REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

Ministère de l’Enseignement Supérieure et de la Recherche Scientifique

Université Dr Tahar Moulay de Saïda
Faculté des Sciences
Département de Biologie

2 ème Année LMD Sc biologie et biotechnologie : 2019/2020 Dr : ANTEUR DJAMEL _ Université de Saida
 Objectifs de l’enseignement :

Cette matière permet d’avoir des notions sur les méthodes appliquées à l’étude du vivant:
Méthodes Cytologiques, méthodes d’étude de la composition biochimique des cellules et les techniques
d’approche aux vivant

Parti I: Méthodologie d’étude de la morphologie des cellules

Introduction a la biologie cellulaire

La biologie cellulaire, ou cytologie, est la science qui étudie les unités structurales et fonctionnelles communes à
l'organisation de tous les êtres vivants. Une cellule représente l'unité fondamentale de tout être vivant, c'est la plus
petite portion de matière vivante qui peut s'isoler et se reproduire.
Les cellules sont de très petite taille et d’organisation très complexe. L’étude de leur structure, de leur
composition chimique et de leur fonctionnement (physiologie) a nécessité la mise au point d’outils et de
techniques appropriés qui ont été perfectionnés au fur et à mesure des progrès scientifiques et
technologiques réalisés dans divers domaines. Les progrès de la microscopie ont repoussé la frontière
entre le visible et l'invisible. Au microscope électronique, on parvient même obtenir l'image
d'atomes d'or cristallin. Aujourd'hui, la médecine, la biologie ne peuvent plus se passer du
microscope.

Pour comprendre la biologie cellulaire contemporaine, il est indispensable de se familiariser avec les
méthodes et les appareillages utilisés pour son étude.

Trois approches sont développées pour étudier les divers aspects de la cellule :
*- les techniques morphologiques.
*- les techniques chimiques et biochimiques.
*- les techniques physiologiques.
 Ces techniques sont toutes basées sur l’emploi de microscopes optiques et électroniques ; les
manipulations sont justifiées par les deux exigences de l’examen au microscope :
 Les objets à examiner doivent être minces
 Leurs différents éléments doivent présenter un certain contraste.

En cytologie de nombreux procédés préparatoires des cellules sont utilisés pour une analyse morpho
fonctionnelle. Nous traiterons dans ce chapitre que les principales techniques histologiques et
cytologiques.
Une étude fonctionnelle et de constitution physico-chimique :
•Étude cytochimique : fixation de la cellule, utilisation des colorants ayant des
affinités différentes avec les composés chimiques selon leur pH (par ex : ADN
en vert, ARN en rose) utilisation de réactions antigène-anticorps puis révélation
du complexe immun par un colorant et visualisation au microscope photonique.
•Fractionnement cellulaire : broyage puis centrifugation pour isoler les
différentes populations d'organites et étude biochimique des différents
organites.
•Culture in-vitro : permet d'étudier des cellules dans des conditions variées.
•Micro-chirurgie : permet l'ablation ou des greffes d'organites (étude des
fonctions des organites).
•Autoradiographie : précurseur radio-actif (donc détachable) incorporé par les
cellules et détecté par radiographie.
•Étude de la cinétique de la structure marquée grâce à des prélèvements
sériés dans le temps
 Ces différentes techniques ont permis de différencier deux grands types cellulaires (deux "empires") :
•les cellules eucaryotes (avec au moins un noyau)
•les cellules procaryotes (sans noyau)
Les procaryotes peuvent être divisés en deux groupes : les eubactéries et les archéobactéries.
Les travaux de Woese dans les années 75 ont permit la définition en 1977 du domaine des archéobactéries (ou
Archaea) à la suite d'observations reposant sur les comparaisons de l'ARN 16S et donc d'une division du
monde vivant en 3 domaines : eubactéries, archéobactéries et eucaryotes. Ce sont les cellules sans noyau, de
petites tailles et sans organites intracellulaires. Une région du cytoplasme renferme le chromosome bactérien
(attention, certaines eubactéries contiennent plusieurs chromosomes, qui ne sont pas toujours circulaires) : le
nucléoïde qui n'est pas délimité par une enveloppe, il baigne dans le cytoplasme.
Elles peuvent également contenir divers morceaux d'ADN également circulaires mais beaucoup plus petit et en
nombres variables (même entre les individus d'une même espèce, voire à des moments différents de la vie d'un
même individu), les plasmides. Enfin, ces cellules ne contiennent pas de cytosquelette. Pendant longtemps,
procaryote a été synonyme de bactérie, jusqu'à la séparation des eubactéries (vraies bactéries) et des
archéobactéries. Ces dernières partagent avec les eubactéries la possession d'un chromosome circulaire unique,
l'absence de cytosquelette, et très peu d'introns.
Elles disposent de particularités originales, leur membrane notamment est constituée de lipides retrouvés nulle part
ailleurs dans le monde vivant. La principale caractéristique des archéobactéries est leur capacité a survivre dans les
milieux extrêmes : eaux très acides (pH<1) ou très salées (mer morte) ou très chaudes (>120°C) ou très froides
(<0°C), bien que la plupart d'entre elles vivent dans des milieux plus cléments. Les eucaryotes sont les cellules qui
constituent la majorité de l'environnement que nous connaissons, comme toutes les plantes, les animaux et
champignons ainsi que divers espèces unicellulaires tels que les amibes ou les paramécies.
Ils sont caractérisées par la présence d'organites, sortes d'organes intracellulaire. Parmi eux, un organite est toujours
présent : le noyau, qui contient l'information génétique de la cellule. La structure génétique de ces cellules est
constituée de plusieurs brins linéaires d'ADN (les chromosomes) et par des gènes en "mosaïque", c'est à dire que les
zones codantes du gène sont découpées en morceaux (les exons) qui sont séparés par des zones non codantes (les
introns).
Elles sont souvent de grande taille. Elles vont développer un cytosquelette, sorte de charpente intracellulaire mobile
qui va permettre à la fois de se rigidifier (et de compenser leur fragilité) et de se déformer de façon contrôlée,
phénomène qui est à l'origine du mouvement des animaux, mais aussi des cellules phagocytaire et qui est donc
directement responsable de la grande variété des formes animales qui existent.
LA MICROSCOPIE
La microscopie est un ensemble de techniques permettant d'obtenir une image des structures
biologiques. Le principe est dans tous les cas le même : une onde est envoyée sur la préparation
ou émise par la préparation. Cette onde est captée par un objectif qui la concentre et passe par
un oculaire qui crée une image observable. Cette image est soit observée à l'œil nu, soit
photographiée, soit enregistrée par caméra CCD et stocké sur ordinateur pour retraitement.
Aujourd'hui la microscopie est divisée en deux grands groupes, différents par la nature de la
particule élémentaire impliquée : le microscope optique, aussi appelé photonique, parce qu'il
utilise des photons et le microscope électronique qui utilise des électrons pour étudier l'objet.
Afin d’étudier des structures on utilise un certain nombre de techniques : préparation des
coupes fines, coloration négative, ombrage métallique, cryodécapage etc….
LA MICROSCOPIE

La microscopie est un ensemble de techniques permettant d'obtenir une image des structures
biologiques. Le principe est dans tous les cas le même : une onde est envoyée sur la
préparation ou émise par la préparation. Cette onde est captée par un objectif qui la concentre
et passe par un oculaire qui crée une image observable. Cette image est soit observée à l'œil
nu, soit photographiée, soit enregistrée par caméra CCD et stocké sur ordinateur pour
retraitement.
Aujourd'hui la microscopie est divisée en deux grands groupes, différents par la nature de la
particule élémentaire impliquée : le microscope optique, aussi appelé photonique, parce qu'il
utilise des photons et le microscope électronique qui utilise des électrons pour étudier l'objet.
Afin d’étudier des structures on utilise un certain nombre de techniques : préparation des
coupes fines, coloration négative, ombrage métallique, cryodécapage etc….
 Le microscope optique

Cet instrument optique grossissant est couramment utilisé dans les laboratoires de biologie. Il permet de
regarder des organismes microscopiques ou certaines composantes minuscules, telles les cellules animales
ou végétales.
 Utilisation du microscope
Préparation
- placer le microscope près du bord de la table ou de la paillasse, afin de pouvoir observer aisément ;
- remonter entièrement le tube optique afin d'éloigner au maximum les objectifs de la platine ;
- allumer et régler la lumière pour obtenir une lumière homogène à travers l'oculaire ;
- tourner la tourelle porte-objectifs et ajuster dans l'axe du tube optique le plus faible des objectif
(x4engénéral) ;
- déposer la préparation microscopique (lame mince) au centre de la platine, en la fixant à l'aide
des valets.

Premiers ajustements

- rapprocher l'objectif de la préparation (sans la toucher) à l'aide du bouton macrométrique, sans

regarder dans l'oculaire ;
- regarder dans l'oculaire et tourner le bouton macrométrique jusqu'à l'obtention d'une image ;
- ajuster ensuite la netteté à l'aide du bouton micrométrique ;
- affiner l'éclairage en ouvrant ou en fermant le diaphragme.
 Observation

- explorer l'ensemble de la préparation et choisir une zone favorable à l'observation ;

- centrer la zone choisie dans le champ d'observation ;
- lorsque le grossissement s'avère insuffisant, passer à un objectif plus fort (en général x 10,
voire x 40). Tourner alors doucement la tourelle porte-objectifs ;
Attention, l'extrémité de l'objectif est très proche de la préparation et risque de briser la lame
mince en cas de manipulation violente ;
- régler finement la netteté de l'image avec le bouton micrométrique ;
- observer et dessiner !
À la fin de la séance

- couper l'éclairage à la fin de la séance ;

- replacer le plus faible objectif et retirer la préparation microscopique ;
- ranger le microscope dans son coffret à la fin de la séance.
La microscopie optique regroupe:
 Le microscope à fond clair
 Le microscope à fond noir
 Le microscope à contraste de phase
 Le Microscope à fluorescence

1. La microscopie à fond clair:

 Utilise des les rayons lumineux.
 Permet le grossissement de 1500-2000 fois.
 Épaisseur de coupe ( 1-5 μm).
 Observation vitale et colorée.
M.O.F.C : microscope optique à fond clair

photographie prise en
microscopie en fond clair
2. La microscopie à fond noir :
 Utilise les rayons lumineux dans un fond noir.
 Les zones de la préparation qui diffusent la
lumière apparaissent
lumineuses ( claires ) sur ce fond noir.
 Utilisé pour les éléments trop transparents.
 Les éléments observés apparaissent très
brillants ( les flagelles, les
fibres ).
 N'est pas utilisé pour l'observation d'objets
colorés.
3. La microscopie en contraste de phase :
 Cette technique permet d'observer les cellules
sans préparation
ni coloration dans leur milieu d'origine.
 Le principe est basé sur le fait que les
structures biologiques
sont transparentes (n’absorbe pas la lumière
transmise).
 Nécessite un éclairage très précis dite
éclairage de Koehler.
 A l’observation, on voit une image en noir et
blanc où les
différentes structures apparaissent bordées de
blanc d’un côté et de noir de l’autre.
4. La microscopie à fluorescence:
 Cette technique est utilisées pour
certaines molécules qui émettent de la
lumière quand on les éclaire avec une
lumière de longueur d'onde supérieure.
 On éclaire l'échantillon avec une
lumière ultraviolette, violette ou bleue.
 Consiste à utiliser une coloration
fluorescente.
Deux colorants très utilisés sont : la
rhodamine (émet une lumière rouge) et la
fluorescéine (lumière verte).
 Microscope électronique

Dans le monde de la microscopie électronique, il existe deux types principaux de techniques: la microscopie
électronique à balayage et la microscopie électronique à transmission.

Dans les deux cas, un faisceau d’électrons est envoyé sur l'échantillon pour le sonder, mais les deux techniques
diffèrent quant à l’information qui est perçue par le microscope, et l'usage qui peut être fait du microscope.
Microscope électronique en transmission

Le MET est formé d’une colonne

d’environ 1,5 à 2 m de hauteur. Le
canon à électrons, situé au sommet,
produit un faisceau d’électrons qui
traverse une coupe ultrafine de
l’objet à observer (une cellule par
exemple). Les électrons du faisceau
sont déviés ou focalisés grâce à
des électro-aimants en forme
d’anneaux.
Le microscope électronique en transmission (MET ou TEM en anglais) utilise un faisceau
d'électron à haute tension, émis par un canon à électrons. Des lentilles électromagnétiques sont utilisées
pour focaliser le faisceau d'électrons sur l'échantillon. En traversant l'échantillon et les atomes qui le
constituent, le faisceau d'électrons produit différentes sortes de rayonnements. En général, seuls les
électrons transmis sont alors analysés par le détecteur, qui traduit le signal en image contrastée.

Les échantillons doivent être préparés selon un protocole précis, qui doit à la fois conserver sa structure
et être conducteur pour laisser passer le faisceau d'électrons. Des coupes très fines de l'échantillon sont
réalisées à l'ultramicrotome (de 60 à 100 nanomètres). Des colorations aux métaux lourds sont également
possibles pour augmenter les contrastes de structures particulières des échantillons, préalablement
placées sur des grilles d'observation.
Microscope électronique à balayage (scaning) :

Le MEB est formé d’une colonne

d’environ 1,5 à 2 m de hauteur. Ce
type de microscope électronique
permet une observation de la
surface d’un échantillon qui doit être
recouverte préalablement d’une
mince pellicule de métal (or) ou de
carbone. Le faisceau d’électrons ne
traverse pas l’échantillon mais
balaie sa surface. Les électrons
réfléchis sont captés par une
caméra. Une image
tridimensionnelle de la surface de
l’objet observé est reconstituée sur
un écran.
Le canon produit un faisceau
d’électrons grâce à un filament de
tungstène chauffé par un courant. Ce
faisceau est accéléré par la haute
tension (jusqu’à 30 KV) créée entre le
filament et l’anode. Il est ensuite
focalisé sur l’échantillon par une série
de 3 lentilles électromagnétiques en
une sonde de moins de 4 nm.
Le faisceau en touchant la surface de
l’échantillon produit
des interactions dont les suivantes:
Lorsque le faisceau d’électron entre en collision
avec le matériau de l’échantillon il va pénétrer à
l’intérieur et il va se produire des phénomènes
physiques comme la production d’électrons
secondaires d’électrons rétrodiffusés ou
de rayons X mais aussi de la
cathodoluminecence des électrons transmis de
la chaleur etc.
 Les électrons rétrodiffusés
Les électrons rétrodiffusés ou back-scattered electrons ou
BSE sont des électrons du faisceau primaire qui ont réagi
de façon quasi élastique avec les atomes de l’échantillon.
Ils sont renvoyés dans une direction proche de leur
direction d’origine avec une faible perte d’énergie.

Les zones de l’échantillon avec numéro atomique élevé

seront donc plus blanches que celles ayant un numéro
atomique faible. On appelle cela le contraste de phase.

Vous pourrez vérifier sur la photo suivante réalisée sur une

surface plane que les électrons rétro-diffusés permettent de
distinguer les éléments ou les phases suivant leur numéro
atomique (Z élevé en blanc et Z faible en noir)
 Les électrons secondaires

Les électrons secondaires sont émis lorsque le

faisceau primaire qui a perdu une partie de son
énergie excite les atomes de l’échantillon. Les
électrons secondaires possèdent une énergie faible
(autour de 50 eV) suivant un large spectre.

Les rayons X
Les rayons X sont des radiations électromagnétiques.
L’énergie des photons X émis dans le MEB est comprise
entre 0.5 et 30 KeV.
Le faisceau d’électrons du microscope est capable d’éjecter
des électrons des différentes couches électroniques des
atomes constituant le matériau observé. Lorsqu’un électron
est éjecté il est remplacé par un électron d’une couche
supérieure. Un photon d’énergie égale à la différence
d’énergie entre les deux couches est émis.
 Préparation des échantillons et des lames pour observation en microscopie optique

La préparation des échantillons biologiques est une étape capitale de l’observation histologique ou cytologique.
Elle permet de mettre en évidence ce que l’on souhaite observer et « d’immobiliser » l’échantillon à un instant t avec
des caractéristiques proches de son état vivant. Bio-alternatives met en œuvre des protocoles de préparation des
échantillons qui garantissent une observation au plus proche de la réalité du vivant.

étapes de préparation des échantillons se succèdent :

 1. La fixation :

a pour but la conservation des structures et le durcissement des pièces. Elle doit se faire immédiatement
après le prélèvement, par immersion du matériel dans un grand volume de liquide fixateur.
Les liquides fixateurs les plus utilisés sont le formol ou le liquide de Bouin (mélange de formol et d’acide
picrique). La durée de la fixation varie selon le volume des prélèvements

La fixation étant destinée à immobiliser les structures cellulaires et tissulaires,

dans un état aussi proche que possible de leur état vivant, le fixateur doit avoir
une pénétration rapide et homogène, ne donner aucune rétraction des tissus,
révéler les organites intra‐cellulaires et les structures latentes, éviter le
déplacement des constituants solubles, tels que le glycogène, ménager l'activité
de certaines enzymes, et permettre en principe de retrouver les éléments
visibles sur les colorations vitales.

C6H3N3O7 CH3-CO-OH
CH O
2. L’inclusion :
L’inclusion suit la fixation en liquide fixateur. Elle consiste à rigidifier l’échantillon avec un milieu
d’inclusion de paraffine, afin de pouvoir procéder à la coupe ultérieure.
Pour cela, il est nécessaire de déshydrater au préalable l’échantillon en remplaçant l’eau qu’il contient
par de l’éthanol. L’éthanol est non miscible avec la paraffine, il est donc substitué par une solution
(clarifiant) miscible avec la paraffine.
Suite à la clarification, les échantillons sont plongés dans des bains de paraffine. Ces étapes sont réalisées
à l’aide d’un automate de déshydratation.
L’étape suivante d’inclusion est réalisée à l’aide d’une table d’inclusion. Elle consiste à orienter
l’échantillon dans un moule contenant de la paraffine en fusion, en veillant à respecter le plan de coupe.
Le bloc qui en résulte est enfin refroidi.
 C7H8

CH2O
déshydrater

paraffine
3. La coupe :
Les coupes sont réalisées par microtomie ou cryotomie. La coupe est une étape importante de la préparation des
lames car elle conditionne la bonne observation de l’échantillon en microscopie.
– Les échantillons inclus en paraffine sont coupés de façon transversale avec un microtome, en fines tranches de 5
micromètres. Les lames de verre sont recouvertes d’une solution contenant un additif permettant d’optimiser
l’accroche de la coupe déposée sur la lame. Les lames sont ensuite placées sur des plaques chauffantes afin d’aider au
bon étalement de l’échantillon. Le liquide résiduel est retiré à la main après réchauffement de la lame. Les lames sont
ensuite séchées à température ambiante.
– Les échantillons congelés sont coupés à l’aide d’un cryotome. Les coupes à congélation sont ensuite déposées sur une
lame de verre pour stockage à -80°C.
Bioalternatives évalue les conditions de fixation et de coupe adaptées à votre échantillon et à votre étude.
Le choix de ces conditions de préparation est capital afin de minimiser les artéfacts. L’inclusion en paraffine est
privilégiée pour préserver la morphologie des tissus ; la congélation est plus adaptée pour préserver l’ADN et l’ARN
et pour le marquage d’éléments solubles ou sensibles au milieu de fixation.
 Un microtome

Un microtome est un appareil utilisé pour l'étude des

cellules. Il permet de créer de fines tranches d'un tissu
étudié

coupes de tissu
4. La coloration ou l’immunomarquage :
– La coloration permet d’accentuer les contrastes afin de reconnaître et de différencier des éléments
constitutifs du matériel biologique.
L’échantillon est déparaffiné et réhydraté au préalable afin de permettre aux colorants polaires
d’imprégner les tissus. Ainsi, les différents colorants peuvent entrer en contact avec les éléments à
colorer en fonction de leur affinité.
Une fois la coloration effectuée, la lame est rincée et déshydratée pour le montage.
 STRUCTURES MISES STRUCTURES MISES EN
COLORATIONS COLORATIONS
EN EVIDENCE EVIDENCE
Noir Soudan Lipides Bleu alcian Mucosubstances / GAGs
Oil Red Lipides Bleu de Toluidine Mastocytes
Orceine safran Fibres élastiques Fontana Masson Mélanine
PAS (Periodic Acid Glycogène, mucine, Gordon Sweet Fibres de réticuline
Schiff) collagène
Grocott Microorganismes fongiques
Fibres élastiques, fibres Noyaux, structures
Pentachrome de musculaires, Hematoxyline/eosine
cytoplasmiques
Silverman-Movat mucosubstances/GAGs,
collagène Hematoxyline/eosine/safran Collagène
Rouge Alizarine Collagène mature &
Calcium Herovici
immature
Rouge Sirius Collagène Luna Fibres élastiques
Safranine-O Cartilage Trichrome de Masson Collagène
Van Gieson Collagène Mucosubstances/GAGs,
Mowry
collagène
Von Kossa Calcium
Nile red Lipides
Warthin Starry Mélanine
 Peau humaine (coloration HE) Human skin (Masson Trichrome staining)

mw_Human skin (Movat-Pentachrome staining) mw_Human skin (Mowry staining) x 20

5. Le montage :
Les coupes sont montées entre lames et lamelles avec un produit permettant leur adhérence. Les lames
sont prêtes à être stockées ou observées.
Pour les observations en microscopie à fluorescence, un milieu de montage est utilisé afin de diminuer
temporairement la perte de fluorescence.