ml d’extrait protéique et 38 ml d’eau distillée sous
une agitation moyenne, on mesure le pH à T0, par l’électrode de pH-mètre.

Ensuite, nous avons ajouté 1ml d’urée, et à partir de ce moment chaque 15 secondes on
mesure à nouveau le pH de la solution, pendant une période de 15 minutes.

Résultats et interprétations :

temps 0 0,15 0,3 0,45 0,6 1,15

pH 6,73 6,83 6,92 7,02 7,13 7,22

temps 1,3 1,45 2 2,15 2,3 2,45

pH 7,31 7,4 7,48 7,55 7,61 7,67

Temps 3 3,15 3,3 3,45 4

pH 7,72 7,77 7,81 7,85 7,88

Temps 4,15 4,3 4,45 5

pH 7,91 7,94 7,96 7,98

 Le calcul de la vitesse de réaction :

On a selon les données la relation suivante :

ΔpH de 0.01 : 1 unité uréase pendant une minute

Donc ;

Selon le tableau en dessus on a :

Pendant 15 seconds ΔpH : 6,83-6.73 : 0.1 équivalent à 10 unités uréase.

Pendant 30 seconds ΔpH : 6.92-6.73 : 0.19 équivalent à 19 unités uréase.

Alors Δ unité uréase : 19-10 : 9 unités uréase

Donc ;

Δ 𝑢𝑛𝑖𝑡 é 𝑢𝑟 é 𝑎𝑠𝑒 19− 10

La vitesse enzymatique : : : : 0.6 unité uréase / s
Δ 𝑡𝑒𝑚𝑝𝑠 30− 15

ph
8.5

7.5
Ph

6.5

6
0 0.150.30.450.61.151.31.45 2 2.152.32.45 3 3.153.33.45 4 4.154.34.45 5

Temps

Courbe de variation de pH en fonction de temps

A partir de la courbe en dessus, nous constatons une augmentation de pH en fonction de

temps, et cela grâce à la production de l'ammoniac et du CO2, qui alcalinisent le milieu

 Le calcul de nombre des unités uréase :

ΔpH de 0.01 : 1 unité uréase pendant une minute

Donc ;

Pendant 5 minutes on ΔpH : 7,98-6.73 : 1,25 unité uréase, équivalent à 125 unités uréase

III. Dosage de protéines de l’extrait de soja par méthode de Lowry

Mode opératoire :
 La gamme d’étalon Protéines à doser
Numéro de tube 1 2 3 4 5 6 7 8
Solution x 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 0 0
Solution G 0 0 0 0 0 0 0.5 1
H2O 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.5 0
Réactif D Dans chaque tube mettre 2.5 ml, agiter et attendre 10 minutes
Réactif E Dans chaque tube mettre 0.5 ml, agiter immédiatement
Incubation 30 minutes à l’obscurité
Absorbance 0 0.02 0.04 0.065 0.082 0.11 0.038 0.116
Quantité de 0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.0086 0.026
protéine

Résultats et interprétations :

Courbe de la variation de densité en fonction de quantité de protéine

 Calcul de la concentration de la solution X dans tube 7 et 8

Tube 7 :
Selon la courbe d’étalonnage on a ;
La quantité de protéine dans la solution X est 0.0086 mg dans 0.5 ml
Donc la concentration en protéines de la solution X est 0.0086 mg /0.5 ml, équivalent à
0.0172 g/l.
Et on a dilué la solution 20 fois, donc la concentration : 0.344 g/l
Tube 8 :
Selon la courbe d’étalonnage on a ;
La quantité de protéine dans la solution X est 0.026 mg dans 1 ml
Donc la concentration en protéines de la solution X est 0.026 mg /1 ml, équivalent à 0.0232
g/l.
Et on a dilué la solution 20 fois, donc la concentration : 0.52 g/l

TP 2 : Mesure de l’activité enzymatique d’uréase en fonction de

l’augmentation de concentration d’enzyme
Objectif :

L'objectif de ce TP c’est la détermination de l’influence d’augmentation de concentration

d’enzyme sur l’activité enzymatique
Mode opératoire :
Dans un bécher de 50 ml, on utilise 4 volumes différents d’extrait protéique :
1) 0.5 ml d’extrait protéique et 28.5 d’eau distillée
2) 1 ml extrait protéique et 28 ml d’eau distillé
3) 2 ml extrait protéique et 27 ml d’eau distillé
4) 3 ml extrait protéique et 26 ml d’eau distillé
Dans chaque fois, on met la solution sous agitation, et on mesure le pH initial à T0.
Et on ajoute ensuite 1 ml d’urée et on continu à mesurer le pH Pendant 5 minutes
Résultats et interprétations :
Pour 0.5 ml
temps 0 0,15 0,3 0,45 0,6 1,15

pH 6,64 6,67 6,77 6,85 6,97 7,05

Temps 1,3 1,45 2 2,15 2,3 2,45 3

pH 7,12 7,18 7,23 7,28 7,33 7,36 7,38

 Temps 3,15 3,3 3,45 4 4,15 4,3 4,45 5

pH 7,41 7,46 7,46 7,47 7,47 7,48 7,48 7,49

Courbe de variation de pH en fonction de temps pour 0.5 ml

Pour 1 ml
temps 0 0,15 0,3 0,45 0,6 1,15 1,3
pH 6,65 7,05 7,26 7,37 7,47 7,56 7,64

Temps 1,45 2 2,15 2,3 2,45 3 3,15

pH 7,68 7,74 7,78 7,83 7,87 7,89 7,93

Temps 3,3 3,45 4 4,15 4,3 4,45 5

pH 7,95 7,98 8 8,01 8,03 8,04 8,05
 Courbe de variation de pH en fonction de temps pour 1 ml

Pour 2 ml

Temps 0 0,15 0,3 0,45 0,6 1,15 1,3

Ph 6,73 7 7,26 7,45 7,6 7,73 7,82

Temps 1,45 2 2,15 2,3 2,45 3 3,15

pH 7,9 7,96 8,01 8,05 8,08 8,11 8,14

Temps 3,3 3,45 4 4,15 4,3 4,45 5

pH 8,16 8,18 8,2 8,21 8,23 8,24 8,26

 Courbe de variation de pH en fonction de temps pour 2 ml

Pour 3ml
Temps 0 0,15 0,3 0,45 0,6 1,15 1,3

pH 6,78 6,91 7,1 7,22 7,4 7,56 7,7

Temps 1,45 2 2,15 2,3 2,45 3 3,15

pH 7,8 7,91 8,01 8,09 8,14 8,2 8,25

Temps 3,3 3,45 4 4,15 4,3 4,45 5

pH 8,29 8,32 8,34 8,37 8,38 8,4 8,41

Courbe de variation de pH en fonction de temps pour 3 ml

 Calcul de vitesse initiale de la réaction :

 Pour 0.5 ml
On a pendant 15 seconds
1 unité uréase équivalent à une variation de 0.01 pH
3 unités uréase équivalent à une variation de 0.03 pH
Pendant 30 seconds
1 unité uréase équivalent à une variation de 0.01 pH
10 unités uréase équivalent à une variation de 0.1 pH
10− 3
Donc la vitesse : : 0.46 uu/s
30− 15
 Pour 1 ml
On a pendant 15 seconds
1 unité uréase équivalent à une variation de 0.01 pH
41 unités uréase équivalent à une variation de 7.05-6.64 pH
Pendant 30 seconds
1 unité uréase équivalent à une variation de 0.01 pH
62 unités uréase équivalent à une variation de 7.26-6.64 pH
62− 41
Donc la vitesse : : 1.4 uu/s
30− 15
 Pour 2 ml
On a pendant 15 seconds
1 unité uréase équivalent à une variation de 0.01 pH
46 unités uréase équivalent à une variation de 7.05-6.64 pH
Pendant 30 seconds
1 unité uréase équivalent à une variation de 0.01 pH
82 unités uréase équivalent à une variation de 7.46-6.64 pH
82− 46
Donc la vitesse : : 2.4 uu/s
30 −15
 Pour 3 ml
On a pendant 15 seconds
1 unité uréase équivalent à une variation de 0.01 pH
56 unités uréase équivalent à une variation de 7.05-6.64 pH
Pendant 30 seconds
1 unité uréase équivalent à une variation de 0.01 pH
107 unités uréase équivalent à une variation de 7.71-6.64 pH
107− 56
Donc la vitesse : : 3.4 uu/s
30 −15
  Calcul de la quantité de protéines enzymatiques :
Pour chaque volume on a calculé la quantité de protéines
Volume 0.5 ml 1 ml 2 ml 3 ml
Quantité de 0.172 mg 0.52 mg 1.4 mg 1.56 mg
protéines

La courbe de la variation de la vitesse en fonction de la quantité de protéines