République Algérienne Démocratique et Populaire

Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

Université Mohamed Sedik Ben yahia – Jijel
Faculté des Sciences de la nature et de la vie
Département de Biologie moléculaire et cellulaire
Option : Science Pharmacologie
2ére année master

Rapport de TP du module
TBMC
Titre de TP :
Electrophorèse d’ADN sur gel d’Agarose.

Présenté par : Encadrée par :

*Djeddai douaa. Mme : Chouikh N.

*Touil basma.

Année universitaire : 2021/2022

Sommaire :

Introduction ………………………………………………………………………………..….....1.

I. Objectif…………………………………………………………………………………………2.

II. Principe…………..………………………………………………………………………….…2.

III. Partie bibliographie…………………….…………………………………...…………….......2.

IV. Matériel et méthode…………………………………………………………………………..5.

1. Matériel………………………………………………………………………….…….5.
2. Matériaux ……………………………………………………………………………..5.
3. Méthode….………………………………………………………………….………...5.
3.1. Préparation de tampon TBE ………………..………………………………....5.
3.2. Préparation de gel d’Agarose………………………………………………….8.
3.3. Préparation de l’échantillon…………………………………………………...10.
3.4. Migration électro-phorétique..……………….……………………………..…11.

V. Résultat et discussion…………………………………………………………………………13.
 Résultat …………………………………………………………………………………..13.
 Discussion………………………………………………………………………………..14.
 La réponse des questions…………………………………………………………………14.

Conclusion………………………………………………………………………………….……..17.

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Introduction :

- Les multiples applications scientifiques et technologiques qui impliquent l'étude de

l'ADN nécessitent des techniques différentes. Parmi elles, l'électrophorèse sur gel d'agarose
ou de polyacrylamide est une technique de base au laboratoire de biologie moléculaire. Elle
est utilisée-soit à des fins analytiques: pour séparer et identifier des fragments d'ADN en
fonction de leur charge, de leur taille et de leur forme, ou pour en estimer la quantité,soit à des
fins préparatives, pour purifier un fragment d'ADN de taille connue. La taille des fragments
qu'il est possible de séparer est comprise entre 0,2 et 50 kb. Les fragments d'ADN sont
facilement détectés sur le gel grâce à un colorant fluorescent, le bromure d'éthidium(BEI). On
peut ainsi visualiser en lumière UV des quantités très faibles d'ADN (de l'ordre de 5-10
ng).L'électrophorèse en gel d'agarose est donc une technique très sensible; elle est de plus
rapide et simple à mettre en œuvre.

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 I. L’objectif :
 Réaliser et analyser une électrophorèse d'ADN sur gel d’agarose pour séparer l'ADN
isolé des bactéries E .coli.

II. Príncipe :
 La technique de l'électrophorèse sur gel d'agarose est basée sur la séparation d'ADN
chargés négativement selon leurs poids moléculaire sous l'effet d'un champ électrique.
Cette séparation s'effectue à travers la matrice du gel d'agarose et dans un tampon TBE
.De plus, on besoin un tampon de charge pour réaliser les dépôts, un agent intercalant
Bromure d'Ethidium (BET) pour visualiser la migration, aussi un marqueur de taille
Permet d'estimer la quantité d'ADN déposée et déterminer la taille d'un fragment. Les
molécules de plus petites tailles se déplacent plus rapidement et migreront plus loin
que les molécules de tailles supérieures. La charge relative des fragments étant la
même, c’est essentiellement l’effet de tamisage exercé par le gel qui influe sur la
migration. La vitesse de déplacement diminue donc avec la taille des fragments, celle-
ci étant exprimée en nombre de paires de bases (Pb) ou en Kb (1 Kb = 1000 Pb).

III. Partie bibliographie :

 L'électrophorèse d’ADN sur gel d’Agarose et leurs applications :

- L’électrophorèse est une technique séparative. Elle est utilisée le plus souvent dans
un but analytique mais également parfois pour purifier des molécules solubles. Elle
n’est donc pas adaptée à la séparation des lipides. Le principe consiste à soumettre
un mélange de molécules à un champ électrique ce qui entraîne la migration des
molécules chargées. En fonction de différents paramètres (charge, masse, forme,
nature du support, conditions physico-chimiques) la vitesse de migration va être
variable, ce qui permet la séparation des différentes molécules.
- Pour la séparation de l'ADN on utilise l'électrophorèse sur gel d'agarose. cette
technique est séparé l'ADN selon la charge, la taille et la forme.
- Il existe plusieurs applications de l'électrophorèse d'ADN sur gel d'agarose. Parmi
eux:
 Des fins préparatoires pour purifier un fragment d'ADN de taille connue.

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 Des fins analytiques pour :

 Estimation du poids moléculaire de fragment d'ADN après une

digestion par des enzymes de restriction.
 Analyse d'ADN ou d'ARN après une augmentation par PCR.
 Séparation de fragments ADN digérés avant Southern blot ou d'ARN dans le
cas de Northern Blot.
 L’électrophorèse sur gel d’agarose peut être utilisée par la police scientifique pour
relier, par exemple un échantillon prélève sur une scène de crime à un suspect.
 Pour analyser les échantillons d’ADN pour les tests de maternité ou encore dans le
cadre du diagnostic médical.
 Clonage moléculaire :
- L'application la plus fréquente de l'électrophorèse sur gel d'agarose est le
clonage moléculaire. Il s'agit de la construction de molécules d'ADN
recombinant qui sont intégrées dans divers organismes pour créer des
modifications génétiques. Le but de ces modifications varie et peut inclure la
production d'une biomolécule spécifique, par exemple la production d'insuline
dans la fabrication pharmaceutique.
 Empreintes génétiques :
- L’électrophorèse sur gel d'agarose peut être une technique puissante pour
identifier les individus en fonction de leur code génétique. Le génome humain
contient de nombreuses régions de courtes répétitions, dont le nombre varie
uniquement d'un individu à l'autre. En ciblant ces régions avec des amorces
PCR spécifiques, un profil de bande sur un gel d'électrophorèse correspondant à
ces régions peut être créé qui est unique à cet individu. Cette technique, connue
sous le nom d'empreintes génétiques, peut être utilisée dans des domaines tels
que la médecine légale pour les enquêtes criminelles, la généalogie et les tests
de filiation.
 Diagnostique :
- L'électrophorèse peut être utilisée dans une gamme de tests de diagnostic,
principalement dans le dépistage de troubles génétiques, mais également pour
identifier des protéines anormales. L'ADN peut être extrait de patients, voire
d'embryons pour un dépistage préimplantatoire, et soumis à une PCR et à une

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 électrophorèse sur gel d'agarose pour confirmer la présence de certains gènes ou
anomalies génétiques. L'électrophorèse sur gel d'agarose peut également être
appliquée à certaines protéines, par exemple pour étudier la chimie du sang afin
de déterminer l'adéquation de certains traitements médicaux.
 Applications industrielles :
- La technique électrophorétique est également utilisée dans des industries telles
que les sciences alimentaires et l'exploitation minière. La plupart des
composants alimentaires peuvent être examinés avec cette technique, en
particulier les protéines, les ions, les acides organiques, les sucres et divers
produits chimiques végétaux. L'application de l'électrophorèse dans l'industrie
alimentaire est de sauvegarder la qualité des produits alimentaires. Il est utilisé
dans l'analyse de nombreuses parties des aliments, en tant que composants
ioniques ou non ioniques de l'échantillon. Il est également utilisé pour évaluer
les phénols, les polyphénols, les pigments, les toxines, les pesticides, les
vitamines, les additifs, les ions, les composés chiraux et les composés dans les
aliments, les interactions alimentaires et traitement.
- Dans les industries manufacturières, le dépôt électrophorétique est utilisé pour
revêtir des produits métalliques. Cela n’est dû au fait que certains matériaux
comme les pigments et les colorants sont électriquement conducteurs sur une
surface métallique. Cela inclut, par exemple, l'application de peinture sur des
pièces automobiles, des appareils électroménagers et différents types de
fixations. Cela peut également aider à réduire les coûts de forage et de
construction de puits. En particulier, il peut faciliter le nettoyage du matériel.
Cela peut également réduire la consommation d'énergie lorsque le fluide de
forage et le ciment sont pompés dans le puits.
 Les applications cliniques :
- L’électrophorèse peut être utilisée pour détecter l'impureté et la concentration
des antibiotiques et des vaccins, ainsi que pour déterminer plus précisément le
dosage des antibiotiques. Dans les tests de vaccins, il est utilisé pour tester la
pureté et la concentration de vaccins avec différents niveaux et types d'anticorps
pour trouver la meilleure version possible d'un seul vaccin.
- Il est également utilisé pour détecter la présence de protéines quantitativement
ou qualitativement anormales telles que dans le sérum et les lipoprotéines, le

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 diagnostic des hémoglobinopathies et de l'hémoglobine A1c, la détermination
des phénotypes et des micro-hétérogénéités des protéines sériques, le
génotypage des protéines de l'analyse ApoE pour la maladie d'Alzheimer
(protéine polymorphe), surveillance de petites molécules (médicaments,
stéroïdes), analyse du liquide céphalo-rachidien, analyse d'urine, etc.

IV. Matériel et méthode :

1. Matériel :

 Balance.
 Plaque UV.
 Virrerie de laboratoire (bécher, tubes…).
 Plaque chauffante avec agitation.
 Appareil d’électrophorèse.
 Micropipettes 10-100µl et les embouts correspondant.

2. Matériaux :

 Molécule d’ADN.
 Gel d’Agarose.
 Tampon TEB (Tris, acide borique, EDTA).
 Bromure d’éthidium.
 Tampon de charge.

3. Méthode :

3.1. Préparation de tampon TBE :

 Nous avons préparé le tampon TBE par « Tris 89mM, acide borique 89mM, EDTA
2mM, a PH = 8

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 / [ ] Molaire mol/l M g/mol [ ] Massique g/l

Tris 89 mM 121.14 10.78 g/l

Acide borique 89 mM 61.83 5.50 g/l

EDTA 2 mM 292.24 0.58 g/l

 L’explication :

: [ ] Molaire = = = /.
.

[ ] Massique = ⁄.
[]
[ ] Molaire = .

[ ] Massique = [ ] molaire × M.

× .
Donc: - Tris : [ ] Massique = = 10.78 g/l. 1L
( )

× .
- Acide borique : [ ] Massique = = 5.50 g/l. 1L
( )

× .
- EDTA : [ ] Massique = = 0.58 g/l. 1L
( )

 Dans un bécher nous avons mis :

5.50 g

0.58 g
+ 1L de l’eau distillée PH = 8
10.78 g

TBE

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 NB : Nous avons mis quelque goutte de l’Hcl pour régler le PH
- Lorsque vous avez besoin d’une valeur spécifique de PH, vous ne devez pas
placer la quantité nécessaire d’eau à la fois (1 L). Vous mettez d’abord 990 ml
et vous mesurez le PH.
- Si vous trouvez que le PH est supérieur à 8, ajouté au mélange l’Hcl. Et si vous
trouvez que le PH est inférieur à 8, vous ajoutez l’NAOH.
- Après cela, si vous trouvez la quantité de solution pas jusqu’à 1 L, vous
augmentez l’eau jusqu’à ce que vous obtenez la valeur spécifiée.

Figure1:Les composants du tampon TBE. Figure2: Tampon TBE avec 1L de l'eau distillée

 Nous avons mis le mélange, sur la plaque chauffante avec l'agitation et le PH=8.

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3.2. Préparation de gel d’Agarose :

 Avant de commencer, nous avons nettoyé les supports de gel et les peignes
peignes.

 D’abord, Nous avons pesé 2 g d'agarose et l'avons ajouté à 200 ml de tampon de

migration TBE que nous avons préparé précédemment.

 NB : L’agarose est un polymère à base d’agar purifié. Le

Le pourcentage d'agarose
dépendre de la taille des molécules à analyser, plus les molécules à séparer et analyser
sont de grand taille plus on va choisir en pourcentage d'agarose faible, est plus les
molécules à séparer et analyser sont petit on va augmenter le pourcentage d'agarose.

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 Puis nous avons fait fondre l’agarose sur la plaque chauffante avec l'agitation jusqu’à
l’ébullition et obtenir une phase homogène.

 Ensuite, nous l'avons laissé refroidir pour que le flacon puisse être ramassé à mains
nues, puis nous y avons ajouté 30µL/200ml de bromure d'éthidium et avons bien
mélangé le tout. (le BET est un produit dangereux parce qu’il s’intercale dans l’ADN,
donc cancérigène aussi ces manipulations sont réalisée avec des gants, et permettent
l’identification et la visualisation de brins d’ADN en électrophorèse).

 NB : Le BET (agent intercalant) est un produit dangereux car il s'insère dans l'ADN,
donc c'est aussi un cancérigène. Ces manipulations se font avec des gants, et permettent
l'identification et la visualisation de brins d'ADN en électrophorèse).

 Pendant que l’agarose refroidit, nous avons placé les joints avec la cuve pour fermer le
support de gel, en plaçant le peigne à 1 mm du bas et à environ 1 cm de l’extrémité de
la charge.

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 Couler ensuite lentement l'agarose, encore liquide, sur 3 à 5 mm d’épaisseur.

 On laisse refroidir, puis on retire le peigne et les joints (lors du retrait du peigne, on
prend soin de ne pas endommager les puits), et le gel est prêt à déposer les
échantillons.

Figure3: Un gel d'agarose

solidifié après le retrait du
peigne.

 Submerger le gel dans le tampon TBE à l'intérieur de la cuve (versant le tampon

délicatement et très lentement) pour réaliser la migration.

3.3. Préparation de l’échantillon :

 D’abord, on a un tampon de charge qui contient : Bleu de bromophénol 0.25%

Sucrose 40%
Glycérol 30%

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 NB :
 Bleu de bromophénol, Sucrose : suivie de l’avancée des échantillonne dans le gel.
 Glycérol : augmentation de la viscosité de l’échantillon et permet donc que
l’échantillon déposé bien en fond du puits de gel.

 Pour faciliter le chargement des échantillons dans les puits, on met 5µl du tampon de
charge avec 25µl de l’ADN, et recueilli le mélange à l’aide d’une micropipette réglée
sur le volume approprié, en changeant le cône pour chaque prélèvement.

Figure 4: Tampon de charge. Figure 5: L'échantillon d'ADN. Figure 6: Micropipette.

3.4. Migration électro-phorétique :

 Après avoir préparé la solution, nous avons rempli les puits, en nous assurant que le
fond du gel n’était pas déchiré par la pipette (Avant de déposer les échantillons, il faut
s’assurer que le gel est correctement orienté dans la cuvette de l’appareil).

 Maintenant, nous fermons la cuve et appliquons un courant aux bornes du générateur

pour que l'ADN soit transmis à l'anode.

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 Ensuite, nous le laissons migrer jusqu'à ce que le colorant de charge atteigne le bord
du gel (environ 30 minutes à 120V). Les molécules d'ADN chargé négativement,
donc la migration se fait de l'électrode négative appelle cathode vers l'électrode
positive appelée l’anode.

 Enfin, une fois que l'électrophorèse a été complété nous avons séparé l’énergie, séparé
les conducteurs et soigneusement recueilli le gel et l’avons porté sous la lampe UV. Le
bromure d’éthidium est fluorescent sous les rayons UV, ce qui permet de visualiser les
bandes d’ADN.

Figure 7: Le gel sur lampe UV.

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V. Résultat et discussion :
 Résultat :

Figure 8: Electrophorèse d'ADN sur gel d'Agarose.

 Une fois la migration terminée, nous visualisons et analysons les résultats obtenus :
Chaque bande observée dans le gel correspond à un ensemble de fragments d'ADN d'une
taille donnée. L'intensité des bandes est proportionnelle à la quantité d'ADN présente dans
l'échantillon.
Nous avons observé que les fragments d'ADN résultants sont clairement
clairement définis et de grande
taille. D'autre part, on note que la migration est faible (ces résultats ont été obtenus sans
attendre 30 minutes pour la migration, Pour cette raison la migration était faible).
Si on avait attendu 30 minutes pour analyser les
les résultats, la taille des fragments d'ADN sera
petite, la migration sera rapide et donc l'extraction d'ADN serait viable.

 Résultats possibles visibles après 30 minutes de migration, comme suit:

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 Discussion :

- En biologie moléculaire on utilise souvent d'ADN circulaire plasmidique est ses

de bactérie E. coli. Cet ADN peut être fragmenté par des enzymes spéciales
appelées enzymes de restriction. Ces enzyme reconnaître la séquence
spécifique de l'ADN et permettent de couper l'ADN à ses endroits précis, par
exemple l'action des enzymes de restriction sur un ADN circulaire plasmidique
de 2000Pb va conduit à l’obtention de deux fragment un petit fragment de
500Pb et un plus grand fragment de 1500Pb.
- Pour vérifié que cette coupure à bien eu lieu, nous allons effectuer une
électrophorèse sur gel d'agarose. Ainsi, les molécules d'ADN chargées
négativement migreront de l'électrode négative appelée cathode vers l'électrode
positive appelée anode.
- L'électrophorèse sur gel d'agarose va permettre de séparer les molécules d'ADN
selon leur taille, de sorte que les plus petites molécules vont migrer plus loin
dans le gel alors que les grosses molécules vont migrée moins loin ,cela est du
à la propriété du gel d'agarose et de former un maillage plus ou moins sevré
permettant le passage plus ou moins des molécules de différent taille , nous
avons que la résolution du gel dépend du pourcentage en agarose va dépendre
de la taille des molécules à analyser, Plus la taille des molécules qui sont
séparées et analysées est grande, plus le pourcentage d'agarose est faible, au
contraire plus la taille des molécules qui sont séparées et analysées est petite,
plus le pourcentage d'agarose est augmente.

 La réponse des questions :

1- L’électrophorèse sur gel d’agarose séparer les molécules d’ADN en fonction de :

- Leur charge, leur taille et leur forme. Il s’agit d’un moyen de séparation
particulièrement efficace pour des biomolécules chargées telles que l’ADN, l’ARN
et les protéines.

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 2- Au cours d’une migration d’ADN sur gel d’agarose on utilise le :

 Le bromure d'éthidium (BET): Est agent d'intercalant le plus couramment utilisé pour
colorer l'ADN dans des gels d’agarose. Lorsqu'ils sont exposés à la lumière UV, les
électrons dans le noyau aromatique de la molécule d'éthidium sont activés, ce qui
conduit à la libération de l'énergie (la lumière) que le retour des électrons à l'état
fondamental, l devient fluorescent avec une couleur rouge-orangée, 20 fois plus
intenses lorsqu'ils sont liés à ADN. Ceci permet de visualiser et d’estimer la quantité
d’ADN dans une bande d’ADN, notamment en fonction de son intensité. Mais c'est
un produit dangereux car il s'insère dans l'ADN, donc c'est aussi un cancérigène. Ces
manipulations se font avec des gants.
 Le tampon de TBE : Un tampon d'électrophorèse ou tampon de migration est un
tampon conducteur (électrolytes) mis dans les cuves d'électrophorèse pour améliorer
les conditions de migration des molécules à séparer sous l'action d'un champ
électrique.
 Le tampon de charge : Utilisés pour charger les échantillons d'ADN sur des gels
d'agarose pour l'électrophorèse sur gel. Contient un colorant et un agent de densité.
L'agent de densité sert à améliorer la densité de l'échantillon d'ADN, permettant à
l'ADN de s'enfoncer dans le fond du puits.

3- Interprétation des résultats :

 L'analyse des résultats :

- Chaque bande observée dans le gel correspond à un ensemble de fragments d'ADN
d'une taille donnée. L’intensité des bandes est proportionnelle à la quantité d'ADN
présente dans l'échantillon.
- On observe que les fragments d'ADN résultants dans les souris traité est plus
intense et de grande taille par apport à les souris témoins, donc la quantité d'ADN
présent dans les souris traité est plus grande à celle dans les souris témoin. D'autre
part, On note que la migration est importante chez la souris traitée, alors que chez la
souris témoin la migration est faible.
 Donc, en présence de cyclophosphamide, la quantité de fragments d'ADN est
très importante, ce qui signifie qu'elle induit une fragmentation de l'ADN.

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 Interprétation :
- Le cyclophosphamide (médicament anticancéreuse) est un agent alkylant
bifonctionnel de type oxazaphosphorine, appartenant à la famille des moutardes
azotées agissant après transformation dans l'organisme.
- Le cyclophosphamide agit par interaction directe sur l'ADN (acide
désoxyribonucléique) en formant des liaisons covalentes avec les substrats
nucléophiles par l'intermédiaire de ses radicaux alcoyles. Cette action entraîne des
modifications profondes chimiques ou enzymatiques de l'ADN, ainsi que la formation
de ponts alcoyles intrabrins ou interbrins, avec pour conséquence une inhibition de la
transcription et de la réplication de l'ADN aboutissant à Le blocage du cycle cellulaire
en phase G2 conduit à la mort de la cellule.

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Conclusion :

L'électrophorèse a été développée comme une méthode intéressante pendant plusieurs

décennies jusqu'à très récemment pour améliorer et adapter les processus de séparation afin de
les rendre plus pratiques à utiliser à de nombreuses fins. Ces progrès ont considérablement
amélioré la compréhension biologique des cellules individuelles, comme en témoigne
l'amélioration des connaissances sur les métabolites, les protéines, les nucléotides, etc., au
sein des sous-types cellulaires.
- L'orientation future de la recherche sur l'électrophorèse sur gel pourrait inclure la détection
d'un criblage à haute sensibilité et à haut débit de médicaments, de produits naturels et de
biomarqueurs pour le diagnostic clinique. On pense que la technologie d'électrophorèse sur
gel changera positivement la vie de millions de personnes.

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