Module : Génie fermentaire 2020/2021

Génie fermentaire dans l’agroalimentaire

1. Procédés biotechnologiques dans l’agroalimentaire

1.1. La fermentation

La fermentation est une réaction biochimique qui consiste à produire de l’énergie à partir d’un
substrat organique sous l’action d’enzymes microbiennes et libérer de produits. Cette réaction ne fait
pas intervenir d’O2, elle se déroule en absence d’air (anaérobiose).

Ce procédé traditionnel est utilisé de façon empirique depuis des millénaires pour la préparation du
pain, de boissons alcoolisées et de vinaigre.

1.1.1. Les différents types de fermentation

On distingue les fermentations selon le type de produits libérés par le microorganisme fermentaire,
par exemple :

a. Fermentation alcoolique : est une réaction biochimique qui résulte de l’action des levures
(Saccharomyces cerevisiae), qui vont décomposer les sucres en alcool et en dioxyde de carbone CO 2.
Elle intervient dans la fabrication du vin, de la bière, du cidre et de diverses boissons fermentées. Cette
fermentation est aussi utilisée en boulangerie, ou le facteur essentiel est la production de CO2 qui fait
lever la pâte.

b. Fermentation acétique : elle intervient dans la fabrication du vinaigre et est due aux bactéries
appartenant au genre Acetobacter. Cette bactérie transforme tout liquide alcoolisé en acide acétique.

c. Fermentation lactique : elle correspond à la transformation du lactose du lait en acide lactique, sous
l'action des bactéries lactiques (Streptococcus thermophilus et Lactobacillus delbrueckii subsp
bulgaricus). Elle constitue une étape essentielle dans la fabrication des fromages et yaourts, mais aussi
de nombreux produits végétaux fermentés (ensilages, olives, cornichons, etc.).

Les fermentations lactiques outre leur rôle organoleptique (acidification, sous-produits

aromatiques), jouent un grand rôle de stabilisation (par la baisse du pH et des phénomènes d’antibiose)
et surtout un grand rôle sur la qualité alimentaire : les ferments lactiques sont sources de facteurs de
croissance.

1.2. Production de biomasse

Le terme de biomasse désigne le matériel organique cellulaire des organismes mis en culture
(animaux, végétaux ou microbiens).

La biomasse microbienne produite dans des fermenteurs peut être utilisée comme source de :

 Protéines pour une consommation alimentaire directe ;

 Métabolites après lyse et extraction ;
 Levains utilisés dans les industries de fermentation

Les principales fabrications de biomasse sont celles de levures diététiques, de ferments de

régénération de la flore intestinale, de levures pour aliment de bétail, de mycélium fongique (pour des
extraits ou poudres destinées aux sauces et soupes, de nourriture pour l’aquaculture (algues) ainsi que
de levains pour la boulangerie, la fromagerie, etc. On appelle POU (Protéines d’organismes
unicellulaires), toute biomasse microbienne destinée à l’alimentation humaine ou animale. Cette
biomasse possède un contenu très élevé en protéines et en vitamines.

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Les protéines d'organismes unicellulaires (POU) sont obtenues à partir de culture de micro-organismes
(levures, champignons filamenteux, bactéries, cyanobactéries) utilisant le plus souvent des substrats qui
sont des produits de l’industrie agroalimentaire et des productions agricoles.

1.3. Production de métabolites

Divers substances ou métabolites utilisables comme additifs alimentaires sont fabriqués par
fermentation microbienne.

 Des acides aminés comme la lysine, l’acide aspartique, la thréonine ou l’acide glutamique sont
utilisés dans l’alimentation animale.
 Des acides organiques (acide lactique, fumarique, acétique) sont utilisés comme agents
d’acidification pour la conservation.
 L’acide citrique est utilisé comme acidifiant, antioxydant, émulsifiant, agent chélateur.
 Les vitamines : l’acide ascorbique (vitamine C), la riboflavine (vitamine B2), la
cyanocobolamine (vitamine B12), la vitamine D, etc.
 Enzymes d’origine microbienne sont utilisables au cours de la fabrication ou du traitement des
denrées alimentaires : protéases (facilite l’attendrissement des viandes), lipases (améliorent le
volume du pain), amylases (préserve la fraîcheur du pain et des gâteaux).
1.4. Bioconversions

La biotechnologie moderne est largement employée dans l’industrie agroalimentaire. Elle réside
dans le potentiel impliqué par l’union des procédés et des méthodes biologiques (anciens et modernes)
et les techniques du génie biochimique et génie génétique. Elle mette en œuvre des bioréacteurs couplés
à des systèmes de régulation permettant d’accélérer et de faciliter les bioconversions et la mise en œuvre
efficace des biocatalyseurs.

1.4.1. Définition de la bioconversion

La bioconversion est la production de nouvelles molécules à partir des molécules déjà

existantes, suite à une série de transformations (hydrolyse, isomérisation, desionisation, etc.) de la
matière organique issue des végétaux ou des animaux, dans des conditions expérimentales spécifiques.
Ce processus s’effectue grâce à la catalyse des enzymes (libres ou immobilisées) contenues dans les
microorganismes et des cellules (libres ou immobilisées). Les bioconversions ne sont possibles qu’à
l’aide de biocatalyseurs. La bioconversion se fait comme suit :

L’intérêt de la bioconversion réside dans sa simplicité d'emploi, sa possibilité d’utilisation

industrielle, son faible coût, ainsi que l’absence de réactions secondaires.

Enzyme immobilisée ou fixée est une enzyme liée par des moyens physico-chimiques en surface ou à
l’intérieur d’un support solide. L’immobilisation des cellules ou des enzymes permet leur réutilisation.

Biocatalyseurs sont des substances produites par les cellules vivantes (généralement des enzymes)
capables d’accélérer certaines réactions chimiques de manière spécifique.

1.4.2. Applications des bioconversions

a. Bioconversion des produits d’origine végétale

Les plantes ont plus de leur rôle clé dans la production d’aliments, sont une source importante en
matières premières et substances bioactives.

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Exemple 1 : Bioconversion des sucres

Les réactions de bioconversion des sucres, sous l’action des enzymes essentiellement immobilisées,
sont de différents types : hydrolyse, oxydation, réduction et isomérisation. Elle repose sur la fabrication
des sirops à haute teneur en fructose et en glucose, à un très faible coût. Ces sirops utilisés pour leurs
propriétés sucrantes, évitent également la cristallisation en confiserie. Ils sont fabriqués à partir
d’amidon de céréales, généralement du maïs (figure 1).

Figure 1 : Réaction de production des sirops de fructose par isomérisation (Hecquet, 2014).

Exemple 2 : Bioconversions des arômes (Vanilline)

La vanilline est actuellement l’arôme le plus utilisé dans l’industrie agroalimentaire, en étant le plus
important composant de la vanille naturelle. Elle est produite par bioconversion de plusieurs précurseurs
tels que l’acide férulique ou l’acide vanillique par des champignons filamenteux. Pour le cas d’acide
férulique, le champignon Pycnoporus, est capable de transformer ce précurseur, dans un milieu de
culture spécifique, en accumulant de la vanilline dans le milieu (figure 2).

Figure 2: Voies de synthèse de la vanilline naturelle par une bioconversion de plusieurs précurseurs
(Gallage and Møller, 2015, modifiée).

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b. Bioconversion des produits d’origine animale

Exemple 1 : Produits de la mer

Les produits de la mer (poissons, crustacés, mollusques et algues) ont été transformés depuis des
siècles en utilisant les activités d’enzymes endogènes ou exogènes. Comme la chair de poisson réduite
en farine ainsi que les sous-produits constituent une réserve importante en protéines susceptibles d’être
consommées, après transformation par hydrolyse enzymatique. La production des hydrolysats
protéiques sont destinés à l’alimentation humaine (arômes et compléments protéiques) par ajout aux
produits à transformer des protéases exogènes, essentiellement d’origine microbienne.

Exemple 2 : Extraits de bovins

La production de confiserie (bonbons) est rendue possible grâce à l’extraction par hydrolyse
industrielle de la gélatine (protéine) à partir de matières premières riches en collagène notamment les
peaux et les os de bovins. Elle est utilisée dans l’industrie agro-alimentaire comme épaississant,
stabilisant ou agent texturant dans des produits, comme les crèmes glacées, les confitures, les yaourts,
la margarine, et les gâteaux.

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Les acides organiques

Un grand nombre d’acides organiques avec les usages réels ou potentiels sont produits par des
microoganismes. Ce sont essentiellement les intermédiaires du cycle de Krebs ou le cycle de l’acide
citrique (CTC) et d’autres, on cite les acides : citrique, itaconique, l’acide lactique, malique, tartrique,
gluconique, mévalonique, salicylique, acide gibbérellique… La production microbienne de ces acides a
été brevetée.

Production d’acide citrique

1. Structure chimique
Molécule isolée par l’allemand Scheele en 1784, cette molécule est produite essentiellement par
voie microbiologique, en 1979, la production mondiale atteint 220000 tonnes/an. L’acide citrique est un
acide tricarboxylique dont la structure est la suivante :

Figure 1 : Structure de l’acide citrique (acide 3-carboxy-3-hydroxy pentanedioïque)

Il cristallise en grands cristaux contenant une molécule d’eau de cristallisation, qui est perdu
quand il est chauffé à 130°C. A des températures aussi élevées que 175°C, il est converti en acide
aconitique et d’autres composés.

2. Souches productrices
Aspergillus niger, Aspergillus wentii, Aspergillus clavatus, Penicillium luteum, Penicillium citrinum,
Penicillium piriformis, Paecilomyces divaricatum, Citromyces pfefferianus, Trichoderma viride,
Arthrobacter paraffinus, Corynebacterium sp., Candida guilliermondii.

Figure 2 : Aspergillus niger vu au microscope optique et électronique.

3. Utilisations de l’acide citrique
L’acide citrique est utilisé dans l’industrie alimentaire, en médecine, en pharmacie et dans divers
autres industries.

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a. Utilisations dans l’industrie alimentaire

- L’acide citrique est l’acidifiant alimentaire majeur utilisé dans la fabrication de gelées,
confitures, bonbons et boissons gazeuses.
- Il est utilisé comme arôme artificiel dans divers aliments, y compris des boissons gazeuses.
- Le citrate de sodium est utilisé dans la fabrication de fromage fondu.
b. Utilisations en médecine et en pharmacie
- Le citrate de sodium est utilisé en transfusion sanguine et dans la bactériologie pour la
prévention de la coagulation du sang.
- L’acide est utilisé pour son pouvoir effervescent qui dépend pour son effervescence sur le CO 2
produit par la réaction entre l’acide citrique et le bicarbonate de sodium.
- Comme il est presque universellement présent dans les êtres vivants, il est rapidement et
complètement métabolisé dans le corps humain et peut donc servir de source d’énergie.
c. Utilisations dans l’industrie cosmétique
- Il est utilisé dans les lotions astringentes comme les lotions après-rasages en raison de faible
pH.
- L’acide citrique est utilisé dans les lotions de rinçage des cheveux perruques.
d. Divers usages dans l’industrie
- A froid et à faible pH, l’acide citrique a tendance à former des complexes par conséquent, il est
largement utilisé dans la galvanoplastie, le tannage du cuir, et dans l’élimination du fer obstruant
les pores provoqués par sablage d’ancien puits de pétrole.
- L’acide citrique a été récemment utilisé pour la fabrication de détergent à la place des
phosphates, parce que la présence de ce dernier dans les effluents donne lieu à l’eutrophisation
(une augmentation de nutriments qui favorise le développement de la flore aquatique).
4. Base biochimique de la production d’acide citrique
L’acide citrique est un intermédiaire dans le cycle de l’acide citrique (CTC). L’acide peut donc
être amené à accumuler de l’une des méthodes suivantes :
- Par mutation : donnant lieu à des organismes mutants qui ne peuvent utiliser une partie de la
voie métabolique, ou des mutants de régulation.
- En inhibant la libre circulation du cycle en modifiant l’environnement et les conditions
physicochimiques, par exemple, température, pH, la composition du milieu (en particulier
l’élimination des ions et des cofacteurs considérés comme essentiels pour les enzymes
notamment :
o Les concentrations de fer, le manganèse, le magnésium, le zinc et le phosphate doivent
être limitée. Pour en assurer cela ; les milieux de culture subissent un traitement au
ferrocyanure ou par des résines échangeuses d’ions. Ces ions métalliques sont
nécessaires en tant que groupe prosthétique des enzymes suivantes de l’ACT : Mn++ ou
Mg++ par oxalosuccinic décarboxylase, Fe+++ est requis pour la déshydrogénase
succinique, alors que le phosphate est nécessaire pour la conversion du PIB au GTP.
o Les déshydrogénases, en particulier isocitrate déshydrogénase, sont inhibées par
l’anaérobiose, l’aération se fait donc limitée sur la fermentation de manière à augmenter
le rendement de l’acide citrique.
o De faibles pH et surtout la présence de l’acide citrique inhibe le TCA et encourage donc
la production d’acide citrique et évite sa précipitation.
o La plupart des enzymes de l’ACT peut être directement inhibée par divers composés,
et ce phénomène est utilisé pour augmenter la production de l’acide citrique. Ainsi,
l’isocitrique déshydrogénase est inhibée par le fluorocitrate et la succinate
déshydrogénase par le malonate. Ces antagonistes enzymatiques peuvent être ajoutés à
la culture de fermentation.

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Figure 3 : Cycle de l’acide citrique (cycle de Krebs).

5. Procédé
a. Fermentation
Pendant longtemps, la production d’acide citrique a été basée sur l’utilisation de la mélasse et
différentes souches d’Aspergillus niger et Aspergillus wentii. Bien que plusieurs rapports sur la
production d’acide citrique par Penicillium soient disponibles, dans la pratique, les organismes de ce
groupe ne sont pas utilisés en raison de leur faible productivité. Chez les levures, en particulier Candida
spp. (y compris Candida guilliermondii) ont été utilisés pour produire de l’acide citrique des sucres, les
paraffines ont été aussi utilisées comme substrat en 1970. Dans les procédés décrits essentiellement
utilisant des bactéries et des levures, sont ceux des chercheurs japonais. Parmi les bactéries sont
Arthrobacter paraffineus, les corynébactéries et les levures Candida lipolytica et Candida aleiphila. Les
procédés de fermentation sur la mélasse et d’autres sources de carbone peuvent se faire soit en surface
ou submergé (cas de paraffines).
I. Fermentation en surface
Elle utilise de Aspergillus niger peut être faite sur le son de riz en en solution comme c’est le
cas au Japon, la fermentation a lieu dans des plateaux en acier inoxydables. L’acide citrique est extrait
du son par lessivage et est ensuite précipité en solution de citrate de calcium.
La fermentation en culture solide est une opération à petite échelle. Chaque unité produit
seulement quelques centaines de tonnes par an, et utilise des milieux solides stériles à la vapeur comme
le son de blé ou de pommes de terre douces ou même de déchets qui a une teneur en humidité de 70-
80%. Le moût est inoculé avec des spores d’Aspergillus niger, puis étalé sur des plateaux, ou un sol
propre ayant des profondeurs de 3-5 cm. La circulation d’air contribue à maintenir la température à

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environ 28°C, et ce pendant 5-8 jours, après quoi le moût est collecté et le citrate est extrait à l’aide
d’eau chaude.
Ou bien dans des plateaux de 5-20 cm de profondeur sont inoculés par pulvérisation avec des
spores d’Aspergillus niger se développent ensuite sur la surface du milieu. L’air stérile est propulsé à
travers ces cultures, ce qui est important pour le maintien des conditions d’aérobie, le contrôle de la
température et l’abaissement du niveau de CO 2. Le pH du milieu baisse peu à peu en dessous de 2, la
production d’acide citrique commence. A 30°C, la fermentation dure environ 8-12 jours dès que la
productivité est d’environ 1 kg/m3 par jour.

Figure 4 : Production commerciale de l’acide citrique par le processus de fermentation en surface.

II. Fermentation submergée

En utilise des cuves de fermentation en acier inoxydable renforcé et résistant. Les sources de
glucides sont sous forme de mélasse décationisée par échange d’ions, sous forme de saccharose ou le
glucose. MgSO47H2O et KH2PO4 à environ 1% et 0,05 à 2% respectivement sont ajoutés. Le pH n’est
jamais supérieur à 3,5. Le cuivre est utilisé à 500 ppm comme un antagoniste de l’enzyme l’aconitase
qui exige du fer. 1-5% de méthanol, isopropanol ou l’éthanol lorsqu’il est ajouté à la culture. Une
aération très importante s’avère néfaste à la production de l’acide citrique, de l’agitation mécanique
n’est pas nécessaire et l’air peut barboter la culture. L’antimousse est ajoutée. Le mycélium se cultive
sous forme de granules uniformes dans le milieu. La fermentation dure de 5 à 14 jours.
Plus de 80% de l’approvisionnement mondial de l’acide citrique est produit par fermentation
submergée dans des cuves agitées d’une capacité de 40-200 m3 ou plus 200-900 m3. Les fermenteurs
sont résistants à la corrosion, en acier inoxydable ou acier revêtu avec des matériaux spéciaux en verre
ou en plastique.
Ces fermentations utilisent principalement la mélasse de betterave ou de canne comme source
de carbone. Contrairement aux méthodes de surface, l’inoculum est sous forme végétative, plutôt que
de spores. En conséquence, il est préparé en plusieurs stades, laboratoires, pilote et semi industriel. Le
mycélium est sous forme de granules ou pelotes. La structure de ces pelotes a une influence majeure sur
la productivité. De petites de moins de 1mm de diamètre avec des centres moelleux et des surfaces lisses.
Ces propriétés structurales et leur physiologie dépendent fortement de la composition du milieu et des
conditions d’exploitation. Granules qui produisent des hyphes courts et fourchus et bulbeux. La présence
de niveaux encore faibles de certains métaux lourds, en particulier le manganèse, peut être néfaste, ce

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qui entraîne des hyphes qui sont longs et non ramifiés. Ainsi, il est nécessaire de prétraiter toutes les
matières premières à réduire les concentrations de manganèse au-dessous de 0,02 mmol/L.
Les concentrations basse en manganèse limite le virement vers la voie des pentoses phosphates,
ce qui peut détourner le flux loin de la glycolyse et de réduire la production de citrate. Alternativement,
les ions cuivre peuvent être ajoutés pour compenser le manganèse, en empêchant son absorption. Les
rendements d’acide citrique sont également améliorés par la formulation du milieu en concentration en
fer (aconitase a besoin de fer) ; et l’ajout de cuivre diminue l’activité de l’aconitase.
Afin de maintenir de bons rendements d’acide citrique, des milieux de cultures doivent avoir
des concentrations en sucre qui doivent être d’au moins 140 g/L, ce qui favorise l’activité des enzymes
de la glycolyse et du pyruvate carboxylase. Il est également important de limiter la croissance par la
limitation de l’azote. Ceci est normalement réalisé en fournissant des sels d’ammonium à des niveaux
de 0,1 à 0,4 g/L. Les ions ammonium vont stimuler la production de l’acide en neutralisant l’effet
inhibiteur du la phosphofructokinase, une enzyme clé de la glycolyse. Ces fermentations sont très aérées
et maintenues à 30 °C. Pour la phase initiale de croissance, le pH commence à 5-7, mais il doit alors être
maintenu en dessous de 2, autrement les acides oxalique et gluconique s’accumulent au détriment de
l’acide citrique, c’est-à-dire à faible pH inhibe la glucose-oxydase. Dans l’ensemble, le rendement de
0,7 à 0,9 g par gramme de citrate de glucose peut être atteint dans ces fermentations submergées avec
des productivités jusqu’à 18 kg/m3 par jour.

Figure 5 : Production commerciale de l’acide citrique par le processus de fermentation submergée.

b. Extraction et purification
La récupération de l’acide citrique à partir du moût de fermentation se fait par précipitation
(méthode de Schulz, 1963) suivie d’une acidification puis d’une concentration sous vide jusqu’à
cristallisation.
Précipitation
- La liqueur traitée présente une richesse en acide citrique de 89,3% en poids par rapport à la
matière sèche et contient des impuretés organiques et minérales dont 1,1% d'acide gluconique,

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0,5% d'acide oxalique, 2% de maltose et environ 2% de cendres sulfatées ; elle a été filtrée et
concentrée à une teneur en matières sèches de 50%; sa densité est de 1,22 g/ml.
- Une quantité de 1 ml de cette liqueur est introduite au sommet de la colonne de résine décrite
ci-dessus et illustrée par la figure 6.
- L'élution est effectuée au moyen d'eau chaude à un débit de 152 ml/heure ; la température de la
double enveloppe est maintenue à 75°C.
- L'éluat commence à apparaître à la sortie de la colonne après environ 42 minutes. La variation
de sa teneur en matières sèches en fonction de la quantité x, exprimée en ml, d'eluat recueilli,
est matérialisée.
Au bout de 14 jours de fermentation, le moût est récupéré puis filtré (filtres Schleicher & Schell,
diamètre 125mm) pour éliminer le mycélium. Apres élimination, on ajoute de l’hydroxyde de calcium
Ca(OH)2 pour précipiter l’acide citrique sous forme de citrate monocalcique. Cette opération se fait à
chaud à 40°C. L’addition de Ca(OH)2 se fait à la neutralité pH 7. Il se dépose ainsi un précipité jaunâtre
au fond du récipient.
Acidification
Après neutralisation, la solution est filtrée et le précipité est récupéré dans de l’eau distillée. La
solution obtenue est acidifiée par addition d’acide sulfurique concentré jusqu’à l’obtention d’un pH
voisin de 2.
Purification et cristallisation
La solution acide est purifiée par passage sur colonne en verre (2x100 cm) chargée de charbon
actif. Après décoloration, l’éluat est récupéré puis concentré sous vide dans un rota-vapeur rotatif jusquà
cristallisation.
Autres méthodes
Procédé de récupération d’acide citrique à partir d’une liqueur en contenant, caractérisé par le
fait que, successivement,

- dans une première phase, la liqueur contenant de l'acide citrique est mise au contact d'une résine
cationique R sous forme hydrogène pendant une durée de 20 min à 10 h, de préférence de 1 h à
3 h 1/2, ce qui correspond à un débit horaire de 0,1 volume à 3 volumes, de préférence de 0,3
volume à 1 volume par volume de résine pour atteindre une adsorption optimale de l’acide
citrique,
- dans une seconde phase, la résine est traitée par un agent d'élution et la fraction d'éluat riche en
acide citrique purifié est récupérée.

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Production microbienne des antibiotiques

La plupart des antibiotiques sont des métabolites secondaires produits par les champignons
filamenteux et des bactéries, en particulier les actinomycètes. Eh bien plus de 4000 antibiotiques ont été
isolés de divers organismes, mais seulement environ 50 sont utilisés régulièrement pour la
chimiothérapie antimicrobienne. Le plus connu et probablement le plus médicalement antibiotiques
importants sont les β-lactamines, les pénicillines et les céphalosporines, ainsi que les aminoglycosides
(aminosides), tels que la streptomycine et la tétracycline à large spectre.
1. Définitions
1.1. Antibiotiques
Produits par des champignons ou des bactéries, ou obtenus par synthèse ou semi synthèse,
capables d’inhiber ou de détruire certaines espèces microbiennes.
Sont regroupés en famille selon leur structure, leur mode d’action, leur spectre antibactérien,
leur pharmacocinétique et leurs effets secondaires.

1.2. Activité antibactérienne

Concentration Minimale Inhibitrice, Concentration Minimale Bactéricide
L’activité antibactérienne d’un antibiotique est caractérisée par la CMI (Concentration minimale
inhibitrice de la croissance bactérienne in vitro) et par la CMB (concentration minimale bactéricide
laissant un nombre de survivants ≤ 0,01% de l’inoculum bactérien de départ).
Les antibiotiques bactéricides ont des CMB proches des CMI (β-lactamines, aminosides,
fluoroquinolones).
1.3. Sensibilité-résistance
- Appréciées par l’antibiogramme bactériostatique.
- Bactérie sensible à un antibiotique : CMI inférieure aux concentrations de l’antibiotique
obtenues dans l’organisme avec des posologies usuelles.
- Bactérie résistante à un antibiotique : CMI supérieure aux concentrations de l’antibiotique
obtenues dans l’organisme avec des posologies usuelles.
- Bactérie intermédiaire à un antibiotique : CMI voisine aux concentrations de l’antibiotique
obtenues dans l’organisme avec des posologies usuelles.
- Pour certaines bactéries, il est nécessaire de déterminer la CMI pour le choix de l’antibiotique
ou les posologies, comme les pneumocoques (pénicilline, amoxicilline, cefotaxime), les
streptocoques et les entérocoques (endocardite : amoxicilline, glycopeptides), les
staphylocoques (glycopeptides).

Production de la pénicilline
1. Historique
La pénicilline a été découverte par Fleming en 1928 suivant sa fameuse observation d’une zone
d’inhibition entourant un contaminant fongique, Penicillium notatum, sur une plaque de Staphylococcus
aures. A la fin des années 1930, Florey, Chaine et Heatley ont caractérisé le composé inhibiteur
responsable, la pénicilline, et élaboré un protocole qui lui ont permis d’être produite sous une forme
pure. La découverte de la pénicilline et sa caractérisation plus tard et purification ont finalement abouti
à des avancées majeures dans à la fois technologie de médicine et la fermentation. La vitesse de ces
développements a été grandement influencée par l’urgence besoin de fournir la pénicilline pendant la
Seconde Guerre Mondiale.

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Toutefois, Penicillium notatum, l’organisme à l’origine trouvé produire l’antibiotique, a généré

un peu plus de 1 mg/L de la surface des milieux de cultures d’abord. Une augmentation de 20 à 25 fois
du rendement a été atteinte lorsque l’amidon de maïs soluble a été incorporé dans le milieu de
fermentation. Ce sous-produit de la transformation du maïs contient diverses sources d’azote, ainsi que
les facteurs de croissance et des précurseurs de chaîne latérale, et reste comme un grand ingrédient de
la plupart des milieux de culture, le même rendement de pénicilline a été obtenu à partir d’une espèce
proche Penicillium chrysogenum, qui a été isolé d’un melon cantaloup moisi. De nouvelles
augmentations de rendement ont été atteintes lors de la production en culture par fermentation
submergée.
Dans des bioréacteurs agités par le biais arbre d’agitation vertical muni de turbine
d’entraînement accompagné par un barbotage d’air comprimé. Depuis les années 1940, le rendement de
la fermentation a été considérablement amélioré par de nombreuses mutations et la sélection des souches
de production. Actuellement les fermentations de pénicilline produisent des rendements supérieurs à 50
g/L, une augmentation de 50000 fois des premiers niveaux produite par Fleming.
1.2. Structure chimique et biosynthèse
La pénicilline est un métabolite secondaire. La structure de base des pénicillines est l’acide 6-
aminopénicillanique (6-APA), composé d’un noyau thiazolidine fusionné avec un cycle β-lactamines
dont la position 6-amino offre une grande variété de substituant acyle.

Figure 1 : structure chimique générale de la pénicilline.

La structure du noyau β-lactam-thiazolidine, synthétisé à partir de L-aminoadipate, L-cystéine
et la L-valine, est commune à toutes les pénicillines, céphalosporines et céphamycines.
Dans le cas où il y’a absence de précurseurs de chaîne latérale ajouté à la fermentation, les
souches de Penicillium notatum ou Penicillium chrysogenum, produisent un mélange de pénicillines
naturelles obtenues à partir du filtrat de culture, notamment la pénicilline G (benzylpénicilline) et la
pénicilline V (phénoxyméthylpénicilline).
Ces pénicillines sont les plus actives contre les bactéries Gram positives. La plupart des
pénicillines semi-synthétiques sont maintenant produites par modification chimique de la pénicilline
naturelle, obtenue par fermentation à l’aide des souches de Penicillium chrysogenum. Modification
obtenue en retirant leur groupe acyle naturel, laissant 6-APA, à laquelle d’autres groupes acyle peut être
ajoutés à conférer des propriétés nouvelles. Ces pénicillines semi-synthétiques, tels que la méthicilline
(méticilline), carbénicilline et l’ampicilline, présentent diverses améliorations, y compris la résistance à
l’acidité de l’estomac pour permettre son administration par voie orale, un degré de résistance à la
pénicillinase et une gamme étendue d’activité contre les certaines bactéries Gram-négatives.
Au cours des fermentations, nous assistons souvent à des réactions parasites ayant comme
conséquences ce qui suit :
- Formation de pénicillines homologues F, K, N… dans lesquelles d’autres acides sont incorporés
à la place de l’acide phénylacétique, ainsi que d’acide 6-aminopénicillanique. Il s’agit là de
déviations inévitables de la succession de réactions impliquées dans la biosynthèse.
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- Dégradation de la pénicilline formée, principalement par réactions d’hydrolyse catalysées de

façon purement chimique ou par enzymes :
o L’hydrolyse chimique : cinétique classique, dépendant essentiellement du pH.
o La dégradation enzymatique : nettement plus variable, l’activité enzymatique
disponible fluctuant beaucoup en fonction de l’état physiologique du mycélium : âge,
lyse partielle, etc.
Dans tous les cas, les sous-produits qui résultent de ces dégradation sont les mêmes.

Figure 2 : Réactions d’obtention du tripeptide précurseur des pénicillines (biosynthèse de la

pénicilline).
1.3. Procédé de production
La production commerciale de la pénicilline est habituellement via un processus fed-batch, la
fermentation est effectuée aseptiquement dans des bioréacteurs agités de capacité de 40000-200000 L,
bien que les systèmes de transport en surface sont parfois utilisés.
La fermentation consiste à une première phase de croissance végétative suivie par la phase de
production d’antibiotique. Tout au long du processus, le niveau de l’oxygène est très important et doit
être maintenue à 25-60 mmol/L/h. Cependant, car le taux de transfert d’oxygène est affecté par la
viscosité, qui augmente à mesure que progresse la fermentation. Ces processus sont maintenus à 25-
27°C et pH 6,05 à 7,07, les conditions choisis selon la souche de Penicillium chrysogenum.

1.3.1. Milieux de culture

Différentes sources de carbone ont été adoptées pour la production de pénicilline, y compris le
glucose, le lactose, le saccharose, éthanol et des huiles végétales. Environ 65% de la source carbone est
métabolisée pour l’entretien cellulaire, 25% pour la croissance et 10% pour la production de la
pénicilline. Les modes de « l’alimentation » de la source de carbone est extrêmement important, car ils

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Module : Génie fermentaire 2020/2021

peuvent influencer la production de ce métabolite secondaire. Les eaux de trempage du maïs sont encore
utilisées comme source d’azote, d’autres nutriments et des précurseurs de chaîne latérale sont ajoutés.
L’acidité du milieu est contrôlée par l’ajout de carbonate de calcium (1% p/v) et d’un tampon phosphate
(neutraliser le milieu), ce qui permet l’optimisation du pH pour la production de la pénicilline.
De l’ammoniac, les sels minéraux et des précurseurs spécifiques de chaîne latérale, par exemple,
phényle acide acétique ou l’acide phénoxyacétique, peuvent être également ajoutés. Toutefois, comme,
certains précurseurs sont toxiques pour les cellules, ils doivent être ajoutés par une alimentation continue
à des concentrations non-inhibitrices.
1.3.2. Etapes de production
Le développement de l’inoculum est initié par l’addition de spores lyophilisées dans un
fermenteur de petit volume (5 à 20 L) à une concentration de 5.10 3 spores/ml. Le mycélium peut alors
être agrandi dans une ou deux étapes supplémentaires jusqu’à ce qu’il y’est une concentration suffisante
pour inoculer le fermenteur de production. Initialement, il y a une phase de croissance végétative
consacrée au développement de la biomasse mycélienne, il s’agit d’un dédoublement de cette biomasse
toutes les 6h. Ce taux de croissance élevé est maintenu pendant les 2 premiers jours. Pour assurer un
rendement optimal de la pénicilline dans les étapes suivantes : phase de croissance, le mycélium doit
se développer sous forme de pellètes, plutôt que de formes compactes. Au cours de la suivante, la phase
de production, la source de carbone est alimentée à un faible taux et augmente la production de
pénicilline. Cela continue pour un 6-8 jour supplémentaire, à condition que le substrat approprié
(glucose) soit maintenu. La pénicilline est excrétée dans le milieu est ensuite récupéré à la fin de la
fermentation.

1.3.3. Extraction de la pénicilline

Les antibiotiques (ATB) sont mis en extraction du bouillon. Habituellement, la récupération de
l’antibiotique (pénicilline) à partir du mycélium se fait en utilisant des filtres rotatifs sous vide,
l’efficacité de l’extraction peut être affectée par le milieu de culture (composition) en particulier de ses
composants protéiques. Le mycélium est récupéré ensuite lavé pour éliminer la pénicilline résiduelle,
avant son utilisation comme aliment pour animaux ou engrais.
Du filtrat, la récupération des antibiotiques est souvent faite par une extraction par les solvants.
Le bouillon de milieu qui donne des rendements allant jusqu’à 90% est soumis à un abaissement de pH
du milieu filtré à des valeurs de 2 à 2,5 par l’addition de l’acide sulfurique ou phosphorique, suivie par
une double extraction en deux étapes avec contre-courant continu. L’extraction se fait à froid à une
température de 0-3°C avec de l’acétate d’amyle, l’acétate de butyle ou methyl isobutyl acétone. La basse
température est nécessaire pour réduire les dommages qui peuvent être causé à la pénicilline en raison
du pH bas.
Tous les pigments et traces d’impuretés en traitant avec du charbon actif. La pénicilline est alors
extraite du solvant par addition d’acétate de sodium ou de potassium. Cela réduit la solubilité de la
pénicilline qui précipite sous forme de sel de sodium ou de potassium. Résultant de la pénicilline en
cristaux qui sont séparés par filtration rotative sous vide. Le solvant est récupéré pour être réutilisé ainsi
que le charbon actif, ceci est très important en terme de l’économie globale du processus.
La pénicilline en cristaux est mélangée avec un solvant volatil, l’éthanol anhydre en général, le
butanol ou l’isopropanol, pour éliminer les impuretés supplémentaires. Les cristaux sont récupérés par
filtration et séchés à l’air. A ce stade, la pénicilline est pure à 99,5%. Ce produit peut être purifié pour
former un produit de qualité pharmaceutique ou utiliser dans la production de pénicillines semi-
synthétiques.

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Figure 3 : Organigramme de la production industrielle d’un antibiotique par fermenteur.