Master 1 Microbiologie appliquée

ANALYSES
MICROBIOLOGIQUES
 Contenu de la matière 
 Chapitre 1 : Introduction
 Chapitre 2 : Prélèvement, préparation des échantillons et transport
 Cas des aliments solides;
 Cas des liquides alimentaires;
 Echantillonnage en surface;
 Techniques de dilution.
 Chapitre 3 : Les techniques classiques de numération
Numération microscopique;
Numération en milieu solide;
Numération en milieu liquide.
Chapitre 4 : Méthodes d’évaluation des différentes microflores
 La microflore aérobie mésophile totale;
 Les indices de contamination fécale;
 Les microorganismes pathogènes.
CHAPITRE 3 : Les techniques classiques de numération

En microbiologie alimentaire l’intérêt de l’étude à la fois quantitative et

qualitative de la flore présente dans un aliment est considérable.
Bien que de nombreuses techniques de numération soient utilisables, il
n’existe pas à l’heure actuelle de technique parfaite.
 Certaines méthodes ne permettent pas de différentier les germes vivants
des germes morts,
 d’autres s’avèrent incapables de compter individuellement les cellules
microbiennes lorsque celles-ci sont associées (Staphylococcus,
Streptococcus , mycélium etc..) et permettent d’évaluer des unités formant
colonies (UFC) ou des unités formant trouble (UFT).
Des méthodes directes Comptage directe 

Pour réaliser le dénombrement, on utilise un microscope optique en remplaçant la

traditionnelle lame par une cellule de numération appelée également cellule de
comptage.
Il s’agit d’une lame quadrillée dans la masse, largement utilisée en biologie médicale
(comptage des globules blancs et rouges dans le sang) et en microbiologie.
Ce quadrillage facilite le comptage des cellules sous microscope.
De nombreuses cellules de numération existent, présentant chacune un quadrillage
différent.
Chaque cellule de numération a donc son propre mode de calcul pour parvenir au résultat
de dénombrement final.
Il est donc très important d’adapter le mode de calcul à la cellule de comptage ; dans le
cas contraire, les résultats seront totalement erronés.
Nous présentons les deux cellules de comptage les plus utilisées pour la numération des
germes : la cellule de Thoma et la cellule de Malassez.
Voici, le raisonnement détaillé, de façon à ce qu’il puisse être transférable à
n’importe quel autre type de cellule de comptage :

Étape 1 : Calcul du volume

- d’un grand carré (cellule de Thoma)
- ou d’un grand rectangle (cellule de Malassez),
On utilise la formule générale de calcul du volume d’un parallélogramme :

Volume = longueur × largeur × hauteur (ici, hauteur = épaisseur entre lame et

lamelle).
Exemple
 pour une cellule de Thoma :
 chaque grand carré mesure 0,2 mm de côté (longueur = largeur);
 l’épaisseur entre lame et lamelle est de 0,1 mm ;
Le volume d’un grand carré est donc égal à :
0,2 mm × 0,2 mm × 0,1 mm = 0,004 mm3.

 Le résultat d’une numération de germes doit être donné

en nombre de germes par millilitre.
 Le volume calculé en mm3 doit donc être converti en millilitre.
 Conversion d’unités : on sait que 1 dm3 = 1 l ;
partant de cette relation, on réalise le tableau de correspondances.
Tableau : Conversion d’unités.

dm3 cm3 mm3

 
  l dl cl ml      
 
        1 0 0 0
 
        0 , 0 0 1

 D’après le tableau, 1 ml = 1 000 mm3 et 1 mm3 = 0,001 ml.

 On a donc un rapport de 1/1 000 (un millième) entre le mm3 et le ml.
 Le volume du grand carré de la cellule de Thoma devient :
0,004 mm3 = 0,004/1 000 ml = 0,000 004 ml = 4.10–6 ml.
•

Étape 2 : calcul du nombre moyen de germes par grand carré ou par grand rectangle.

 La numération de germes au microscope est réalisée sur un certain nombre

de grands carrés du quadrillage de la cellule de Thoma ;
 sur le même principe, il est réalisé sur un certain nombre de grands
rectangles, sur la cellule de Malassez.
Cela permet d’assurer une plus grande fiabilité du résultat.
 Le nombre de répé-titions est laissé à l’appréciation de chacun (entre 3
et 5) et leur emplacement dans la cellule de comptage, choisi au hasard.
Exemple: Ce qui donne sur une cellule de Thoma (n étant le nombre de
germes dénombrés dans un carré) :
n1 sur le carré 1 ; n4 sur le carré 4 ; n7, sur le carré 7 ; n10 sur le carré 10 ;
n15 sur le carré 15. Soit 5 comptages.
 Tableau : Exemple de dénombrement sur cellule de Thoma (5comptages).
1 2 3 4
(n1) (n4)
5 6 7 8
(n7)
9 10 11 12
(n10)
13 14 15 16
(n15)

À la fin de ce comptage, on fait donc le calcul de la moyenne des dénombrements (n

moyen) par grand carré ou par grand rectangle.
C’est la somme des dénombrements divisée par le nombre de comptages ;
pour l’exemple traité, cela donne :
n moyen = (n1 + n4 + n7 + n10 + n15) ÷ 5
 • Étape 3 : calcul du nombre de germes par millilitre,
 Pour connaître le nombre de germes par millilitre,
il faut rapporter le résultat du dénombrement moyen (précédemment calculé)

 au volume d’un grand carré (cellule de Thoma)

 ou au volume d’un grand rectangle (cellule de Malassez) :
Pour la cellule de Thoma :
Nbr. de germes/ml = n moyen/ volume d’un grand carré de la cellule de comptage (en ml)

Pour la cellule de Malassez :

Nbr. de germes/ml = n moyen / volume d’un grand rectangle de la cellule de comptage (en ml)

Par exemple pour la cellule de Thoma : Nbr. de germes/ml = n moyen /4 .10-6

Préparation d’une cellule de numération

Etape 1 : Dilution au 1/5

 Pipeter avec une pipette stérile, 10ml de l’échantillon

à contrôler, prélevé dans les conditions stériles

 Verser dans une fiole jaugée de 50 ml (stérile).

 Compléter jusqu’au trait de jauge avec de l’eau

distillée stérile.

Etape 2 : Coloration de la cellule de comptage.

 Verser 1ml de l’échantillon mesuré avec une pipette stérile dans un petit bécher

 Ajouter 1ml de bleu de méthylène mesuré avec une 2ème pipette stérile.

 Homogénéiser et attendre 10minutes.

Etape 3 : Préparation de la cellule de comptage
 Déposer une goutte de l’échantillon coloré (prélevé avec une pipette stérile) au centre de la cellule de
comptage (au niveau du quadrillage)

 Recouvrir d’une lamelle.

 Placer sur le microscope et observer au grossissement x100.

 Effectuer la numération selon le protocole propre à la cellule utilisée.

Remarque:
• Veiller à ajouter le colorant « volume à volume » c’est-à-dire selon un volume rigoureusement
identique à celui de l’échantillon (= dilution au 1/2).
 Une seule goutte de l’échantillon coloré est nécessaire.
 Caractéristiques techniques d’une cellule de numération

La cellule de numération est une lame de microscope portant

un quadrillage gravé qui facilite le comptage des cellules
observées au microscope.
Les plus utilisées pour la numération des microorganismes
sont la cellule de Malassez et la cellule de Thoma.

Précaution :
D’un modèle de cellule à l’autre, bien que d’aspect extérieur similaire,
le quadrillage diffère :
il faut donc veiller à utiliser le mode opératoire et le mode de calcul qui se
rapportent précisément au modèle de cellule utilisé.
 Technique de comptage sur une cellule de numération

Schématisation des cellules de levures ou de bactéries sur un quadrillage

de cellule de numération (exemple de la cellule de Malassez)

Les cellules à dénombrer :

• Toutes les cellules à l’intérieur du grand rectangle :
14
• Pour les cellules positionnées sur la limite du grand
rectangle, on comptabilise les cellules d’une seule
longueur et d’une seule largeur (soit 2 côtés sur 4) : 4
➜ Soit au total pour le grand rectangle : 18 cellules.
 Différenciation des levures vivantes et des levures mortes par coloration
au bleu de méthylène

Remarque :
• Les cellules qui semblent être plus petites sont en fait
de la même taille : elles sont simplement dans un plan
un peu plus reculé : en faisant avancer l’objectif du
microscope très légèrement avec la vis micrométrique
elles apparaissent du même format que les autres et leur
coloration est plus distincte.
• Au final, tout doit être comptabilisé : «petites » ou
«grosses», colorées ou non :
la somme cellules vivantes + cellules mortes donne la
population totale.
• On peut aussi distinguer les levures en
bourgeonnement car elles attestent d’une activité intense
(jeunesse, croissance active de la population, présence de
nutriments).
 Détermination du nombre de grands carrés ou de
grands rectangles à dénombrer
• Dénombrer le nombre de cellules
 dans plusieurs grands carrés (cellule de Thoma)
 ou de plusieurs grands rectangles (cellule de Malassez).
On en choisit en général 3 à 5.
Exemple : on a choisi de dénombrer 5 grands carrés (ils
apparaissent grisés).

Calculs sur une cellule de numération :

Etape 1 : calcul du nombre de germes moyen par grand carré (cellule de Thoma) ou grand
rectangle (cellule de Malassez)
• Reprendre les résultats de chaque dénombrement réalisé (entre 3 et 5 comptages).
• Réaliser la moyenne (n moyen) du nombre de germes par grand carré (cellule de Thoma) ou par grand
rectangle (cellule de Malassez) :
n moyen = Somme des résultats de chaque comptage/Nombre de résultats
 Étape 2 : calcul du nombre de germes par millilitre
• Diviser le nombre de germes moyen (n moyen) par le volume du grand
carré ou du grand rectangle calculé:
Nombre de germes/ml d’échantillon dilué = n moyen volume du grand carré en ml

• Ne pas oublier de multiplier le résultat précédent par le facteur de dilution (FD).

* Dans le cas d’une dilution de l’échantillon au 1/5, FD = 5.
Pour la cellule de Thoma* :
germes/ml = (n moyen /4.10-6 ) x FD = (n moyen × 106 /4) x 5 = n moyen × 106 × 5/4
= n moyen × 106× 1,25 = 125 × 104 × n moyen germes/ml
Pour la cellule de Malassez* :
germes/ml = (n moyen/ 10–5) × FD = n moyen × 105 × 5 = 5 × 105 × n moyen germes/ml
Précaution :
Si la préparation dénombrée a été colorée au bleu de méthylène, ne pas oublier de
tenir compte de la dilution engendrée par la coloration :
Coloration = Dilution au 1/2, soit FD = 2.
Exemple :
Un échantillon dilué au 1/5 puis coloré au bleu de méthylène est donc dilué au 1/10 (1/5
× 1/2) ; le facteur de dilution à appliquer est alors égal à 10.
Comptage grand carré Levures mortes Levures Levures Levures totales (mortes+
(Thoma) ou grandTableau
rectangle de collecte desvivantes
résultats (comptage et calculs)
bourgeonnantes vivantes)
(Malassez)
Carré/ rectangle 1        
Carré/ rectangle2        
Carré/ rectangle 3        
Carré/rectangle 4        
Carré/rectangle5        
Moyenne (total de la        
colonne /5)
Nombre de levures par ml (levures.ml-1)  
Taux de viabilité (%) = %levures vivantes :
(levures totales – levures mortes)/ levures totales x 100
 Des méthodes générales indirectes

Cette technique permet en principe la numération des germes vivants.

La culture est réalisée

 soit en milieu liquide (1germe ou un groupe de germes donne après
inoculation et incubation 1 culture positive)
 soit en milieu solide (1germe ou un groupe de germes donne naissance à
une colonie).
Dans ce dernier cas l’ensemencement peut se faire dans la masse de la
gélose ou en surface.
 1- Numération à partir d’un milieu solide : UFC  

Cette méthodologie est le plus fréquemment réalisée dans des boîtes de

Pétri.
Elle repose sur le principe que toute bactérie vivante introduite dans la
masse ou en surface d’un milieu gélosé favorable donne en principe
naissance après incubation à une colonie macroscopique.
Le nombre total de colonies correspond alors au nombre d’UFC présents
dans l’inoculum.
1- Numération à partir d’un milieu solide : UFC
 Dans la masse:
De nombreuses critiques à cette méthode peuvent être formulées.
 Ainsi, les bactéries aérobies strictes se développent mal dans la masse de la gélose,
 tandis que les bactéries anaérobies strictes ne s’y développeront que dans des conditions
d’incubation appropriées (jarre anaérobie par exemple).
 Il peut aussi exister certains antagonismes bactériens (bactériocines etc...).
 Par ailleurs si la température de mélange du milieu gélosé mélange à l’inoculum est supérieure à 45
- 47°C , il peut y avoir inactivation de microorganismes.

 Cette méthode de culture dans la masse conduit néanmoins à des dispersions homogènes dans la
gélose et donc à une distribution homogène des colonies.
 Dans cette méthode des germes se trouveront dans la masse et d’autres en surface, les colonies
formées étant, compte tenu des contraintes stériques imposées par le réseau gélifié, alors différentes
pour un même micro-organisme.
Cet inconvénient est éliminé par la technique de la double couche.
1- Numération à partir d’un milieu solide : UFC
 En surface:
 La numération en surface n’est réalisable que sur une surface de milieu parfaitement
sèche.
 L’opération d’étalement au râteau reste à maîtriser (adsorption de germes sur le râteau)
 et le volume d’inoculum déposé ne peut en aucun cas excéder 0,5 ml avec des boîtes de
9 cm de diamètre (des volumes supérieurs ne sont pas absorbés par le gel d’agar et l’eau
qui reste en surface rend impossible toute numération en raison de la formation d’une
nappe).
 Cette méthode donne de bons résultats avec les germes aérobies et aéro-anaérobies.
 A- Technique de numération dans la masse de la gélose

 Les milieux gélosés (répartis en erlenmeyer ou en flacon de 15 ml) sont liquéfiés en bouillant au
bain-marie ou mieux au four à micro-ondes,
 puis maintenus en surfusion dans un bain-marie à 45 ±1°C.
 1 ml du liquide dans lequel on veut connaître le nombre de micro-organismes est introduit au
centre de la boîte de Pétri posée bien à plat dans la zone de protection du bec Bunsen.
 L’inoculum peut être réparti en gouttes sur le fond de la boîte.
 Afin de n’utiliser qu’une seule pipette stérile pour toutes ces opérations il est recommandé de
commencer l’ensemencement par la dilution la plus grande pour terminer avec le liquide non
dilué.
 Noter avec soin sur chaque boîte l’origine de l’analyse, le milieu utilisé et la dilution correspondante (sur
le côté de façon à ne pas être géné par la suite pour le comptage).
 On procède de la même façon pour chaque dilution en réalisant, dans la mesure du possible, deux
essais par dilution.
A- Technique de numération dans la masse de la gélose La suite

 Le milieu gélosé en surfusion dans lequel l’inoculum sera incorporé doit être à 45°C±1°C.
 Si sa température est supérieure à cette valeur il se produira une destruction partielle de la
flore ;
 au contraire, si sa température est inférieure à 45°C le milieu se solidifiera
irrégulièrement et ne se mélangera pas de façon homogène avec l’inoculum.
 Pour réaliser l’introduction du milieu gélosé : retirer le milieu du bain marie à 45°C,
essuyer le récipient, l’ouvrir aseptiquement, flamber son ouverture et couler le milieu dans
la boîte de Pétri contenant l’inoculum après l’avoir entrouverte dans la zone stérile.
 Ne pas appuyer le récipient sur la boîte.
 Mélanger rapidement par agitations circulaire et alternative horizontales ; éviter les
mouvements brusques qui risquent de projeter le milieu inoculé sur les bords ou même à
l’extérieur de la boîte.
 Laisser refroidir les boîtes bien à plat jusqu’à solidification complète (environ 30 minutes).
 Retourner les boîtes et les placer à l’étuve dans cette position à la température requise.
A- Technique de numération dans la masse de la gélose La suite

 Pour éviter la formation de colonies de grande taille en surface (par rapport à celles qui se
développeront dans la masse de la gélose) on peut couler
 à la surface de la gélose ensemencée une fine couche de milieu de culture
identique à celui déjà présent dans la boîte
 ou couler à la surface une mince couche de gélose non nutritive
(technique de la double couche).
Remarque :
on peut recouvrir le milieu d’une couche de milieu stérile (double couche)
pour limiter l’envahissement des colonies en surface et avoir des colonies présentant
toutes le même aspect.
B- Technique de numération en surface de la gélose

 100 à 500 microlitres (pipette graduée ou mieux pipette automatique) du milieu à

analyser sont déposés à la surface de la gélose et immédiatement répartis de façon
uniforme à la surface du milieu au moyen d’un ensemenceur stérile du type pipette
râteau.
 La pipette râteau est “stérilisée” entre deux étalements par immersion dans de
l’éthanol, l’éthanol adsorbé sur le verre étant ensuite enflammé (cette opération ne
déforme pas l’ensemenseur).
 Incubation à la température adaptée à la flore recherchée pendant 18 h à 72heures.

Dénombrement des colonies

 En surface : elles ont un aspect macroscopique classique et caractéristique ;

 En profondeur : elles ont un aspect lenticulaire.

 Exploitation des résultats
 Elle peut être effectuée selon la norme ISO 7218 (manipulation réalisée en ensemençant deux
boites par dilution).
 Elle peut être effectuée selon la norme ISO 7218 modifiée en octobre 2007, qui officialise
l’utilisation d’une seule boite par dilution .
 Choix des essais : choisir deux dilutions successives dont :
 L’une au moins présente un minimum de dix colonies,
 Le « nombre maximal de colonies en totalité est de trois cents par boite ».
• Pour les levures et les moisissures, on retient pour le calcul les dilutions présentant entre dix et
cent cinquante colonies par boite .

Calcul de la concentration bactérienne N en UFC par ml ou par g de produit :

Arrondir le résultat calculé à deux

chiffres significatifs et l’exprimer en
nombre compris entre
1,0 et 9,9.10n UFC par mL ou par g.
 Numération à partir d’un milieu liquide : UFT 

 Cette méthode présente certains avantages tels que

 la possibilité d’étudier un caractère biochimique du germe difficilement mis en
évidence sur milieu gélosé comme la production de gaz (cloche)
 ou encore d’effectuer facilement la numération avec une phase de revivification.
 Dans cette technique, la disponibilité des nutriments pour le micro-organisme est
excellente.
 Cette méthode repose sur le fait qu’un inoculum contenant au minimum 1 germe (UFT)
donnera, après introduction dans un milieu liquide donné, une culture positive.
 Numération à partir d’un milieu liquide : UFT 

Principe
 Si les conditions optimales de croissance sont réunies, un seul micro-organisme présent dans l’inoculum
introduit dans un milieu liquide se développe en y créant un trouble (et une modification visible du milieu).
La lecture des tubes contenant le milieu liquide et ensemencés avec l’inoculum est donc de type binaire :
 Résultat négatif si absence de trouble et de modification du milieu : il y avait moins d’ un
microorganisme présent dans l’inoculum introduit dans le milieu liquide ;
 Résultat positif si présence de trouble (et de modification du milieu si celui-ci est discriminant) : il y avait
au moins un micro-organisme présent dans l’inoculum introduit dans le milieu liquide.
Le résultat sera positif, que l’inoculum introduit dans le tube de milieu liquide contienne 1, 10, 100, 1 000…
micro-organismes.
La méthode repose sur la répartition aléatoire des microorganismes dans le prélèvement (méthode statistique
reposant sur l’utilisation de la loi de Poisson).
 On ensemence donc une série de tubes avec un volume donné du produit à analyser ou ses dilutions, à
raison de 1, 2, 3, 5 voire même 10 tubes par dilution testée.
 Connaissant le nombre de résultats positifs obtenus dans la série de tubes, on peut déterminer la
concentration en micro-organismes présents dans une unité de volume ou de masse du produit analysé.
 Mode opératoire
La méthode décrite ci-dessous (NF ISO 7218, mai 1996) est techniquement lourde, mais utilisée
 lorsque les bactéries cultivent difficilement en milieu gélosé
 ou lorsque le nombre de bactéries présentes dans l’échantillon est relativement faible.
1- Volume de l’inoculum : le plus souvent V inoculum = 1 mL (parfois 10 mL) ;
2- Choix du milieu à ensemencer :
 .Milieu de croissance sans indicateur : la présence de micro-organismes se traduit par un
trouble,
 Milieu sélectif et discriminatif du micro-organisme à quantifier : sa présence se manifeste par
un trouble et le virage d’un indicateur de pH par exemple ;
3- Choix des dilutions à tester : dépend de la population estimée, pour une analyse statistique optimale
des résultats :
. Une dilution contenant moins d’un micro-organisme dans l’inoculum utilisé,
. Une dilution contenant plus d’un micro-organisme dans l’inoculum utilisé ;
4- Choix du nombre d’essais par dilution (dépend de la précision souhaitée pour les résultats en
fonction de leur analyse statistique) :
 En général trois tubes sont ensemencés par dilution,
 Un ou deux tubes sont ensemencés si une précision moins importante est suffisante,
 Cinq ou même dix tubes sont ensemencés si une précision plus importante est demandée
 Organigramme d’un dénombrement en milieu liquide
Produit liquide Produit solide

Préparation d’une « suspension mère » correspondant

le plus souvent à une dilution au 1/10e du produit (X g
de produit introduit dans 9X ml de diluant)

Réaliser une série de dilutions 1/10e ( de produit liquide à analyser ou de la

« suspension mère)

Ensemencer 1ml du produit pur et de chaque dilution dans 1, 2, 3, 5 ou 10 tubes

contenant un milieu liquide correctement choisi.

Incuber les tubes à la température et pendant le temps adaptés.

Après incubation; noter pour chaque tube si le résultat est positif (+) ou négatif (-)
puis exploiter les résultats.
Exploitation des résultats
1- Dénombrement à un seul essai

 Ce dénombrement s’effectue sans recourir aux tables de Mac Grady.

 On ensemence 1 tube par dilution avec 1 mL d’inoculum.

Exemple de résultats :
Dilution 100 10-1 10-2 10-3 10-4
Résultats + + + - -

 Il y a au moins un micro-organisme dans l’inoculum (1mL) de la plus grande dilution (10-2) présentant encore
un trouble : la concentration est donc au moins 102 micro-organismes par mL de produit ou de «suspension
mère » non dilués ;
 Il y a moins de un micro-organisme dans l’inoculum (1mL) de dilution (10-3) ne présentant plus de trouble :
la concentration est donc strictement inférieure à 103 micro-organismes par mL de produit ou de
«suspension mère » non dilués.
 On peut exprimer le résultat selon l’intervalle

102 ≤ N micro-organismes/mL < 103

La concentration du produit analysé est comprise entre 102 et 103 micro-organismes dans 1 mL.

2- Dénombrement à essais multiples

Ce dénombrement s’effectue en utilisant les tables de Mac Grady .

Mise en place du nombre caractéristique

 Le nombre caractéristique de la série réalisée est une combinaison de trois chiffres :
 Chaque chiffre correspond au nombre de tubes « positifs » pour une dilution donnée ;
 Les trois chiffres correspondent à trois dilutions successives ;
 Le chiffre des centaines correspond à la plus faible dilution (donc à la plus forte concentration en micro-
organismes), celui des dizaines à la dilution intermédiaire et celui des unités à la plus grande dilution.
 Parmi les différentes combinaisons, on choisit celle correspondant au nombre le plus grand et, si possible,
inférieur à 330 (correspond à une meilleure répartition des micro-organismes dans les dilutions).
 Exemple :
 cinq dilutions ont été ensemencées à raison de trois essais par dilution ;
 trois combinaisons (de trois chiffres) sont possibles avec les résultats obtenus (tableau).

 Parmi les trois combinaisons de trois chiffres possibles (332 ; 321 ; 210), laquelle choisir ?
 Le nombre le plus élevé et inférieur à 330 est sélectionné ; dans cet exemple, il s’agit de
321.
 Si les dilutions sont insuffisantes, on peut être amené à utiliser des nombres
caractéristiques comme 333, 332 ou 331
Lecture du NPP (Nombre le Plus Probable) dans la table statistique de Mac Grady
 On reporte le nombre caractéristique de la série dans une table statistique de Mac Grady.
 On y lit le Nombre le Plus Probable (NPP) de microorganismes présents dans l’inoculum de la dilution
correspondant au chiffre des centaines du nombre caractéristique.
Exemple : 321 correspond au NPP de 15.
Cela signifie qu’il y a statistiquement quinze bactéries dans l’inoculum de la dilution 10 -(n+1).

Expression du résultat