TD 3 : DENOMBREMENT ET CROISSANCE BACTERIENNE

I- DENOMBREMENT APRES CULTURE (DENOMBREMENT

INDIRECT)

1- La Numération sur Gélose en boite de Pétri

1
 2- Dénombrement des bactéries en milieu liquide
Méthode statistique du nombre le plus probable NPP
Principe :
Jusqu’à présent, on utilisait une méthode générale pour interpréter le dénombrement de
bactéries en milieu liquide dans un aliment. Ainsi :
• Si le tube est + = il y a au moins une bactérie / mL de la dilution considérée
• Si le tube est - = il y a moins de une bactérie / mL de la dilution considérée

La méthode du NPP (Nombre le Plus Probable) ou MPN (Most Probable Number)

Elle utilise une méthode statistique pour connaître le nombre (le plus probable) de
bactéries présentes dans 1 mL de dilution.
Cette technique utilise plusieurs tubes par dilution (2, 3, 4 ou 5) et on compare les
résultats à une table statistique = la table de Mac Grady qui donne le NPP sur la dilution
considérée. ð Il s’agit donc d’une interprétation probabiliste

Exercice  I :
L'analyse bactériologique d'une urine infectée donne le tableau de résultats suivant, sachant
que l'on a ensemencé 0,1 ml de chaque dilution par boite de milieu de culture.

DILUTIONS 10-1 10-2 10-3 10-4

BOITE 1 INC 490 95 2
BOITE 2 INC 501 110 0
BOITE 3 INC 520 120 30

a) Définissez une colonie.

b) Quelle dilution doit-on utiliser pour réaliser le dénombrement ?
c) Déterminez le nombre de bactéries par ml d'urine.
d) Le dénombrement bactérien sur le même échantillon d'urine, par la méthode directe au
microscope optique, a donné 15.105 bactéries /ml, comparer les deux résultats et interpréter.

Exercice II :

Le dénombrement des bactéries ammonifiantes dans des suspensions de trois sols différents a
été réalisé par la méthode du NPP. A partir de chaque sol une suspension de 1g de sol broyé dans 10
ml d'eau physiologique stérile a été préparée. Des séries de dilutions de 10 -2 à 10-7 ont été préparées
dans l’eau physiologique à partir de chaque suspension de sol. Ensuite, 1 ml de chaque dilution
préparée (10-1à 10-7) a été ensemencé dans un milieu de culture spécifique, à raison de trois répétitions
pour chaque dilution. Après incubation à 28°c pendant 15 jours, les tubes positifs sont détectés par une
coloration orange, après addition du réactif de Nessler. Les résultats obtenus sont représentés ci-
dessous :

DILUTIONS 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7

SOLUTION 1 +++ +++ +++ +++ ++- +-- ---

SOLUTION 2 +++ +++ +-- --- --- --- ---

SOLUTION 3 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++

1) Calculez pour chaque type de sol, le nombre de germes par gramme de sol.
2) quel serait le résultat si le volume ensemencé était de 0,1 ml ?.

2
 • Tableau de Mac Grady pour une série de trois tubes (Indice NPP)

Nombre Caractéristique Nombre de Cellules. Nombre Nombre de Cellules

Caractéristique
000 0,0 222 3,5
001 0,3 223 4,0
010 0,3 230 3,0
011 0,6 231 3,5
020 0,6 232 4,0
100 0,4 300 3,0
101 0,7 301 3,5
102 1,1 302 4,0
110 0,7 310 2,5
111 1,1 311 4,0
120 1,1 312 11,5
121 1,5 313 16,0
130 1,6 320 9,5
200 0,9 321 15,0
201 1,4 322 20,0
202 2,0 323 30,0
210 1,5 330 25,0
211 2,0 331 45,0
212 3,0 332 110
220 2,0 333 140
221 3,0

II- CROISSANCE BACTERIENNE

3
EXERCCICE N° I

1- On réalise une expérience de croissance bactérienne avec une souche d' Escherichi coli qui
exige la guanine comme facteur de croissance. L'expérience est réalisé à 37 C°, à partir d'une
culture de 24 h dans un milieu contenant de la guanine.
On étudie les variations du nombre de bactéries par ml de milieu de culture en fonction du
temps. Soit N ce nombre.

0 1 2 3 4 5 6 7 8
Temps en h

Log 10N 2.0 2.0 2.0 2.0 2.8 3.5 4.4 5.3 6.1

Temps en h 9 10 11 12 13 14 15 16 17

Log 10N 6.8 7.0 7.0 7.0 7.0 7.0 6.9 6.5 6.7

a- Tracer la courbe représentative de la fonction log 10 N= f (t ). Quel avantage présente

cette courbe sur la courbe N = f (t ) ?.
b- Caractériser chacune des phases de la croissance d'Escherichia coli dans le milieu utilisé.
c- Calculer le taux de croissance pendant la phase exponentielle. En déduire la valeur du
temps de génération pendant cette même phase. On prend : log 10 2= 0,3.

2 - Le taux de croissance en phase exponentielle est mesuré pour des concentrations

différentes de guanine, dans une série d'expériences, en utilisant la même souche et le même
milieu de base que précédemment. Pour chaque
expérience, la guanine reste le facteur limitant. Soit µ le taux de croissance en phase
exponentielle,

Expérience Guanine en ug.ml-1 µ (div. h-1 )

1 0.1 0,80
2 0.2 1.62
3 0.3 2.45
4 0.4 3.20
5 0.5 3.58
6 0.6 3.71
7 0.7 3.73
8 0.8 3.73
---
a- Tracer la courbe représentant les variations du taux de croissance en phase exponentielle
en fonction de la concentration en guanine et commenter l'allure de celte courbe.

b- En déduire la concentration de la guanine dans le milieu de culture utilisé au paragraphe

A. On admettra qu'au paragraphe A , la guanine est aussi le facteur limitant de la croissance .

EXERCICE N° II

4
1 - On suit la croissance d' Escherichia coli sur un milieu synthétique non renouvelé, en
évaluant la population bactérienne au spectrophotomètre. La figure: 1 montre la croissance de
cette bactérie sur milieu synthétique contenant soit du glucose, soit du xylose, l'inoculum
provenant d'une culture en phase exponentielle, prélevé sur milieu contenant du glucose.
Commenter l'allure de cette courbe.

2 - A partir de la culture en phase exponentielle en milieu synthétique glucosé, on inocule le

milieu synthétique additionné de glucose et xylose. La croissance s'effectue selon la courbe de
la figure 2.

Commenter l'allure de cette courbe.