Cours Analyse Microbio s5 21-22

UNIVERSITE THOMAS SANKARA BURKINA FASO
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Unité de Formation et de Recherche Unité – Progrès – Justice
en Sciences et Techniques
..………………
Licence en Sciences et Technologies
……………...
Mention Analyse Physico-chimique
COURS D’ANALYSE MICROBIOLOGIQUE
Enseignant : Dr Oumarou ZONGO
Assistant, Université Thomas SANKARA
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Analyse microbiologique Année universitaire 2021-2022
Code UE : BIO1500 Unité d’Enseignement : Analyse microbiologique
Elément Constitutif : Méthodes VHP : 36

Classe : L3
d’analyses microbiologiques
Crédits : 3
Semestre : S5
CT: TD: TP :
12H 24
Objectifs :
- Connaitre et utiliser les techniques d’échantillonnage
- Décrire et appliquer correctement les techniques de base utilisées pour
réaliser l’analyse microbiologique d’un échantillon
- Interpréter les résultats de laboratoire et comprendre leur signification
Prérequis : cours analyse bactériologique S3
CONTENU INDICATIF:
 PRINCIPALES METHODES DE RECHERCHE ET DE NUMERATION

QUANTIFICATION DES POPULATIONS BACTERIENNES DANS UN
ECHANTILLON
- Dénombrement après culture (sur milieu solide, NPP)
- Dénombrement direct des cellules (microscopie, cytométrie, …)
 DIFFERENTES ETAPES DE L’ANALYSE MICROBIOLOGIQUE
- Préparations des milieux et de l’échantillon
- Ensemencements et incubation
- Lecture des résultats
 INTERPRETATIONS DES RESULTATS D’ANALYSES MICROBIOLOGIQUES
Modalités d’évaluation : Un devoir sur table et un examen de TP
- Bibliographie :
- Analyses microbiologiques des aliments et de l'eau : Guide pour l'assurance
qualité. Nigel-Francis Lightfoot, 2002
Broché: 186 pages, Collection : Editions Scient, ISBN-13: 978-2847030082
- Contrôle microbiologique des aliments – Manuel technique. 119 pages Jean-

Louis CUQ Polytech Département STIA
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Programme
 Les principes de base de l’analyse microbiologique
 Matériel d’équipement du laboratoire d’analyse microbiologique
 Principales méthodes de recherche et de numération quantification des populations

bactériennes dans un échantillon
Dénombrement après culture (sur milieu solide, NPP)
Dénombrement direct des cellules (microscopie, cytométrie, …)
 Différentes étapes de l’analyse microbiologique
Préparations des milieux et de l’échantillon
Ensemencements et incubation
Lecture des résultats
 Interprétations des résultats d’analyses microbiologiques
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Introduction
Les fabrications dans les bio-industries supposent la maîtrise des développements microbiens,
aussi bien des souches de cultures utilisées en fermentation, si une telle étape intervient dans la
fabrication, que des microorganismes contaminants. En effet, un levain dont le taux de
croissance serait trop faible ne permet pas de réaliser des fermentations correctes. Par ailleurs
des microorganismes contaminants peuvent perturber, à des degrés divers, le déroulement de la
fabrication et mettre en cause la qualité et la conservation du produit final.
1. Objectifs du contrôle microbiologique
Les contrôles doivent permettre de garantir une bonne qualité hygiénique et une bonne qualité
marchande du produit fabriqué. De plus, les contrôles doivent permettre de minimiser les pertes
dues à des mauvaises conditions de fabrication et donc d’avoir le moins possible de produits
non conformes.
1.1. Qualité hygiénique
Une altération de la qualité hygiénique met en cause la santé du consommateur, le produit altéré
conduisant à des intoxications alimentaires de gravité diverse suivant la nature des
microorganismes en cause. Cette altération est généralement invisible. Elle est due à un
développement de microorganismes pathogènes produisant des toxines, deux cas peuvent alors
se présenter :
- la toxine est excrétée dans le produit (exotoxine). A partir d’une certaine quantité de toxine,
le produit est dangereux à consommer même si le microorganisme n’est plus vivant dans le
produit. C’est le cas de staphylocoques pathogènes ou de Clostridium botulinum ;
- la toxine n’est pas secrétée mais reste dans les cellules microbiennes (endotoxine). Pour que
le produit soit dangereux pour le consommateur, le microorganisme doit être présent et vivant.
C’est le cas des entérobactéries par exemple.
Les contrôles microbiologiques permettent donc d’éviter la présence de microorganismes dans

les produits afin de ne pas risquer une altération de la qualité hygiénique des produits finis ou
au moins détecter ces microorganismes s’ils sont présents dans les produits finis avant leur
commercialisation.
1.2. Qualité marchande
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Une altération de la qualité marchande modifie la texture et la qualité organoleptique du produit.
Cette altération bien que généralement non dangereuse pour la santé du consommateur, rend le
produit non commercialisable. Cette altération survient lorsque la technologie mise en oeuvre
pour assurer la stabilité microbiologique a été défaillante. La nature des microorganismes
responsables de ces altérations dépend étroitement du type de produit et de la technologie mise
en oeuvre. Exemple, des levures osmophiles peuvent se développer et donc altérer (gonflement)
un produit sucré à faible activité d’eau si ce facteur n’a pas été parfaitement maitrisé.
L’altération de la qualité marchande se produit généralement lentement au cours du stockage.

Les contrôles microbiologiques ont pour objectif de détecter les microorganismes pouvant être
responsables de ces altérations, et de vérifier l’efficacité des technologies après leur application
afin de stocker et de commercialiser les produits microbiologiquement stables.
La bonne qualité microbiologique (hygiénique et marchande) est fonction de très nombreux

facteurs ; le microbiologiste se doit néanmoins de définir le plus rapidement possible la notion
quantitative et qualitative de flore normale de son produit ou de ses matières premières
(microorganismes «habituels» et tolérables) et d’une flore contaminante dont le seuil de
tolérance sera défini en fonction du risque que fait courir cette flore au consommateur.
La Technologie est l’aptitude à la transformation et à la distribution. La qualité d’un produit

doit satisfaire tous les utilisateurs. Le consommateur n'est pas le seul utilisateur (les
transformateurs, artisans et industriels, les distributeurs, magasins et grandes surfaces, attendent
eux aussi des caractéristiques précises des produits), il s'agit des «Qualités Technologiques».
Exemple : qualité boulangère d'une farine de blé, qualité de rétention d'eau d'une viande
destinée à la salaison, qualité de conservation d'un yaourt, ...
2. Politique de contrôle
La politique de contrôle dans chaque usine doit être établie en faisant appel à la réflexion et au
bon sens pour éviter des pertes importantes dues à des interventions tardives. Le contrôle
microbiologique doit donc permettre de surveiller pas à pas les fabrications. Le contrôle
microbiologique occupe une place privilégiée dans les procédures de mise sous assurance-
qualité. Il comporte quatre démarches en interaction :
- L’évaluation (par exemple d’un niveau de qualité existant) ;
- La définition d’un objectif (amélioration de la qualité) ;
- La préparation (mise en place de moyens nécessaires pour atteindre l’objectif retenu) ;
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- L’exécution (réalisation de la production à l’aide des dispositifs mis en place).
Le système HACCP (Hazard Analysis Critical Control Point) ou encore ADPCM (Analyse des
Dangers et des Points Critiques pour leur Maîtrise) utilise une démarche où le contrôle
microbiologique joue un rôle essentiel. En effet, à chaque point critique, en se basant sur des
critères microbiologiques, un niveau seuil (défini) de contamination microbienne ne doit pas
être dépassé.
Le contrôle microbiologique a deux fonctions distinctes :
- Evaluer la qualité microbiologique d’un produit ou d’une matière première ;
- Maîtriser un point critique sur une chaine de production.
2.1. Les spécifications microbiologiques
Les spécifications microbiologiques sont des critères applicables pendant et après la préparation
afin de s’assurer que l’hygiène et les conditions de production sont satisfaisantes et en accord
avec la règlementation. Les parties prenantes d’un marché y trouveront des garanties.
Les normes sont des spécifications microbiologiques adoptées par la législation qui s’adressent
au produit fini et fixent les limites acceptables de présence de microorganismes donnés dans
des produits bien définis.
Il existe actuellement de nombreux organismes nationaux ou internationaux qui se préoccupent

de l’établissement de critères de qualité microbiologique comme : FAO (Food and Agriculture
Organisation)- L’OMS (Organisation mondiale de la Santé)- L'ISO (Organisation
Internationale de Normalisation)- Le comité technique 34 (CT34) concernant les produits
agroalimentaires- Le Codex alimentarius crée en 1963 par la FAO et l'OMS- Le CEN (Comité
européen de normalisation) ...
2.2. Niveaux de contrôle
Les contrôles doivent être répartis en trois groupes :
- Les contrôles préventifs sont effectués sur les matières premières et les différents adjuvants.
Dans le cas où le processus de fabrication fait intervenir une fermentation, des contrôles
microbiologiques sur le levain sont nécessaires.
- Les contrôles en cours de fabrication comprennent les contrôles microbiologiques sur le

produit lui-même mais aussi sur les facteurs ayant une influence sur la qualité du produit comme
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l’hygiène des matériels, des locaux et du personnel. Le nombre des contrôles est défini suivant
la longueur des chaines de fabrication (durée) et les risques de contamination possible.
- Les contrôles des produits finis déterminent la qualité microbiologique du produit fini et sa
conformité aux normes officielles ou aux normes établies par l’usine.
2.3. Fréquence des contrôles
Il n’y a pas de règle absolue quant à la fréquence des contrôles à réaliser. Pour chaque type de
fabrication, dans chaque usine, la fréquence des contrôles est à établir sur la base de l’expérience
et en fonction des moyens disponibles.
2.4. Paramètres à contrôler
Les microorganismes à rechercher varient suivant la technologie et les caractéristiques physico-

chimiques du produit en cours de fabrication et du produit fini. Il n’est donc pas possible de
donner une liste des microorganismes à rechercher, chaque fabrication étant un cas particulier,
mais l’on peut cependant dégager quelques orientations générales :
- Les microorganismes responsables d’une altération de la qualité hygiénique, comme les

germes de contamination fécale (entérobactéries) ou les germes pathogènes de contamination
de produits manipulés (staphylocoques) sont moins systématiquement recherchés dans les
produits faisant intervenir une biotechnologie que dans les autres produits alimentaires.
Certains produits par leurs propriétés physico-chimiques (pH, activité d’eau, alcool) ne
permettent pas le développement de ces microorganismes. Cependant dans certains produits
(les laits fermentés, les yaourts, les additifs alimentaires ou les produits à usage
pharmacologique), ces microorganismes et particulièrement les coliformes doivent être
recherchés notamment dans les produits finis.
- Les microorganismes responsables d’une altération de la qualité marchande et d’une

perte de rendement devront être recherchés du début de la fabrication (matières premières),
jusqu’au produit fini. Les microorganismes à rechercher dépendent étroitement du produit en
cours de fabrication, les levures dans les produits sucrés ou les produits acides, bactéries
lactiques ou acétiques dans les produits acides, moisissures dans les produits peu hydratés.
- Dans les biotechnologies mettant en oeuvre un levain bactérien les contaminants les plus
redoutés sont les bactériophages. Il convient donc de contrôler les levains et de prendre des
précautions contre ces microorganismes en cours de fabrication.
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3. Prélèvement, transport et préparations des échantillons
Les résultats des essais et leur interprétation sont valables et significatifs si l’échantillon soumis
est représentatif du lot et que l’intégrité du produit est assurée depuis le prélèvement jusqu’à
l’analyse. Deux objectifs principaux doivent être visés lors du prélèvement des échantillons : -
Obtenir un échantillon représentatif, c’est-à-dire qui est une image fidèle de l’ensemble d’un
lot homogène ou hétérogène, afin de conclure sur ce lot ;
- Obtenir un échantillon intègre afin d’assurer le maintien de l’état du produit tel qu’il existe au
moment de l’échantillonnage jusqu’à l’analyse. Toutes les mesures nécessaires doivent donc
être prises pour prévenir toute contamination, prolifération ou destruction microbienne durant
la manutention et l’entreposage des échantillons.
Comme pour tout échantillon soumis à des essais microbiologiques, lorsque des produits
peuvent faire l’objet d’une action légale (saisie, poursuite, confiscation ou élimination), la
chaîne de froid et la chaîne de possession doivent être respectées. Il doit être possible de
démontrer que l’échantillon a été conservé chambré, réfrigéré ou congelé, selon le cas, et qu’il
n’y a pas eu d’interruption de la possession à partir du prélèvement jusqu’à l’analyse.
3.1. Prélèvement des échantillons
La taille de l’échantillon d’un produit de même nature réparti en portions unitaires doit être au
moins de 5 unités (lieu de fabrication ou de distribution), de 5 unités pour les conserves. Le
laboratoire doit disposer d’environ 500 g de produits, soit 5 fois 100 g, ces 100 g pouvant être
fournis par une ou plusieurs pièces. Si le prélèvement de 5 échantillons s’avère trop élevé par
rapport à la production il est procédé à un étalement dans le temps des prélèvements. Ces
prélèvements doivent avant tout respecter des règles d’asepsie et de représentativité. La prise
d’essai destinée à la préparation de la suspension mère et de ses dilutions doit correspondre aux
parties superficielles et profondes notamment pour les produits en tranche, hachés, divisés et
les plats cuisinés par exemple. Pour les produits liquides elle est effectuée sur le produit
«homogénéisé» ou sur les parties superficielles et profondes. Dans le cas d’examens
microbiologiques faisant suite à une maladie de type toxi-infections alimentaires (TIA) il faut
rechercher les germes dangereux (pathogènes, toxinogènes) et leurs toxines aussi bien dans les
prélèvements de surface que dans la masse.
3.1.1. Echantillonnage
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Un échantillonnage représentatif est essentiel quand l’analyse a pour but de détecter la présence
de germes pathogènes ou de toxines qui peuvent être distribués de façon hétérogène dans
l’aliment ou quand la commercialisation d’un produit dépend de la qualité microbiologique en
relation avec les normes imposées par la législation.
L’objectif de l’échantillonnage influencera le type de plan d’échantillonnage, la nature des

paramètres demandés et l’interprétation du résultat des essais.
Il est nécessaire, en tout premier lieu, de tenir compte du contexte et d’établir le but poursuivi
lors du prélèvement des échantillons :
- complément à une visite d’inspection ;
- programme de surveillance ou étude de profil ;
- contrôle de la qualité ;
- recherche de pathogènes dans l’environnement ;
- poursuites, saisies ;
- vérification de l’efficacité des procédés de nettoyage ;
- suivi d’un résultat non conforme.
- Echantillon, une quantité de produit prélevé d’un lot et soumis à des essais en laboratoire. Un
échantillon peut consister en une ou plusieurs unités d’échantillonnage.
- Unité d’échantillonnage, portion ou contenant individuel de produit prélevé au hasard dans

un lot. Une unité d’échantillonnage peut correspondre à un échantillon.
- Cadre d’échantillonnage, le regroupement de toutes les unités qui nous intéressent, dans un
espace-temps bien défini. L’échantillon décrit la population dont il est issu pour une période de
temps et un espace précis.
Exemples :
- La vérification de la qualité de la glace comparée à la vérification de la potabilité de l’eau

utilisée pour produire la glace.
- La vérification de la qualité d’un sandwich au poulet comparée à la qualité du poulet cuit avant
manipulations.
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- Le cadre d’échantillonnage des fromages fabriqués à Sétif durant l’année en cours ne
représente pas nécessairement la population de fromages fabriqués l’année précédente, de
même qu’il ne représente pas la population des fromages fabriqués en Algérie. Dans ce cas, il
faut préciser que le cadre d’échantillonnage est l’ensemble des fromages fabriqués pendant une
année sur un territoire particulier, à Sétif.
⃝ La Commission Internationale des Normes Microbiologiques relatives aux denrées

alimentaires ou ICMSF (International Commission on Microbiological Specifications for
Foods) a défini des méthodes d’échantillonnage pour l’analyse systématique des produits
alimentaires. Le principe de base est : un échantillon analysé donne des résultats non
satisfaisants s’il renferme des microorganismes dangereux ou s’il contient des germes en
nombre supérieur à une limite au-delà de laquelle il devient potentiellement dangereux.
Les réglementations fixant des exigences obligent à prendre en considération une combinaison
de critères. Le but est de se faire une meilleure idée de la répartition de la contamination, et en
même temps d'intégrer une notion d'avertissement. Dans ce cas, les critères sont représentés par
les lettres n, M, m et c :
n étant le nombre d'échantillons individuels devant être prélevés (généralement 5, parfois 10) ;
M une valeur maximum absolue qui ne peut être dépassée par aucun des n échantillons analysés
; m une valeur maximum relative qui est toujours inférieure à M. Le symbole m représente la
limite permettant de répartir les échantillons en 2 groupes : les acceptables (valeur ≤ m) et les
inacceptables (valeur ≥ m). Pour certains microorganismes dangereux m peut être égal à 0.
c le nombre d'échantillons parmi ces n qui peuvent dépasser la valeur m (mais qui doivent
évidemment toujours être inférieurs à M).
Exemple :
Il y a pour le nombre de staphylocoques dans le fromage au lait cru une exigence dont les
valeurs sont n = 5, M = 10000/g, m = 1000/g et c = 2. Cela signifie que 5 échantillons doivent
être prélevés, qu'aucun d'entre eux ne peut contenir plus de 10000 staphylocoques par gramme
et qu'un maximum de 2 échantillons peut avoir une valeur comprise entre 1000/g et 10000/g.
Pour les pathogènes, souvent on ne mentionne que n et c=0, ce qui suppose implicitement que
M = m = 0 (pathogène absent dans tous les n échantillons).
Quand un microorganisme donné est toléré dans un aliment 3 catégories d’échantillons sont
définies :
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- catégorie 1 (acceptables sans réserve)
- catégorie 2 (acceptables mais avec une limite)
- catégorie 3 (inacceptables).
m sépare la 1ère et la 2ème catégories et M la 2ème et la 3ème (figure 1).
Figure 1. Distribution des échantillons d’après l’ICMSF
3.1.1.1. Plan d’échantillonnage
Le nombre d’échantillons à prélever est déterminé en fonction de la situation. Le plan

d’échantillonnage est grandement influencé par le risque à la santé et l’hétérogénéité du lot. Il
existe deux types de plan d’échantillonnage qui sont applicables à des systèmes «aliments-
germes- consommateurs» bien identifiés.
- Plan d’échantillonnage à 2 classes
Ce plan donne des résultats permettant de déterminer 2 classes de contaminations. Ce

type de plan n’accepte aucune tolérance et correspond le plus souvent aux conclusions : absence
dans (le résultat est bon et le produit jugé satisfaisant) ou encore présence dans (le résultat est
mauvais et le produit est déclaré impropre à la consommation). Avec un plan d’échantillonnage
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à 2 classes (catégories 1, 3), n représente le nombre d’échantillons examinés. Il existe deux
possibilités pour ce type de plan :
- utiliser la notion de présence ou absence
- déterminer la tolérance ou non des numérations supérieures à la valeur critique m
Le symbole c représente le nombre d’échantillons tolérés au-delà de la valeur seuil,

nombre qui permet de juger le lot comme satisfaisant.
Exemple : Pour les viandes de volailles contaminées en surface par Salmonella : m = 0

n=5c=1
Pour la plupart des autres produits on a avec cette bactérie et d’autres microorganismes
très dangereux (Listeria, Brucella , etc ) : m = 0, n = 5 et c = 0.
Pour les viandes de boucherie conditionnées sous vide ou non, réfrigérées ou congelées
on a pour la Flore Aérobie Mésophile m = 5.104, n = 5 et c = 0.
La rigueur du plan dépend des valeurs de n et de c. Plus grand est n pour une valeur
donnée de c, meilleure sera la qualité des lots acceptés. A l’inverse, si pour une valeur donnée
de n, c augmente, la rigueur du plan diminue.
- Plan d’échantillonnage à 3 classes
Ce plan est basé sur la reconnaissance de 3 catégories d’échantillons en fonction de leur

niveau et nature de contamination : celle inférieure ou égale à m, celle comprise entre m et le
seuil M, celle supérieure à M. La valeur S constitue le seuil de toxicité.
Avec un plan d’échantillonnage à 3 classes (catégories 1, 2, 3), il existe pour c un facteur

de précision supplémentaire qui est le nombre d’échantillons tolérés dont les charges
microbiennes sont comprises entre m et M. La présence d’échantillons entre m et M n’est pas
souhaitable mais tolérée. Pour les valeurs supérieures à M les lots ne peuvent pas être acceptés
pour la commercialisation. Ce plan à 3 classes permet de déterminer par des calculs appropriés
la probabilité selon laquelle un lot sera accepté ou refusé en fonction du nombre d’échantillons
défectueux qu’il contient. S’il n’y a pas d’échantillon avec une valeur supérieure à M on est
ramené au plan à 2 classes.
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Le plan est choisi en fonction de l’estimation du risque pour la santé et du mode
d’utilisation de l’aliment. Les germes sont classés en fonction du risque qu’ils font courir au
consommateur en :
- Germes entraînant un risque sévère (Clostridium botulinum, Salmonella typhi, S.

paratyphi, Shigella dysenteriae, Vibrio comma , Brucella melitensis, Listeria monocytogenes ,
Clostridium perfringens type C, virus de l’hépatite A).
- Germes entraînant un risque moyen avec possibilité de large diffusion (Staphylocoques

entérotoxinogènes, Salmonella typhimurium et les autres sérotypes, autres Shigella, Vibrio
parahaemolyticus , Escherichia coli entéropathogènes, Streptocoques b hémolytiques).
- Germes entraînant un risque moyen sans grande diffusion (Bacillus cereus, Brucella
abortus, Clostridium perfringens, Salmonella arizonae, Francisella tularensis, Yersinia
enterocolitica, Pseudomonas aeruginosa , Campylobacter jejuni , etc...).
Le plan à 3 classes est le plus souvent adopté ; la valeur de m est déterminée par les
résultats de l’analyse de nombreux échantillons sur des lots jugés satisfaisants. La valeur de M
est plus difficile à fixer et est fonction du produit, de la bactérie recherchée et de la méthode
employée.
Les valeurs de n et c sont choisies en fonction du niveau souhaité d’acceptabilité ou de

rejet des lots. Il est évident que plus n sera grand et plus c sera petit et meilleur sera le contrôle
réalisé.
Valeurs numériques des critères d'un plan à trois classes
m : fixé par décret (surtout fonction du germe, du consommateur type et de l'aliment)

tous les résultats égaux ou inférieurs à m sont considérés comme satisfaisants
M : seuil limite au-delà duquel les résultats sont considérés comme non satisfaisants
sans que le produit soit dangereux. Les valeurs de M sont fixées à : M = 10 m quand les
dénombrements sont réalisés en milieux solides et M = 30 m pour des numérations en milieu
liquide
n : nombre d'unités composant l'échantillon
c : nombre d'unités de l'échantillon donnant des valeurs entre m et M
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Qualité du lot
Satisfaisante ou acceptable : aucun résultat ne dépasse M
Satisfaisante : les valeurs déterminées sont inférieures à : 3 m lors de numérations en

milieu solide et 10 m en milieu liquide.
Acceptable : les valeurs déterminées sont comprises entre : 3 m et 10 m en milieu solide

et 10 m et 30 m en milieu liquide avec le plan n = 5 et c = 2.
Non satisfaisant : des valeurs supérieures à M.
⃝ Cas particulier des conserves
Les conserves doivent satisfaire à des épreuves permettant de vérifier leur stabilité /
stérilité. Ces épreuves consistent en deux étuvages de 5 échantillons à 37°C pendant 7 jours (ou
à 30°C pendant 10 jours) et à 55°C pendant 7 jours. A l’issu de ces épreuves on observe
l’éventuel bombage (il faut aussi que le pH entre les unités étuvées et les unités témoins ne
dépasse pas 0,5).
Par microscopie (après étalement d’un volume donné voisin de 10 μl de produit puis
fixation et coloration au bleu de méthylène par exemple) on compte sur 20 champs le nombre
de germes respectivement observés à partir de la boîte incubée (n) et de la boîte témoin (n’). n
/ n’ doit être inférieur à 100.
3.1.2. Fréquence des prélèvements
L’échantillonnage doit être réparti dans le temps en fonction du niveau de production et

des risques de contamination.
3.1.3. Conditions du prélèvement
Les conditions essentielles à respecter pour le prélèvement sont d’abord le respect des
règles d’asepsie (travail correct du microbiologiste) et la non modification des flores présentes
dans le produit. Dans la mesure du possible, les échantillons du produit à analyser doivent être
amenés au laboratoire dans leur conditionnement d’origine, ce qui évite certaines
contaminations.
Si le produit se présente sous forme de grands volumes (réservoirs à lait etc...) s’assurer
de la bonne homogénéité de la répartition des micro-organismes ; une partie représentative du
produit sera prélevée stérilement. Il est parfois nécessaire de réaliser des prélèvements à divers
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niveaux de l’aliment (surface, profondeur d’un aliment solide) ou après broyage et
homogénéisation.
Les manipulations effectuées au cours du prélèvement ne doivent en aucun cas être à

l’origine d’une contamination : nécessité d’utiliser des instruments stériles et de travailler
stérilement.
Certains instruments doivent être stérilisés sur les lieux du prélèvement. Le trempage
dans l’alcool et le flambage sont parfois insuffisants car la température atteinte n’est pas assez
élevée. Il est nécessaire d’utiliser des flacons propres, secs, étanches, à col large stérilisés au
four Pasteur (30 minutes à 1 heure à 170° - 180°C ou 2 heures à 160°C ce qui a pour but d'éviter
le brunissement du coton) ou par autoclavage à 121°C pendant 30 min ou encore à usage unique
et stériles ; leur taille doit être adaptée au volume de l’échantillon. Les récipients peuvent être
en verre, en métal ou en matière plastique (polyéthylène, polycarbonate, polypropylène). Les
récipients de prélèvement doivent posséder un système de fermeture hermétique. Le
prélèvement d’un produit non emballé doit être réalisé dans la zone de stérilité d’un bec bunsen
ou d’un système équivalent.
3.1.4. Prélèvement en surface
L’objectif de ce prélèvement est l’évaluation du nombre de bactéries sur des surfaces

(tables de travail, ustensiles, verres, etc.) et la vérification des procédures de nettoyage et
d’assainissement.
- Ecouvillonnage, un écouvillon de coton hydrophile est immergé dans une solution

stérile de Ringer au 1/4 ou dans un bouillon tryptone-sel additionné de Tween (0,5‰). Le
prélèvement est effectué par frottement sur la surface du produit ; l’écouvillon est alors immergé
dans 10 ml de Ringer au 1/4 ou 10 ml de bouillon tryptone-sel. L’analyse est réalisée à partir
de la suspension ainsi obtenue (figure 2)
Figure 2. Ecouvillonnage
15
- Rinçage : cette méthode est utilisée dans le cas de récipients ou de tuyauteries ; un volume
connu de solution stérile est introduit dans le matériel à analyser. Après agitation, le liquide est
récupéré et soumis à l’analyse.
- Méthode des empreintes : un ruban adhésif préalablement stérilisé par les UV est appliqué
sur la surface à étudier. Après quelques secondes de contact il est retiré et appliqué sur la surface
d’un milieu gélosé approprié. Après quelques heures de contact à la température d’incubation
désirée il est retiré et la boîte est incubée jusqu’à apparition des colonies.
- Méthode du cylindre : un cylindre creux de section connue est appliqué sur la surface à
analyser ; on y introduit alors quelques ml de diluant stérile et après quelques secondes de
contact, le diluant est retiré et analysé.
3.1.5. Prélèvement de produits liquides
La technique varie avec le produit, le volume et la forme du contenant. Il faut néanmoins

toujours s’assurer de la parfaite homogénéisation du liquide (agitateurs) avant de prélever à la
pipette (ou avec un flacon lesté stérile ou autre) le volume nécessaire à l’analyse.
3.1.6. Prélèvement de produits solides
Selon le produit, le prélèvement sera effectué au scalpel, à la sonde (fromages et produits mous)
ou à la pipette harpon. La surface est souvent éliminée avant de procéder au prélèvement. Si le
produit est hétérogène (plats cuisinés, conserves etc.) il faut s’assurer de la bonne
représentativité du prélèvement.
3.2. Emballage et transport des échantillons
Quand le prélèvement aseptique a été réalisé, chaque échantillon doit être identifié ; toutes les
informations doivent figurer sur l’étiquette de prélèvement et être inscrites à l’aide d’un crayon
à encre indélébile. Identifier, si nécessaire, un code ou un numéro qui relie l’échantillon au lot
d’origine.
Noter la température initiale, l’heure du prélèvement, la date et la température de transport.
Les échantillons doivent être immédiatement réfrigérés (dans une glacière propre) s’ils ne sont
pas stables à température ambiante. Les échantillons dont la conservation est assurée à
température ambiante, tels les boîtes de conserve et les produits secs, peuvent être expédiés sans
réfrigération.
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Les échantillons sont alors transportés le plus rapidement possible au laboratoire en maintenant
les conditions initiales dans lesquelles se trouvait le produit. L’analyse devrait être réalisée dans
l’heure qui suit le prélèvement.
Pour un produit congelé s’assurer qu’il n’y ait pas de décongélation pendant le transport (ce
produit peut être gardé pendant 1 mois avant d’être analysé). La congélation d’un produit
provoque une diminution plus ou moins importante du nombre de germes qu’il contient. Il faut
veiller à ce que la température du produit prélevé soit au moins égale à -18°C, transporter le
produit à cette température et décongeler à l’air ambiant à température voisine de 20°C pendant
un temps inférieur à 3 heures, temps suffisant pour atteindre une texture qui permette le
prélèvement.
3.3. Préparation de l’échantillon
Quelle que soit la nature initiale du produit, l’analyse microbiologique s’effectue toujours à
partir d’une suspension. Après ouverture aseptique, l’échantillon sera «homogénéisé» (liquide)
ou broyé dans un volume connu de diluant stérile (solide) ce qui constitue en fait la première
dilution.
Figure 3. Broyeurs pour échantillons solides
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Pour les produits liquides (ou semi-liquides) une agitation manuelle vigoureuse en présence
de billes de verre permet d’obtenir une homogénéité satisfaisante.
Pour les produits solides diverses techniques de «broyage» sont utilisables :
Broyage manuel au Potter ou en présence de sable stérile ou de billes de verre (mortier) ; ou

broyage avec un broyeur électrique à couteaux (figure 3). Au cours du broyage les germes
doivent être dispersés mais non détruits ; la température ne doit pas trop s’élever (le récipient
peut être placé dans de la glace). Le broyage s’effectue en général avec 10 volumes (ou 9) de
diluant pour 1 “volume” de produit (par exemple 10 g de produit et 100 ml (ou 90) de diluant
stérile). Le diluant peut être de l’eau distillée, de l’eau physiologique, du Ringer au 1/4 ou une
solution tryptone-sel, etc.
3.4. Techniques de dilutions
Au cours de la préparation des échantillons (et des dilutions) les microorganismes peuvent être
inhibés ou même altérés par le changement du milieu lié à l’addition de diluant (changement
de pH mais surtout de force ionique). L’effet bactéricide de certains diluants est connu : ainsi
Staphylococcus aureus est «tué» en quelques heures dans de l’eau distillée de même que la
plupart des entérobactéries (E. coli) ; il en est de même pour Streptococcus pyogenes dans du
sérum physiologique ou dans du Ringer au 1/4 et pour Escherichia coli dans de l’eau salée à
8,5‰. Actuellement il paraît souhaitable, sauf indication complémentaire à un type donné de
produit à analyser, de réaliser les préparations et les dilutions des échantillons à analyser dans
une solution de tryptone sel. Tous ces diluants (tableau 1) sont stérilisés à 121°C pendant 20
minutes.
Tableau 1. Composition de certains diluants
18
Les dilutions nécessitent la présence de nombreux tubes à essais contenant le plus souvent 9 ml
de diluant stérile et de nombreuses pipettes stériles de 1 et 10 ml. Les pipettes peuvent être
remplacées par des systèmes de pipetage automatique munis de cônes à usage unique (figure
4).
Toutes les manipulations sont à effectuer avec toutes les précautions d’asepsie exigées en
microbiologie. L’introduction éventuelle d’un contaminant ou la contamination de l’opérateur
ne doivent jamais se produire.
Figure 4. Préparation des dilutions
Le récipient contenant le liquide à diluer est agité manuellement avec précaution pour éviter les
projections pendant une dizaine de secondes.
On prélève stérilement 1 ml de ce liquide (aspirer et refouler une fois avant le prélèvement) que
l’on introduit dans un tube contenant 9 ml de diluant stérile.
Le tube est agité par des mouvements de rotation ou au moyen d’un Vortex. On obtient ainsi
une dilution au 1/10.
Avec une nouvelle pipette de 1 ml on prélève 1 ml de cette dilution que l’on introduit dans un
nouveau tube de diluant de 9 ml ; on obtient une dilution au 1/100 et ainsi de suite jusqu’au
niveau de dilution recherché.
19
3.5. La revivification
Les micro-organismes sont souvent «endommagés» mais non tués au cours des traitements
technologiques (déshydratation, chaleur, froid, etc.) appliqués aux produits alimentaires ou par
suite de leur vieillissement. Ces altérations se reflètent dans certaines de leurs propriétés
physiologiques en particulier au niveau de leur phase de latence qui est augmentée ou de leurs
besoins nutritionnels ou encore quant à leur sensibilité aux conditions de milieu défavorables
(pH, sels biliaires, colorants, sels, etc.). En général ces altérations sont réversibles et après leur
disparition les bactéries récupèrent leurs propriétés initiales, en particulier au niveau de leur
croissance ou de leur pouvoir pathogène.
La nécessité de faciliter le «rétablissement» des cellules ayant subi des altérations sublétales,
c’est-à-dire leur «réanimation» ou encore leur revivification, s’impose avant de les soumettre à
des milieux sélectifs souvent peu favorables à la croissance du fait de la présence d’inhibiteurs.
En effet, la présence de cellules endommagées peut entraîner des variations dans les
numérations ou porter à croire qu’il n’y a pas ou peu de germes et donc pas ou aucun risque
pour le consommateur. Ceci est particulièrement important quand il s’agit de déterminer si des
micro-organismes pathogènes ou indicateurs sont présents ou non.
4. Techniques classiques de numérations
Le terme « dénombrement d’une flore » signifie que l’analyse microbiologique doit permettre
de quantifier dans l’échantillon une flore particulière. Le résultat d’une telle analyse
quantitative est rendu sous forme d’une concentration en micro-organismes (appartenant à une
flore particulière) par unité de masse ou de volume d’échantillon.
Bien que de nombreuses techniques de numération soient utilisables, il n’existe pas à l’heure
actuelle de technique parfaite. Certaines méthodes ne permettent pas de différentier les germes
vivants des germes morts, d’autres s’avèrent incapables de compter individuellement les
cellules microbiennes lorsque celles-ci sont associées (Staphylococcus, Streptococcus,
mycélium, etc) et permettent d’évaluer des unités formant colonies (UFC) ou des unités formant
trouble (UFT)
4.1. Numération microscopique
Il s’agit d’un dénombrement par observation directe ; la numération cellulaire est réalisée par
comptage au microscope, à l’aide d’une lame de comptage spéciale ou cellule de numération
20
ou hématimètre (Cellule de Malassez) (figure 5). En effet, Il existe deux grands types principaux
de cellules de numération (Cellule de Thoma et la Cellule de Malassez, la plus courante).
Figure 5. Cellule de Malassez
Une cellule de numération est une lame porte objet dans laquelle est creusée une chambre de
comptage de volume connu. C’est une lame épaisse en verre, comportant des rigoles et un
quadrillage.
Lorsque la suspension cellulaire est trop concentrée, il est nécessaire de réaliser une dilution
préalable de façon à permettre le comptage des cellules au microscope.
Le volume de comptage est déterminé par la surface du quadrillage gravé sur la lame et la
profondeur de la chambre. Le volume correspondant au quadrillage total est égal à 1 mm3 =
10-6 dm3 (10-3 cm3 donc 1μl), Chaque rectangle correspond à un volume 100 fois plus faible,
soit 0,01 mm3 = 10-8 dm3.
21
• Humecter les deux plateaux latéraux. Faire adhérer parfaitement la lamelle aux plateaux
latéraux : pour cela placer la lamelle sur ces plateaux, puis à l’aide des pouces posés sur la
lamelle, exercer une pression sur la lamelle tout en pratiquant un mouvement de va et vient
jusqu’à perception d’une résistance.
• Placer la cellule de comptage sur une surface plane. Homogénéiser la suspension cellulaire,
et prélever celle-ci à l’aide d’une pipette Pasteur. Remplir la chambre de comptage par
capillarité, en plaçant la pointe de la pipette légèrement inclinée près de la lamelle sur la plate-
forme centrale quadrillée. Le remplissage doit être fait en une seule fois, sans bulles d’air, et
sans faire déborder le liquide dans les rigoles. Laisser sédimenter les cellules sur le quadrillage
quelques minutes, et passer à la numération.
• Observer à l’objectif x10 pour repérer la position du quadrillage, et vérifier l’homogénéité de

la répartition des cellules à compter (si la répartition est mauvaise, recommencer).
• Observer ensuite à l’objectif x40 pour réaliser le comptage (1 rectangle par champ).
• Compter les cellules contenues dans 4, 10, 20 ou dans la totalité des 100 rectangles du
quadrillage.
Remarque : pour les cellules chevauchant les lignes de quadrillage, compter seulement celles
qui chevauchent 2 arêtes du rectangle sur 4 (en pratique, on choisit de prendre en compte les
cellules chevauchant la ligne horizontale supérieure, et la ligne verticale droite).
Figure 6. Lecture de la cellule de Malassez
22
• Après utilisation, la lame porte-objet et la lamelle planée sont immergées dans un bain d’eau
de Javel pendant 5 minutes, puis sont rincées avec de l’eau distillée et essuyées avec du papier
(sans frotter, en particulier au niveau du quadrillage).
Après avoir effectué la manipulation, on calcule la concentration cellulaire de la suspension de

cellules étudiée. N = (n /V) x f
-n : nombre de cellules comptées
-V : volume de comptage
-f : facteur de dilution
-N : nombre de cellules par litre
4.2. Numération en milieu solide
Cette méthodologie est le plus fréquemment réalisée dans des boîtes de Pétri. Elle repose sur le
principe que toute bactérie vivante introduite dans la masse ou en surface d’un milieu gélosé
favorable donne en principe naissance après incubation à une colonie macroscopique. Le
nombre total de colonies correspond alors au nombre d’UFC présents dans l’inoculum.
4.2.1. Technique de numération dans la masse de la gélose
Les milieux gélosés (répartis en erlenmeyer ou en flacon de 15 ml) sont liquéfiés au bain-marie
bouillant ou au four à micro-ondes, puis maintenus en surfusion dans un bain-marie à 45 ±1°C.
1 ml du liquide dans lequel on veut connaître le nombre de micro-organismes est introduit au
centre de la boîte de Pétri posée bien à plat dans la zone de protection du bec Bunsen.
L’inoculum peut être réparti en gouttes sur le fond de la boîte. Afin de n’utiliser qu’une seule
pipette stérile pour toutes ces opérations il est recommandé de commencer l’ensemencement
par la dilution la plus grande pour terminer avec le liquide non dilué. Les essais sont pratiqués
en duplicata (ou triplicata si possible) pour chaque dilution.
Sur chaque boîte l’origine de l’analyse, le milieu utilisé et la dilution correspondante sont
enregistrés (sur le côté de façon à ne pas être gêné par la suite pour le comptage).
4.2.2. Technique de numération en surface de la gélose
100 à 500 microlitres (pipette graduée ou mieux pipette automatique) du milieu à analyser sont
déposés à la surface de la gélose et immédiatement répartis de façon uniforme à la surface du
milieu au moyen d’un ensemenceur stérile du type pipette râteau. La pipette râteau est
23
«stérilisée» entre deux étalements par immersion dans de l’éthanol, l’éthanol adsorbé sur le
verre étant ensuite enflammé.
Après la période d’incubation nécessaire, procéder au comptage des colonies pour chaque
boîte contenant moins de 300 colonies. Dans le cas de microorganismes donnant des colonies
de taille élevée, la valeur 300 paraît très élevée. Il est possible que 2 unités microbiennes ou
plus se retrouvent à proximité immédiate lors de l'inoculation et donnent une seule grosse
colonie.
Le calcul de la concentration en micro-organismes [N] présents dans l’échantillon essai est

une moyenne pondérée à partir des résultats de 2 dilutions successives.
Pour que le calcul soit valable, il est nécessaire de compter sur au moins une boîte contenant au
moins 15 colonies.
• Σc la somme de toutes les colonies comptées sur toutes les boîtes retenues (et tel que au moins
une des boîtes comptées contenait au moins 15 colonies).
• V le volume inoculum appliqué à chaque boîte (généralement 1ml en masse et 0.1ml en

surface)
• n1 le nombre de boites retenues à la première dilution (en général 2).
• n2 le nombre de boites retenues à la deuxième dilution (en général 2).
• d le taux de dilution de la première dilution retenue pour les comptages sur boîte.
Arrondir le résultat calculé à deux chiffres significatifs.
Si aucune boîte ne contient au moins 15 colonies, faire la moyenne arithmétique des colonies
comptées sur les 2 boîtes de la plus petite dilution d et tenir compte de cette dilution. Bien
préciser dans l’expression du résultat qu’il s’agit alors d’une estimation en rédigeant ainsi : «
nombre estimé de micro-organismes par millilitre = ... ».
24
4.2.3. Dénombrement après filtration sur membrane
Dans certains produits liquides (eau, solutés pharmaceutiques buvables ou injectables...), les
microorganismes sont à une concentration très faible (voire nulle si le produit est stérile). Leur
dénombrement (en UFC par unité de volume) impose donc de «concentrer les
microorganismes» pour pouvoir compter des colonies. Cette méthode consiste à faire passer un
certain volume d’échantillon (ou de ses dilutions) au travers d’une membrane filtrante dont la
porosité moyenne de 0,45 μm ou 0,22 μm sur laquelle sont retenus les microorganismes
recherchés.
Le filtre est alors posé sur la surface d’un milieu gélosé, face portant les micro-organismes vers
le haut. Après incubation, les colonies formées à la surface du filtre sont comptées.
Figure 7. Filtration sur membrane
Le nombre de colonies présentes sur la membrane permet de calculer la concentration

bactérienne N en nombre d’Unités Formant Colonie (UFC) par ml selon la formule :
Où n : nombre d’UFC sur la membrane, V : volume de produit filtré en ml
25
4.3. Numération en milieu liquide
Cette méthode présente certains avantages tels que la possibilité d’étudier un caractère
biochimique du germe difficilement mis en évidence sur milieu gélosé comme la production de
gaz (cloche) ou encore d’effectuer facilement la numération avec une phase de revivification.
Si les conditions optimales de croissance sont réunies, un seul micro-organisme présent dans
l’inoculum introduit dans un milieu liquide se développe en y créant un trouble. La lecture des
tubes contenant le milieu liquide et ensemencés avec l’inoculum est de type binaire :
- Résultat négatif si absence de trouble et/ou de modification du milieu : il y a moins de un

microorganisme présent dans l’inoculum introduit dans le milieu liquide ;
- Résultat positif si présence de trouble et/ou de modification du milieu : il y avait au moins un

microorganisme présent dans l’inoculum introduit dans le milieu liquide.
Le volume de l’inoculum : le plus souvent = 1 ml (parfois 10 ml)
Le choix des dilutions à tester : dépend de la population estimée, le but étant d’obtenir, pour
une analyse statistique optimale des résultats :
- une dilution contenant moins d’un microorganisme dans l’inoculum utilisé
- une dilution contenant plus d’un microorganisme dans l’inoculum utilisé
Le choix du nombre d’essais par dilution dépend de la précision souhaitée pour les résultats en
fonction de leur analyse statistique. En général trois tubes sont ensemencés par dilution, un ou
deux tubes sont ensemencés si une précision moins importante est suffisante, cinq tubes ou
même plus sont ensemencés si une précision plus importante est demandée.
4.3.1. Dénombrement à un seul essai
Dans ce cas, 1 tube par dilution est ensemencé avec 1 ml d’inoculum. Exemple de résultats
obtenus (tableau 2) :
26
- il y a au moins un micro-organisme dans l’inoculum (1 ml) de la plus grande dilution (10-2)
présentant encore un trouble : la concentration est donc d’au moins 102 micro-organismes par
ml de produit ou de « suspension mère » non dilués ;
- il y a moins de un micro-organisme dans l’inoculum (1 ml) de la première dilution (10-3) ne

présentant plus de trouble : la concentration est donc strictement inférieure à 103 micro-
organismes par ml de produit ou de « suspension mère » non dilués.
Le résultat peut s’exprimer selon l’intervalle : 102 ≤ N micro-organismes/ml < 103. La

concentration du produit analysé est comprise entre 102 et 103 micro-organismes dans 1 ml.
4.3.2. Dénombrement à essais multiples «technique du nombre le plus probable NPP»
Cette méthode repose sur une analyse statistique et fournit par calcul des nombres les plus
probables (NPP). Ce dénombrement s’effectue en utilisant les tables de Mac Grady, le nombre
caractéristique de la série réalisée est une combinaison de trois chiffres :
- Chaque chiffre correspond au nombre de tubes « positifs » pour une dilution donnée ;
- Les trois chiffres correspondent à trois dilutions successives ;
- Le chiffre des centaines correspond à la plus faible dilution (donc à la plus forte concentration
en micro-organismes), celui des dizaines à la dilution intermédiaire et celui des unités à la plus
grande dilution.
Parmi les différentes combinaisons, celle correspondant au nombre le plus grand et, si possible,
inférieur à 330 est retenue (correspond à une meilleure répartition des micro-organismes dans
les dilutions).
27
Tableau 3. Dénombrement par la technique du nombre le plus probable
Exemple (tableau 3) : cinq dilutions ont été ensemencées à raison de trois essais par dilution ;
trois combinaisons (de trois chiffres) sont possibles avec les résultats obtenus. Parmi les trois
combinaisons de trois chiffres possibles (332 ; 321 ; 210), laquelle choisir ? Le nombre le plus
élevé et inférieur à 330 est sélectionné ; dans cet exemple, il s’agit de 321. Si les dilutions sont
insuffisantes, on peut utiliser des nombres caractéristiques comme 333, 332 ou 331.
Le nombre caractéristique de la série est reporté dans une table statistique de Mac Grady
(tableau 4). On y lit le Nombre le Plus Probable (NPP) de microorganismes présents dans
l’inoculum de la dilution correspondant au chiffre des centaines du nombre caractéristique.
Exemple : 321 correspond au NPP de 15. Cela signifie qu’il y a statistiquement quinze bactéries
dans l’inoculum de la dilution 10-(n+1).
Le résultat est exprimé selon l’équation :
N : nombre de micro-organismes par ml de produit ; NPP : nombre lu dans la table ; K : facteur

de dilution (inverse de dilution) correspondant au chiffre des centaines du nombre
caractéristique (combinaison retenue) ; V : volume de l’inoculum (1ml en général).
28
Si le produit analysé est solide, on prépare une « suspension mère » de produit en introduisant
« x » g de produit dans « 9 x » ml de diluant. Cela correspond à une dilution au 1/10 du produit.
Le nombre de microorganismes par g de produit analysé est donc N x 10.
D’autres méthodes préconisent le nombre caractéristique le plus faible portant de préférence

«0» dans la colonne des unités (par exemple dans ce cas 210).
5. Autres méthodes d’évaluation de flores microbiennes
5.1. Spectrophotométrie
Le trouble d’une suspension microbienne (bactéries, levures) est proportionnel à la biomasse

présente dans la suspension. Cette technique ne distingue pas la biomasse morte de la vivante,
mais son intérêt principal est sa rapidité et sa facilité d’application. La mesure peut se faire à
l’aide d’un spectrophotomètre en assimilant l’absorbance mesurée entre 600 et 650 nm à celle
du trouble. Ce principe est également celui de la méthode des étalons de Mac Farland (solutions
troubles obtenues traditionnellement par précipitation de sulfate de baryum). On peut comparer
visuellement le trouble d’une suspension microbienne à celui d’un étalon artificiel pour en
29
estimer sa concentration. En effet, le trouble développé par chaque étalon est assimilable à une
concentration bactérienne selon le tableau de correspondance suivant :
Tableau 5. Concentration cellulaire approximative par spectroscopie
5.2. Spectrométrie de masse
La spectrométrie de masse peut être utilisée dans les laboratoires de microbiologie comme une
alternative ou un complément aux techniques d’identification de bactéries. L’analyse nécessite
une colonie isolée, à partir de laquelle le spectre de masse obtenu est comparé avec la
bibliothèque de spectres de l’appareil. Une identification est alors proposée avec une indication
du niveau de confiance allant de 0 à 3. L’identification est correcte pour plus de 80% des isolats
voire davantage. La lyse incomplète des bactéries peut-être l’une des causes d’une non-
identification. L’enrichissement progressif de la bibliothèque de spectres contribue à réduire les
erreurs d’identification de microorganismes rares.
5.3. Cytométrie de flux
Il s’agit d’une alternative rapide (24 h) pour réduire le temps de stockage en industrie
agroalimentaire pour remplacer la méthode traditionnelle lente. La technique est basée sur le
marquage fluorescent des organismes viables présents dans le produit. L’échantillon à analyser
est envoyé dans une veine liquide. Un rayon laser permet d’activer la fluorescence des bactéries
vivantes. Un système optique permet de détecter et de mesurer l’émission de fluorescence. La
comptabilisation des signaux détectés pour un volume d’échantillon donné permet de connaître
le nombre de bactéries vivantes par unité de masse ou de volume de l’échantillon à analyser.
5.4. Impédancemétrie
L'évaluation de la qualité bactériologique à l'aide des techniques normalisées pose souvent des
problèmes à l'industriel qui désire connaître rapidement la qualité de la matière première mise
en oeuvre. L'impédance est une technique indirecte d'estimation d’une flore microbienne. Elle
30
utilise les modifications de conductance d'un milieu de culture, en raison de la croissance et du
métabolisme de la flore microbienne de l'échantillon. Ces modifications sont liées à la
dégradation des substrats du milieu en molécules plus petites, plus mobiles et d'une charge
électrique plus élevée comme celle des protéines en acides aminés ou des hydrates de carbone
en lactate.
Généralement, cette production d'ions devient suffisante pour entraîner une modification
significative de la conductance du milieu (seuil de détection) lorsque le niveau de la population
microbienne atteint 106 à 108 micro-organismes/ml. Le temps (ou nombre de doublements de
la population) nécessaire pour atteindre le seuil de détection sera d'autant plus grand que le
niveau de germes initial sera faible.
Il existe une relation linéaire décroissante entre le temps de détection du changement de

conductance et le nombre initial de micro-organismes.
6. Identification des microorganismes
La connaissance des caractéristiques phénotypiques, génotypiques et biologiques d'un

microorganisme est essentielle pour le différencier des autres microorganismes. Cependant,
l’identification reste difficile car il n’y a pas une seule méthode universelle, certaines marchent
pour des microorganismes mais pas d’autres. La majorité des bactéries ne sont pas cultivables
(entre 0,1 et 10% cultivables). Plusieurs démarches sont nécessaires et possibles pour identifier
un microorganisme et définir une espèce.
6.1. Caractères morphologiques
L’étude simple par microscopie permet de distinguer la forme d’une bactérie par exemple. La
forme d’un microorganisme est un caractère stable conditionnée par l’expression coordonnée
de nombreux gènes, une similitude morphologique sous-entend une parenté phylogénétique.
Les bactéries peuvent être sous forme de coque, bacille, spiralée, filamenteuse. Chez certaines
on peut retrouver des formes étoilées ou carrées.
D’autres caractères morphologiques sont pris en considération comme la mobilité (implantation

de flagelles), la présence de capsule, présence de spore (sa position et si elle est déformante).
L’observation en microscopie est nécessaire mais insuffisante pour répertorier des espèces
bactériennes. En plus la forme bactérienne n’est pas un caractère stable. Les structures
31
facultatives ne sont pas forcément présentes (perte momentanée du flagelle, spore). Chez les
bactéries il n’y a aucun lien entre forme et phylogénie.
6.2. Caractères culturaux
Les types tropiques sont déterminés par la source de carbone et la source d’énergie
(photolithotrophes, photoorganotrophes, chimiolithotrophes, chimioorgatrophes). Le type
tropique dépend du génome et son expression.
L’étude de la croissance s’effectue sur des milieux naturels, complexes ou synthétiques. Un

milieu électif facilite la croissance d’un microorganisme comparé à d’autres microorganismes.
Un milieu sélectif est utile en rajoutant des substances toxiques pour garder la bactérie à tester.
L’examen macroscopique permet de voir comment la bactérie s’est développée sur son milieu
de culture (forme, aspect, couleur).
Les relations vis-à-vis de l’oxygène sont un critère pour différencier des bactéries. Les
bactéries ont besoin d’enzymes pour dégrader l’oxygène (peroxydases). Pour mettre en
évidence les relations des germes avec l’oxygène, un milieu gélosé en tube est ensemencé et
permet d’avoir un gradient d’oxygène du haut vers le bas.
- Aérobie strict : utilisation d’oxygène ;
- Aérobie facultatif : plusieurs types métaboliques, densité plus importante avec oxygène ;
- Anaérobie obligatoire : absence d’oxygène ;
- Anaérobie aérotolérant : oxygène ne favorise pas la croissance ;
- Micro-aérophiles : oxygène ne doit pas être trop important.
6.3. Composition chimique
La paroi des bactéries à Gram positif est différente de celle des Gram négatif. Une coloration
de Gram permet de mettre en évidence les différentes parois. Mais il y a des bactéries à Gram
«variable». Dans certains cas la coloration prend et dans d’autres non. Dans ce cas un test à la
potasse est effectué pour distinguer les Gram+ des Gram- (les bactéries à Gram négatif forment
un filament entre la lame et l’oese).
Les cytochromes, des protéines impliquées dans les séries de transports d’électrons. Ils existent
sous une forme réduite et une forme oxydée. Les cytochromes possèdent des propriétés
spectrales et donnent deux spectres (un pour la forme réduite et l’autre pour la forme oxydée),
32
il y a un décalage plus ou moins important du pic sur les deux spectres. Ce décalage est
spécifique des différents cytochromes. Ce critère n’est pas utilisé seul mais il peut être très
pertinent utilisé avec d’autres.
6.4. Caractéristiques métaboliques
Il y a une extrême diversité entre les différents métabolismes bactériens. Il a y a donc des
équipements enzymatiques très différents et spécifiques de certains groupes bactériens.
L’identification (figure 8) est effectuée en utilisant des tubes à essais contenants différents
substrats avec des indicateurs colorés. Mais cette méthode est difficile pour typer des bactéries
: grand nombre de tubes, procédure longue.
Il existe des systèmes miniaturisés comme la galerie API, mini-cuves dans lesquelles il y a
divers substrats incubés avec la bactérie à étudier. La coloration des différentes cupules est
comparée au catalogue/logiciel. Méthode très utilisée car très simple d’utilisation, peu
d’encombrement, peu chère. Mais est-ce que les réactions choisies par le constructeur sont
pertinentes ?
Figure 8. Galeries d’identification
33
6.5. Caractéristiques sérologiques
Lorsqu’un corps étranger entre dans un organisme, il y a synthèse d’anticorps spécifiques des
antigènes. Les anticorps sont utilisés pour l’identification bactérienne car ils sont spécifiques.
Pour cela il faut disposer d’anticorps pour constituer une sérothèque (des souches bactériennes
sont injectée à des lapins et vont produire des anticorps qui seront prélevés). La réaction
antigène-anticorps forme un précipité visible à l’oeil nu. Plusieurs tests sont utilisés (test de
l’anneau de précipitation, test d’immunodiffusion d’Ouchterlony, réactions d’agglutination,
marquage des anticorps pour faciliter la visualisation, Méthode ELISA, …).
6.6. Pouvoir pathogène
Pour des bactéries pathogènes, dans certains cas l’analyse des symptômes de l’hôte contribue
au moins partiellement à la détermination de la bactérie.
En plus de ces méthodes l’identification des microorganismes peut se faire en utilisant des
approches moléculaires.
7. Réalisation du contrôle
La maîtrise de la qualité microbiologique (hygiénique obligatoire et marchande souhaitée par

le fabricant mais aussi le consommateur) passe par un ensemble de démarches qui vont du
contrôle (des matières premières brutes, en cours de transformation ou de produit fini) aux
pratiques de bonnes fabrications en passant par l’identification des principaux points critiques
du système de production / distribution, le plus souvent par une démarche HACCP (Hazard
Analysis Critical Control Point ou système d'analyse des dangers et points critiques). Ces
analyses prennent aujourd’hui largement place dans la plupart des usines et des réseaux de
distribution et permettent (par la réalisation de contrôles judicieux, une bonne évaluation de la
qualité et une mise en évidence d’éventuelles contaminations) les actions correctives qui en
découlent.
7.1. Contrôle des matières premières
Le contrôle microbiologique des matières premières doit permettre de vérifier que celles-ci ne
renferment pas de microorganismes risquant de gêner le déroulement de la fabrication ou, de
microorganismes qui, ne pouvant être éliminés par les technologies mises en oeuvre, pourraient
altérer le produit fini. Il faut distinguer les biotechnologies comprenant une étape de
fermentation ou non.
34
- Avec fermentation
Pour qu’une fermentation se déroule dans de bonnes conditions, il faut, théoriquement,

ensemencer le levain dans un milieu stérile, sauf dans des cas particuliers où la fermentation est
conduite avec des microorganismes indigènes.
Le contrôle des matières premières dans les industries de fermentation est ramené le plus
souvent, à un contrôle de stérilité ou à un contrôle de propreté microbiologique du milieu. En
effet, si pour certaines industries (antibiotiques, acides aminés,…), le milieu doit être stérile,
pour d’autres, comme la brasserie, un milieu faiblement contaminé peut être utilisé, mais il ne
faut pas qu’il renferme de microorganismes spécifiquement dangereux pour cette industrie.
- Sans fermentation
Dans le cas de bio-industries ne mettant pas en oeuvre une fermentation (technologie

enzymatique), la qualité microbiologique doit être maintenue à l’aide des facteurs physico-
chimiques habituels : pH, activité de l’eau (Aw), température. Au niveau des matières
premières, les contrôles microbiologiques consistent à rechercher les microorganismes
potentiellement dangereux.
7.2. Contrôle de la fabrication
Dans les industries de fermentation, les contrôles consistent essentiellement à apprécier

l’évolution des populations microbiennes dans le milieu au cours du temps, aussi bien le
développement du levain que l’apparition et le développement des contaminants.
Pour ces contrôles, les techniques microscopiques sont les plus utilisées :
- La technique du compte-cellule permet de faire une numération approximative des cellules de

levain et donc permet de vérifier son développement. Les techniques de coloration (gram, bleu
de méthylène) permettent d’évaluer une contamination bactérienne dans le cas de levains à
champignons (levures ou moisissures) mais aussi dans le cas des levains bactériens par les
différences de formes ou de Gram des contaminants par rapport aux bactéries du levain.
- La technique d’immunofluorescence peut être utilisée pour la recherche de contaminations

bactériennes dans les moûts de fermentation.
- la cytométrie de flux permet de détecter plusieurs types de microorganismes séparément (ex,

des bactéries et des levures). Cela peut être appliqué au suivi de fermentation en culture pure
35
(détection de contaminants) ou en culture mixte (évaluation simultanée du développement de
chaque population).
- les méthodes de culture peuvent être utilisées quand un délai de réponse est toléré.
- Dans les industries utilisant des cultures aérées, des contrôles sur l’efficacité des systèmes de
filtration stérilisante de l’air sont nécessaires.
- Dans les industries ne présentant pas une étape de fermentation, les paramètres de
transformation (s’ils sont bien maitrisés) ne permettent que quelques développements
microbiens. Au cours de ces processus, le contrôle microbiologique porte sur la recherche de
germes dangereux.
7.3. Contrôle du nettoyage et de la désinfection
Entre deux fabrications, les locaux et les installations doivent être nettoyés et désinfectés avant
d’être réutilisés. Les barèmes de désinfection (nature du produit, concentration/temps de
contact) sont définis en fonction de la nature et du nombre de microorganismes à détruire.
Différentes techniques sont applicables suivant les matériels à contrôler.
- Pour les contrôles microbiologiques des surfaces, les techniques les plus utilisées sont les
techniques par impression. Elles consistent à prélever les germes de ces surfaces par contact
direct avec le milieu de culture qui sert à les révéler. Cette technique peut être mise en oeuvre
avec les boites «contact» ou tampon de gélose ou avec les lames gélosées (figure 9). Ces lames
existent avec différents milieux de culture selon le type de microorganismes recherchés.
Figure 9. Lames gélosées
36
Pour le contrôle de dispositifs moins accessibles (robinet, canules, …), il est recommandé
d’utiliser la technique d’écouvillonnage : l’écouvillon imprégné de liquide stérile est frotté sur
le dispositif à contrôler puis immergé et agité dans un liquide stérile. L’analyse de ce liquide
est effectuée par des techniques classiques et donne des indications sur le niveau de
contamination et la nature des germes présents.
La technique d’ATP métrie est bien adaptée au contrôle des traitements de nettoyage-
désinfection. Dans ce cas, un écouvillonnage est effectué sur le matériel ou la surface à
contrôler. L’ATP est ensuite mesuré sur la solution de rinçage de l’écouvillon.
Cette valeur représente aussi bien l’ATP microbien que l’ATP de cellules animales ou végétales
et est donc un indice de propreté de la surface contrôlée.
- l’air renferme des particules (poussières) sur lesquelles les microbes (levures et moisissures
le plus souvent à l’état de spores et aussi des bactéries) sont adsorbés. Selon leur concentration
(nombre de microorganismes/unité de volume d’air), ils représentent un risque plus ou moins
élevé de contamination secondaire.
Différents phénomènes sont à l’origine de la contamination de l’air : la manipulation de

certaines matières (ex. les graines) qui émettent une grande quantité de poussière. Les
emballages sont souvent des sources importantes de contamination. Les personnes sont aussi
responsables de la dissémination de particules certaines étant chargées de microorganismes.
Il est donc intéressant de faire des contrôles microbiologiques sur l’air ambiant. La technique
la plus simple consiste à déposer des boites de Pétri contenant un milieu gélosé, ouvertes aux
endroits à contrôler. Cette technique, si elle est appliquée à des intervalles de temps réguliers,
de suivre une évolution et donc mettre en évidence une augmentation de la charge microbienne
de l’air. En outre, il existe des appareils utilisés pour le contrôle de l’air de façon plus
rationnelle.
Toutes les techniques de contrôle de la désinfection du matériel et de l’air ambiant ne conduisent

pas à des valeurs absolues. Il convient donc de standardiser les délais opératoires pour que les
résultats aient une signification relative et donnent une idée de l’évolution de la qualité
microbiologique des matériels et des locaux.
37
7.4. Contrôle des produits finis
Les contrôles microbiologiques des produits finis portent sur leur qualité hygiénique et leur
qualité marchande, et sont plus ou moins importants suivant la nature des produits et leur
destination.
En effet, dans certains cas, le contrôle est ramené à une recherche de quelques microorganismes
dangereux pour le produit mais dans d’autres cas, le produit devant être stérile (produits destinés
aux injections intraveineuses, par exemple) les contrôles sont beaucoup plus nombreux et
sévères. Par ailleurs, il existe pour certains produits des normes ou des critères de qualité
microbiologique : les contrôles porteront alors sur ces paramètres.
L’analyse microbiologique traditionnelle des produits finis est quand même indispensable
car elle permet avec une certaine inertie d’éviter, dans le cas où des produits dangereux ou non
conformes seraient fabriqués, leur commercialisation ou leur consommation. Ce type de
contrôle souvent pratiqué par des laboratoires officiels (Contrôle et Répression des Fraudes)
n’est pas préventif et ne permet pas de maîtriser la qualité microbiologique des produits
fabriqués. Utilisé seul, il se révèle sans grand intérêt et souvent même inutile si sa mise en
oeuvre est longue et sans suite.
En conclusion :
Les techniques microbiologiques classiques sont longues et demandent un délai de réponse trop
important pour être utilisées couramment pour un contrôle de la fabrication.
Les méthodes mises en oeuvre doivent être simples, donner une réponse suffisamment rapide
pour qu’une correction soit éventuellement possible dans la fabrication, et doivent être peu
coûteuses, de façon à pouvoir multiplier les contrôles et mieux surveiller la fabrication, sans
alourdir excessivement les coûts de production.
Les techniques microscopiques (observation directe, coloration de gram ou

immunofluorescence) présentent des caractéristiques de simplicité, rapidité et faible coût et sont
donc à mettre en oeuvre, si cela est possible, chaque fois qu’une réponse rapide est
indispensable. Toutefois la sensibilité des techniques microscopiques n’étant pas toujours
suffisante, il est recommandé de faire, en parallèle, un contrôle par des méthodes classiques de
culture, sur les produits finis.
Quand un grand nombre d’échantillons doit être analysé, la méthode peut être automatisée avec
un système d’analyse d’image ; appareil permettant la préparation d’échantillon (filtration sur
38
membrane et marquage à l’acridine) et le comptage automatique des bactéries marquées sur la
membrane. Il est plus particulièrement destiné au contrôle de la qualité des laits.
L’observation microscopique est, en particulier, utilisable dans toutes les biotechnologies

faisant intervenir une phase de fermentation : cette étape peut alors être contrôlée efficacement
par la recherche des contaminants sur des préparations microscopiques, à l’aide d’anticorps
spécifiques ou des sondes nucléiques couplés à des fluorochromes.
La cytométrie en flux permet d’obtenir un résultat très rapide puisque le comptage des
microorganismes est effectué en une minute après un marquage de 10 à 15 minutes. La
sensibilité de la méthode est de l’ordre de 102 à 103/ml pour des levures et de 104/ml à 5.104/ml
pour des bactéries, dépendant de la présence de particules autofluorescentes dans le milieu. Son
utilisation est simple.
Pour les contrôles en cours de fabrication, les techniques microbiologiques classiques peuvent,
quelquefois être efficacement remplacées par des contrôles physico-chimiques liés à la
présence de contaminants comme le pH.
Si les méthodes par culture doivent être employées, il faut les automatiser pour accélérer les
lectures.
Interprétation des résultats : Plan à deux et trois classes
Pour chaque catégorie de produit alimentaire et pour chaque catégorie de micro-organisme, le

journal officiel publie un critère (chiffre m) Mais un résultat d'analyse bactériologique doit
toujours être considéré comme relativement peu précis : en microbiologie, on tient compte pour
interpréter les résultats d'une tolérance analytique (t. a.).
– En milieu solide : la t.a. du résultat donne N compris entre 0.3N et 3N
Exemple : résultat trouvé est 5.103 coliformes/mL
Avec t.a. :
– En milieu liquide : la t.a. du résultat donne N compris entre 0.1N et 10N
Exemple : résultat trouvé est 5.103 coliformes/mL
39
Avec t.a. :
1. Le plan à deux classes
Deux réponses seulement sont possibles :
- « présence dans » NON SATISFAISANT
- « absence dans » SATISFAISANT ; le produit est déclaré impropre à la consommation.
(concerne Salmonella et Listeria où la norme est : absence dans .....g)
2. Le plan à trois classes
Dans le cas de normes chiffrées, l'interprétation des résultats tient souvent compte de la
tolérance analytique :
- m = critère fixé
- M = seuil Maximum ou limite d'acceptabilité
M = 10 m pour un dénombrement en milieu solide
M : 30 m pour un dénombrement en milieu liquide
Un résultat N est satisfaisant (acceptable sans réserve) si N < m
Un résultat N est non satisfaisant si N > M
Un résultat N est acceptable avec réserve s'il est compris entre m et M
PIan d'échantillonnage à 3 classes: se caractérise par un échantillonnage, c'est-à-dire l'analyse

de plusieurs échantillons provenant d'un lot. La tolérance analytique de 3m (milieu solide) et
10m (milieu liquide) est appliquée.
– n est le nombre d'unités échantillonnage (en général 5)
– c est le nombre d'unités échantillonnage donnant des résultats compris entre 3 m (10m) et M
(en général 2)
La qualité du lot est considérée comme satisfaisante
Lorsque les valeurs observées pour les 5 unités d'échantillon sont < 3m (10m)
La qualité du lot est considérée comme acceptable
40
Lorsque les valeurs observées pour au plus c unités d'échantillon sur n sont comprises entre 3
m et 10
m (= M) (10 m et 30 m). Les autres échantillons doivent être < 3 m (< 10 m).
La qualité du lot est considérée comme non satisfaisante
- Dans tous les cas où 1 d'échantillon présente une valeur supérieure à M.
- ou lorsque c/n > 2/5, c'est-à-dire que plus de c échantillons sur n donnent un résultat supérieur
à 3m (10m).
Le produit doit être considéré comme toxique ou corrompu

- Lorsque la contamination atteint une valeur limite généralement de 103 m. Pour S.aureus,
cette valeur ne doit jamais dépasser 5.104 par g.
Exercice
L'analyse de 5 échantillons de viande hachée d'un lot conduit aux résultats suivants :
- St. aureus (milieu solide) lot a) 120 - 310 - 240 -80 - 100
lot b) 150- 540 - 330 -80 - 200
lot c) 60 - 140 - 90 - 1200 - 280
Conclure
41
42
8. Matériel d’équipement du laboratoire d’analyse microbiologique
I- Introduction
Le matériel d’équipement d’un laboratoire de microbiologie alimentaire, diffère de peu de celui

d’un laboratoire de microbiologie médicale. En microbiologie alimentaire, la fréquence des
études quantitatives et qualitatives et leur variété font qu’il est nécessaire de disposer d’un
nombre élevé de milieux de culture et de matériels divers (tubes à essai, erlenmeyers, boîtes de
Pétri, pipettes, etc). Le matériel utilisé en microbiologie en général, et en microbiologie
alimentaire en particulier est composé de :
II- Système de désinfection et de stérilisation des espaces de travail
1- L’autoclave vertical ou horizontal
Elle est utilisée pour la stérilisation par la vapeur des milieux de culture microbienne, des
“déchets”, elle est indispensable. La « stérilisation » est généralement réalisée à 121 °C pendant
15 à 20 minutes.
2- Le four Pasteur
Il permet la stérilisation à sec du matériel en verre ou en métal et doit pouvoir atteindre une
température de 170 - 180°C.
3- Les systèmes de micro ou ultra filtration à membrane
Ils sont utilisés pour les milieux de culture liquides non autoclavables et pour l’analyse des
échantillons liquides (eau par exemple).
4- Les lampes UV
Elles sont germicides et munies d’une minuterie et installées dans la pièce principale de
manipulation ainsi que dans les hottes à flux laminaires. Leur effet sur un germe donné est
fonction de la puissance de la lampe, de la longueur d’onde du rayonnement UV, de la distance
et du temps d’irradiation. Elles sont efficaces sur les « zones éclairées ». Il est essentiel de se
protéger vis-à-vis d’une exposition directe, la muqueuse oculaire étant particulièrement
sensible.
5- Les récipients de récupération
43
Ce sont des bacs contenant par exemple de l’hypochlorite de sodium pour recueillir les matériels
souillés tels que lames états frais, les pipettes, les cônes à usage unique etc. La récupération des
milieux contaminés après lecture peut se faire dans des sacs en polypropylène qui ne seront
éliminés qu’après autoclavage.
6- Les zones de travail
Elles sont situées dans la zone de protection de becs Bunsen avec déclenchement par bouton “à
pied” et/ou dans des hottes à flux laminaires qui selon leur fonctionnement “protègent” avec
efficacité soit le produit, soit l’opérateur, soit les deux, ces hottes étant classées en trois
catégories en fonction de leur fonctionnement. Elles sont utilisées pour la distribution aseptique
des milieux et le remplissage de boîtes de Pétri. Un flux d’air stérilisé par filtration est dirigé
sur la zone de travail soit horizontalement, soit verticalement avec ou non un recyclage. Il ne
s’agit pas de zones de sécurité et les hottes de classe I ne peuvent pas être employées seules
pour les manipulations des microorganismes ; dans ce cas, le travail stérile est réalisé dans la
zone de protection d’un bec de gaz, ce dernier présentant néanmoins l’inconvénient de perturber
le flux d’air dans le système.
Les hottes de classe III protègent avec une très grande efficacité produit et manipulateur mais
restent d’une utilisation difficile. Il s’agit en fait de boîtes à gants étanches et stériles
III- Matériel de préparation et d’incubation des milieux de dilution et de culture
1- Le bain marie
Ils sont utilisés pour la régénération des milieux de culture (100°C) et leur maintien en surfusion
(45 à 47°C). Une diminution de l’émission de vapeur d’eau est obtenue par recouvrement de la
surface par des petits morceaux de polystyrène.
2- Balance électronique
Elle est utilisée dans la préparation des milieux de culture et des milieux de dilution qui
nécessitent des masses précises dans des volumes précis.
3- Agitateur magnétique chauffant
Dispositif permettant une homogénéisation et une distribution des milieux de culture
4- Verrerie
44
Elle est composé de matériel de mesure (éprouvette graduée, pipette graduée, fiole jaugée,
etc…), de prélèvement (bécher, pipette Pasteur), d’incubation et d’observation (boîte de Pétri,
lame et lamelle d’observation microscopique).
5- Matériel de préparation d’échantillon
Les échantillons destinés à l’analyse microbiologique sont constitués le plus souvent de produits
finis ou dans des flacons ou récipients stériles s’il s’agit de produits en vrac ou de
“prélèvements”. Il faut parfois disposer de matériels permettant le prélèvement d’aliments dans
des emballages solides (poinçons, ouvre-boîtes) ou encore de matériels indispensables au
prélèvement d’aliments solides (cautérisateurs, pipettes harpons, etc…). Le premier traitement
auquel sont soumis la plupart des produits consiste, après prélèvement d’une partie aliquote, en
une homogénéisation. Celle-ci est réalisée au moyen de mortiers ou par des broyeurs à couteaux
(Virtis par exemple) ou des appareils de Potter ou encore par un Stomacher.
Cette opération doit permettre l’homogénéisation et la mise en suspension des microorganismes

présents dans l’échantillon tout en évitant les cas de contamination extérieure ou des cas
d’inactivation des germes présents dans l’échantillon (cas d’échauffement par exemple).
On distingue parmi le matériel utilisé :
- Une centrifugeuse atteignant 3 à 4000 g permet, en peu de temps, de décanter les

microorganismes présents dans les liquides. Des tubes bouchés sont indispensables pour éviter
la contamination aérienne.
- Un vortex permet d’homogénéiser les suspensions bactériennes présentes dans les tubes, en
particulier au moment des dilutions ou des prélèvements. Avec cet appareillage, il faut
engendrer un noeud de vibration entre pouce et index à une hauteur du tube qui est en dessous
du niveau du coton cardé.
6- Matériel d’ensemencement et d’incubation
Il constitué d’un certain nombre d’élément tels que les boîtes de pétri qui peuvent être en verre
ou en pastique (polycarbonate de 90 mm de diamètre ou plus), les tubes à essai et à hémolyse,
les pipettes graduées (1 à 10 ml) ou les pipettes automatiques (0,1 ou 1ml) à cône en
polypropylène stérilisables, les pipettes pasteur, les cannes de verre, et les anses de platine etc.
Un dispositif d’ensemencement en spiral et un compteur de colonies laser ou par analyse

d’image ne s’imposent que si le nombre d’analyses à réaliser quotidiennement est élevé. Pour
45
faciliter la numération des colonies dans les boîtes de Pétri il est possible d’utiliser un système
du type stylo-compteur. Un système complet de filtration doit faire partie intégrante de
l’équipement de base du laboratoire.
IV- Le matériel optique (microscopie)
Il est composé essentiellement du microscope et de ses accessoires (lame, lamelle, réactifs,

colorant etc…). Il sert à l’observation et l’étude des cellules microbiennes. Il comporte des
spécificités en fonction de l’étude menée. On distingue :
- Les microscopes pour observation de cellules fluorescentes qui sont équipés de source de
fluorescence (épifluorescence)
- Les microscopes équipés de platines motorisés et d’une caméra vidéo permettant la saisie et
le traitement des images (au moyen de logiciels de plus en plus perfectionnés et accessibles)
46

Cours Analyse Microbio s5 21-22

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UNIVERSITE THOMAS SANKARA BURKINA FASO

Unité de Formation et de Recherche Unité – Progrès – Justice

Licence en Sciences et Technologies

Mention Analyse Physico-chimique

COURS D’ANALYSE MICROBIOLOGIQUE

Enseignant : Dr Oumarou ZONGO

Assistant, Université Thomas SANKARA

Elément Constitutif : Méthodes VHP : 36

Prérequis : cours analyse bactériologique S3

 PRINCIPALES METHODES DE RECHERCHE ET DE NUMERATION

Modalités d’évaluation : Un devoir sur table et un examen de TP

- Contrôle microbiologique des aliments – Manuel technique. 119 pages Jean-

 Les principes de base de l’analyse microbiologique

 Matériel d’équipement du laboratoire d’analyse microbiologique

 Principales méthodes de recherche et de numération quantification des populations

Dénombrement après culture (sur milieu solide, NPP)

Dénombrement direct des cellules (microscopie, cytométrie, …)

 Différentes étapes de l’analyse microbiologique

Préparations des milieux et de l’échantillon

Lecture des résultats

 Interprétations des résultats d’analyses microbiologiques

1. Objectifs du contrôle microbiologique

1.1. Qualité hygiénique

Les contrôles microbiologiques permettent donc d’éviter la présence de microorganismes dans

1.2. Qualité marchande

L’altération de la qualité marchande se produit généralement lentement au cours du stockage.

La bonne qualité microbiologique (hygiénique et marchande) est fonction de très nombreux

La Technologie est l’aptitude à la transformation et à la distribution. La qualité d’un produit

- L’évaluation (par exemple d’un niveau de qualité existant) ;

- La définition d’un objectif (amélioration de la qualité) ;

- La préparation (mise en place de moyens nécessaires pour atteindre l’objectif retenu) ;

Le contrôle microbiologique a deux fonctions distinctes :

- Evaluer la qualité microbiologique d’un produit ou d’une matière première ;

- Maîtriser un point critique sur une chaine de production.

2.1. Les spécifications microbiologiques

Il existe actuellement de nombreux organismes nationaux ou internationaux qui se préoccupent

2.2. Niveaux de contrôle

Les contrôles doivent être répartis en trois groupes :

- Les contrôles en cours de fabrication comprennent les contrôles microbiologiques sur le

2.3. Fréquence des contrôles

2.4. Paramètres à contrôler

Les microorganismes à rechercher varient suivant la technologie et les caractéristiques physico-

- Les microorganismes responsables d’une altération de la qualité hygiénique, comme les

- Les microorganismes responsables d’une altération de la qualité marchande et d’une

3.1. Prélèvement des échantillons

L’objectif de l’échantillonnage influencera le type de plan d’échantillonnage, la nature des

- complément à une visite d’inspection ;

- programme de surveillance ou étude de profil ;

- recherche de pathogènes dans l’environnement ;

- vérification de l’efficacité des procédés de nettoyage ;

- suivi d’un résultat non conforme.

- Unité d’échantillonnage, portion ou contenant individuel de produit prélevé au hasard dans

- La vérification de la qualité de la glace comparée à la vérification de la potabilité de l’eau

⃝ La Commission Internationale des Normes Microbiologiques relatives aux denrées

- catégorie 2 (acceptables mais avec une limite)

m sépare la 1ère et la 2ème catégories et M la 2ème et la 3ème (figure 1).

Figure 1. Distribution des échantillons d’après l’ICMSF

3.1.1.1. Plan d’échantillonnage

Le nombre d’échantillons à prélever est déterminé en fonction de la situation. Le plan

- Plan d’échantillonnage à 2 classes

Ce plan donne des résultats permettant de déterminer 2 classes de contaminations. Ce

- utiliser la notion de présence ou absence

- déterminer la tolérance ou non des numérations supérieures à la valeur critique m

Le symbole c représente le nombre d’échantillons tolérés au-delà de la valeur seuil,