Coursde Techniquesd Analyse Microbiologique

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COURS DE TECHNIQUES D'ANALYSE MICROBIOLOGIQUE
Book · March 2021
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Asmaa Benaissa
University of Science and Technology Houari Boumediene
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REPUBLIQUE DEMOCRATIQUE ALGERIENNE ET POPULAIRE
Ministère de l’enseignement supérieur et de la recherche scientifique
Université Amine Elokkal El Hadj Moussa Eg Akhamouk Tamanrasset
Faculté des Sciences et de la Technologie
Département Biologie
Polycopié du cours
TECHNIQUES D’ANALYSE MICROBIOLOGIQUE

Avec exercices corrigés
3ème Année Licence Microbiologie
Dr Asmaa BENAISSA
(Enseignante-chercheuse à l’Université de Tamanrasset)
AVANT-PROPOS
Cet ouvrage, est adapté aux programmes des licences en microbiologie, contrôle de
qualité et biotechnologie, s’adresse tout d’abord aux étudiants de ces spécialités.
En revanche, tous les éléments de base de la pratique microbiologique décrite dans ce
manuscrit serviront tout aussi aux techniciens des laboratoires des secteurs industriel,
agroalimentaire et clinique. Le cours sert de base à la résolution des exercices et des problèmes
répertoriés, avec leurs corrigés à la fin du manuscrit. Les questions correspondent aux
compétences attendues par le programme.
Cet ouvrage est le fruit des connaissances pratiques de la microbiologie et d’une
adaptation des programmes des spécialités ayant un enseignement de microbiologie. C’est donc
un support pédagogique effectif utilisant un style relativement simple et clair et organisé les
chapitres.
Le manuscrit est scindé en sept principaux chapitres classés selon un ordre chronologique
d’une analyse microbiologique (étape par étape). En effet, il débute par présenter les méthodes
de stérilisation, connaissance de base pour une manipulation en vigueur. En deuxième lieu, les
techniques de prélèvement sont expliquées car ils constituent étape primordiale pour
commencer une étude microbiologique. Les autres chapitres, présentent les différentes
procédures d’un isolement, ensemencement, observation, caractérisation morphologique et
biochimique, et numération des microorganismes. L'objectif de cet ouvrage est de présenter de
façon synthétique, mais précise les données classiques d’une analyse microbiologique. Par
ailleurs, des illustrations personnelles sont incluses dans la mesure du possible, considérées
comme partie attrayante pour les étudiants.
- Ce document ne dispense pas les étudiants de la responsabilité d'assister aux cours -
Auteur
Pour toutes suggestions, e-mail : benaissa.asmaa@yahoo.fr
Maître de conférences B au département des Sciences Biologiques, Université de Tamanrasset (CUT) et
rattachée au laboratoire de biologie et physiologie des organismes à l’Université des Sciences et Technologie
Houari Boumediene (FSB/USTHB), Alger.
Je remercie de tout cœur le Professeur Ahmed ABDERRAHMANI (USTHB) et le Docteur Abdelkader
BEKHTI (Université d’Adrar) pour l’évaluation de ce manuscrit.

TABLE DES MATIERES
Abréviations et acronymes
Liste des tableaux et figures
Chapitre I : Techniques de stérilisation 1
1. Stérilisation par les méthodes physiques 1

1.1. Stérilisation par la chaleur 1
1.1.1. Chaleur sèche 1
1.1.1.1. Flambage 1
1.1.1.2. Four pasteur 2
1.1.2. Chaleur humide 3
1.1.2.1. Autoclave 3
1.1.2.2. Bain marie 4
1.1.2.3. Pasteurisation 4
1.1.2.4. Thyndallisation 4
1.2. Stérilisation par filtration 5
1.3. Stérilisation par radiation 5
2. Stérilisation par les méthodes chimiques 6
2.1.1. Antiséptiques liquides 6
2.1.2. Antiséptiques gazeux 6
Chapitre II : Méthodes de Prélèvement 7
1. Echantillonnage 7
2. But 7
3. Précautions particulières 7
4. Plan d’échantillonnage 8
4.1. Plan à deux classes 8
4.2. Plan à trois classes 9
5. Mode de conservation 9
Chapitre III : Les milieux de culture 10
1. Définition 10
2. Préparation du milieu de culture 10
2.1. Considérations générales 10
2.2. Cas particuliers 11
3. Types de milieux 11
3.1. Classification selon la composition 11
3.1.1.Milieux synthétiques 11
3.1.2.Milieux complexes 11
3.1.3.Milieux enrichis 12
3.2. Classification selon l’utilisation 13
3.2.1.Milieux sélectifs 13
3.2.2.Milieux différentiels 13
3.2.3.Milieux d’enrichissement 13
4. Caractéristiques de quelques milieux de culture 14
Chapitre IV : Méthodes d’observation des microorganismes 15
1. Observation macroscopique des colonies 15

1.1. Conditions d’examen 15
1.2. Aspect des colonies 15
1.3. Principaux types de colonies 16
2. Observation microscopique 17
2.1. Examen à l’état frais 17
2.1.1.Les formes 17
2.1.2.Le mode des groupements 17
2.1.3.La mobilité 17
2.2. Examen après coloration 18
2.2.1. Coloration simple 19
2.2.2. Coloration spécifique 20
2.2.3. Coloration double 21
Chapitre V : Techniques de la culture bactérienne 22
1. Notions sur la culture 22

2. Réalisation d’une dilution décimale 24
2.1. Matériel 24
2.2. Mode opératoire de la réalisation des dilutions en série ou successives 24
(10-1, 10-2, 10-3,….) 25
3. Technique d’ensemencement 25
3.1. Principe et but 26
3.2. Technique 26
4. Technique d’isolement 26
5. Conservation des souches 27
Chapitre V : Dénombrement des microorganismes 28
1.But 28
2.Numération en surface 28
2.1. Technique de « SURFACE COUNT » 28
2.2. Technique des gouttes « DROP COUNT » 28
2.3. Technique de la membrane 29
2.4. Technique de « DIP SLIDES » 29
2.5. Cellules de comptage 29
3.Numération en milieu gélosé 30
3.1. Technique standard « PLATE COUNT » 30
3.2. Technique de la double couche 30
3.3. Technique du « ROLL TUBE COUNT » 30
3.4. Technique des gouttelettes d’agar 30
4.Exemple : Dénombrement des coliformes totaux et fécaux 31
4.1.Principe 31
4.2.Mode opératoire 31
4.3.Expression des résultats 31
4.4.Méthode NPP 32
4.4.1. Principe 32
4.4.2. Technique 32
Chapitre VI : Mise en évidence du type de métabolisme bactérien 34
1. Métabolisme énergétique 34
1.1. Type respiratoire 34
1.2. Test de catalase 35
1.3. Test d’oxydase 35
1.4. Recherche de la nitrate-réductase (Test de GRIESS-ILOSVAY) 36
1.5. Épreuve de HUGH et LEIFSON 37
1.6. Test de mannitol-mobilité-nitrate 37
2. Métabolisme glucidique 38
2.1. Auxanogramme 38
2.2. Etude de la voie fermentaire des Acides 39
2.3. Test ONPG : recherche de la β galactosidase 39
3. Métabolisme protidique 40
3.1. Métabolisme de l’urée et du tryptophane 40
3.2. Recherche des décarboxylases LDC et ODC et de l’arginine dihydrolase 41
ADH
4. Activité hydrolytique 42
4.1. Hydrolyse des protéines 42
4.2. Hydrolyse des polysaccharides 43
4.3. Hydrolyse des lipides 44
5.Galeries API 45
5.1. Définition 45
5.2. Choix de galerie 46
5.3. Technique 46
5.4. Exemples 47
5.4.1.API 20 E 47
5.4.2.API 10 Staph 48
5.4.3.API 20 NE 49
5.4.4.API 20 Strep 50
Chapitre VII : Antibiogramme 51
1. Définition 51
2. Principe 51
3. Mode opératoire 52
4. Interprétation 53
5. Concentration minimale inhibitrice 53
5.5. Définition 53
5.6. But 53
5.7. Technique 54
Références bibliographiques 55
Exercices 57
Résolution des exercices 62

ABREVIATIONS ET ACRONYMES
ADH : Arginine di-hydrolase

ANC : Acide Nalidixique Colistine
BCPL : Bouillon lactosé au pourpre de bromocrésol
CMI : Concentration Minimale Inhibitrice
H2O2 : Peroxyde d’hydrogène
HCO3 : Hydrogénocarbonate
KNO3 : Nitrate de Potassium
KOH : Hydroxyde de Potassium
LDC : Lysine décarboxylase
NaCl : Chlorure de sodium
NH2 : Ion amidure (amine)
NR : Nitrate Réductase
O2 : Dioxygène
ODC : Ornithine décarboxylase
OH : Radical hydroxyle
OGA : Oxytétracycline Gélose Agar
ONPG : l’Ortho Nitro Phényl Galactopyranoside
TDA : Tryptophane désaminase
RM : Rouge de Méthyle
VP : Voges Proskauer
UNITES :
g.L-1 : Gramme par litre

M : Molaire
rpm : Rounds per minute (tours par minute)
UFC/gr : Unité Formant Colonie par gramme
LISTE DES TABLEAUX ET FIGURES
LES FIGURES
Figure 1 : Flambage d’une pipette Pasteur au niveau de la flamme bleue du bec 2

Bunsen
Figure 2 : Photographie représentant un four Pasteur 2
Figure 3 : Photographie d’un autoclave de paillasse 3
Figure 4 : Photographies de deux modèles de bain-marie de paillasse 4
Figure 5 : Illustration d’une stérilisation par filtration 5
Figure 6 : Hotte - Poste de sécurité microbiologique (PSM - classe II) muni de 6

lampe UV germicide
Figure 7 : Préparation d’un milieu de culture dans un flacon de 1L sur un agitateur 11

magnétique à plaque chauffante
Figure 8 : Morphologie des colonies bactériennes 17
Figure 9 : Etapes de préparation d’une lame d’examen à l’état frais 17
Figure 10 : Formes et modes de groupements des cellules bactériennes 18
Figure 11 : Préparation d’un frottis bactérien sur une lame en verre 19
Figure 12 : Observation microscopique de bactéries de forme bacille groupées en 19

courte chainette après coloration simple au bleu de méthylène
grossissement × 100.
Figure 13 : Observation microscopique de la coloration de Gram de bactéries sous 20

microscope optique au grossissement X100 (A- Cocci Gram positif, B-
Bacille Gram négatif
Figure 14 : Préparation des dilutions décimales consécutives 25
Figure 15 : Boite de Pétri ensemencée en strie sur la surface d’un milieu de culture 26
solide
Figure 16 : Etapes de réalisation d’un ensemencement en strie sur un milieu solide à 27

l’aide d’une pipette Pasteur
Figure 17 : Schéma d’une cellule de comptage des bactéries « Thoma » 29
Figure 18 : Résultat positif de la présence des coliformes fécaux (production de gaz 31

et apparition d’un anneau rouge à la surface)
Figure 19 : Dénombrement des coliformes totaux et fécaux sur milieu liquide 33
Figure 20 : Représentation des différents types respiratoires bactériens 35
Figure 21 : Photographie d’un résultat positif de la présence d’une catalase 35
Figure 22 : Photographie des différentes réactions de la recherche du cytochrome- 36

oxydase sur disque
Figure 23 : Photographie de la réaction de la recherche des nitrates réductases 36

(Réaction positive signifie la présence de l’enzyme nitrate réductase,
Réaction négative signifie leur absence)
Figure 24 : Résultats des différents métabolismes bactériens 37
Figure 25 : Interprétation du test de mannitol-mobilité-nitrate 38
Figure 26 : Différentes interprétations de l’auxanogramme 38
Figure 27 : Réaction de l’hydrolyse d’un analogue de la β galactosidase (ONPG) 41
Figure 28 : Photographie de quelques colonies microbiennes présentant une activité 44

amylolytique (Résultat positif : halo transparent, résultat négatif : halo
bleu).
Figure 29 : Guide de choix de la galerie Api (A- Guide pour les bacilles Gram 46
négatif ; B- Guide pour les bacilles Gram positif ; C- Guide pour les cocci
Gram positif et négatif).
Figure 30 : Ensemencement de la culture bactérienne à l’aide d’un écouvillon stérile 52

(écouvillonnage) sur la surface de la gélose Muller-Hinton.
Figure 31 : Etapes de réalisation d’un antibiogramme 52
Figure 32 : Photographie de l’antibiogramme de la souche de référence Echerichia 53

coli ATCC 25922 aux antibiotiques
Figure 33 : Bandelettes de détermination de CMI pour Ceftolozane/Tazobactam 54
LES TABLEAUX
Tableau 1 : Etapes de réalisation de la coloration de Gram 21
Tableau 2 : Types nutritionnels des microorganismes 23
Tableau 3 : Table partielle de Mac Grady 32

CHAPITRE I : TECHNIQUES DE STERILISATION
Chapitre I : Techniques de stérilisation
CHAPITRE I : TECHNIQUES DE STERILISATION
La stérilisation est une technique destinée à détruire tous les microorganismes d’un matériau
quelconque (verres, plastique, aliment, …etc). Elle a été décrite la première fois par un
inventeur français « Nicolas Appert » (1749-1841), à la fin du dix-huitième siècle et a été
nommée appertisation. En effet, elle a consisté à porter une préparation alimentaire à haute
température, c'est-à-dire de 100 à 180° C, dans un but de conservation des denrées périssables.
Avec l’avènement du vingtième siècle, plusieurs autres techniques ont été mises au point selon
différents procédés pour une plus large utilisation. Cependant, il est noté que les objets
contaminés doivent d’abord être lavés, rincés puis séchés avant de procéder à leur stérilisation,
afin de garantir un meilleur résultat.
1. Stérilisation par les méthodes physiques

1.1.Stérilisation par la chaleur
1.1.1. Chaleur sèche
1.1.1.1.Flambage
Le flambage consiste à effectuer des passages lents des objets à stériliser dans la flamme bleue
du bec Bunsen afin de détruire toute matière organique présente sur sa surface (Fig. 1). Le bec
Bunsen est un appareil à gaz, inventé en 1855 par Peter Desdega, pourtant il porte le nom du
physico-chimiste allemand « Robert Bunsen » (1811-1899). C’est une technique destinée
exclusivement pour les objets en verre (extrémité des pipettes, baguettes de verre, cols des tubes
à essai...) et pour certains objets en métal (anse, pince). Il est à noter que la flamme bleue, la
plus chaude, crée une zone de stérilité d'un diamètre d'environ 20 cm, par ascendance de l'air
de cette zone. Toutes les manipulations d'ouverture de tubes et boîtes de culture,
d'ensemencement, devront être réalisées dans cette zone. Il est cependant préconisé de ne pas
déplacer le bec après l’avoir allumé et au moment de la manipulation.
Techniques d’Analyse Microbiologique/ Dr. Asmaa BENAISSA (2020) 1

Figure 1 : Flambage d’une pipette Pasteur au niveau de la flamme bleue du bec Bunsen
1.1.1.2.Four Pasteur
C'est une étuve à air chaud et sec qui circule à l’intérieur de l’enceinte pour répartir la chaleur
de manière homogène (Fig. 2). Il est utilisé pour la stérilisation de la verrerie vide (tubes à essai,
boîtes de Pétri, tubes à culture et bouchons, pipettes graduées et récipients divers), porcelaine
et instruments métalliques. Il est à noter que les objets à stériliser doivent être propres et
parfaitement secs, éventuellement bouchés avec du coton cadré et emballées dans du papier
solide ou du papier aluminium. Les objets sont alors disposés à l'intérieur du four et subissent
un chauffage de 4 heures à 140° C ou 2 heures 30 à 160° C ou 30 min à 180° C.
Réglage des
paramètres
Bouton d’allumage
Température/Temps
Ventilateur d’air
chaud
Figure 2 : Photographie représentant un four Pasteur

1.1.2. Chaleur humide
1.1.2.1.Autoclave
C’est un appareil qui expose le matériel à stériliser à l’action de la vapeur d’eau exempte d'air
et sous pression avec des valeurs de températures qui varient entre 115 à 140° C et un temps
déterminé (Fig. 3). De manière générale, les bactéries et les spores sont détruites en 15 min à
120° C sous une pression de 2 bars. De plus, l’autoclavage s’effectue à des températures
inférieures que celles adoptées pour la stérilisation par la chaleur sèche, cela est expliqué par
l’effet de solubilisation qui accompagne l’action thermique de l’autoclave.
Le matériel à stériliser est préparé au préalable, par exemple, la verrerie sera bouchée au coton
et emballée avec du papier aluminium ou papier d'emballage très résistant. D’autre part, les
récipients contenant un milieu de culture seront remplis aux ¾ (neufs ou souillés) tandis que les
instruments métalliques seront déposés sur un plateau de boites spéciales contenant une solution
de carbonate de soude à 2 % contre la rouille mais habituellement, ils sont plutôt sujets à une
stérilisation par la chaleur sèche. L’autoclave est aussi destiné à la stérilisation des milieux
contenants des produits biologiques, par contre, tous les milieux ne peuvent pas être stérilisés
par cette méthode, comme ceux contenant des produits délicats tels que la gélatine, caséine,
albumine…etc, qui peuvent se dénaturer. Il est à noter que le matériel à stériliser est déposé
dans les paniers métalliques de l'autoclave dont le niveau d'eau est vérifié avant chaque
opération de stérilisation (ne doit pas dépasser le support du panier).
Thermomètre (°C)
Robinet à soupape Baromètre (pascal)
Réglage de la
Température (°C)
Bouton d’allumage
(on/off)
Figure 3 : Photographie d’un exemple d’autoclave classique de paillasse

1.1.2.2. Bain marie

En microbiologie, le bain-marie peut être utilisé comme outil de stérilisation (Fig. 4). En effet,
un chauffage de 10 minutes à 80° C suffit à détruire toutes les formes végétatives des bactéries.
Cependant, les spores ne sont pas détruites, dans ces conditions, l'efficacité de l'ébullition peut
être améliorée en ajoutant à l'eau des solutions salines concentrées (augmentation du point
d'ébullition) ou en prolongeant le chauffage. Ce procédé peut être utilisé pour la stérilisation
des produits liquides délicats : milieux albumineux, lait, gélatine, solutions concentrées de
glucides, …etc
Figure 4 : Photographies de deux modèles de bain marie de paillasse
1.1.2.3.Pasteurisation
Cette technique comme son nom l’indique, a été inventée en 1865 par le français « Louis
Pasteur » (1822-1895). Il est utilisé pour la conservation naturelle et alimentaire dans un temps
limité, détruisant la forme végétative, mais pas les spores. Elle consiste à porter le produit à 65
- 75° C pendant 30 minutes (pasteurisation lente) ou à 85 - 90° C pendant 20 à 30 secondes
(pasteurisation haute) puis le refroidir brusquement à 10° C.
Un procédé de principe similaire est aussi utilisé notamment pour la conservation des denrées
alimentaires, c’est l’Ultra Haute Température (UHT). Il s'agit de porter un produit à une
température très élevée (entre 140 et 150° C) pendant un temps très court (2 à 5 secondes). Ceci
permet de préserver sa qualité tout en détruisant tous les microorganismes, offrant ainsi une
longue durée de conservation (environ 3 mois).
1.1.2.4.Tyndallisation
Cette technique a été inventée en 1871 par le physicien irlandais « John Tyndall » (1820-1893).
Elle consiste en chauffages discontinus à une température relativement basse (60° C ou 70° C),

suivis de refroidissements. En effet, les bactéries perdent leur aptitude à sporuler qu'au cours
de ces périodes de chauffage discontinu. Certains auteurs parlent d’une série de 3
pasteurisations lentes, séparées par un intervalle de 24 heures à température ambiante. Cela
provoquera la multiplication de bactéries par les spores, puis elles s’élimineront lorsque la
température augmentera. Il est à noter que cette méthode peut être utilisée pour la stabilisation
de quelques milieux contenant des substances thermosensibles non filtrables d’une certaine
viscosité telle que le sérum, le vaccin et l’œuf.
1.2. Stérilisation par filtration
Le passage des produits à travers des filtres dont le diamètre des pores est de 0.45 µm (Fig. 5),
retiennent à peu près tous les microorganismes à l’exception des virus (0,22 µm). Elle agit sous
pression du fluide à filtrer qui lui permet de passer à travers le filtre. Les filtres peuvent être de
différentes natures : plastique, papier (cellulose), porcelaine (Chamberland), verre et
métallique. Cette méthode est utilisée pour les milieux altérables par la chaleur (antimicrobien,
vitamines, sucres, …etc), mais n'est possible que lorsque la viscosité de ces milieux est faible.
Solution bio-chargée
Membrane
0.45 µm
Solution stérile
Figure 5 : Illustration d’une stérilisation par filtration
1.3. Stérilisation par radiation (radiostérilisation)
Les rayons X et les rayonnements Béta et Gamma sont très efficientes par leur intensité et leur
pouvoir de pénétration. Ils sont utilisés pour la conservation de certains produits alimentaires
ou pour la stérilisation industrielle des boîtes de Pétri en matière plastique : stérilisation par
ionisation. De ce fait, plusieurs avantages peuvent être portés à cette dernière comme le respect
de l’environnement (aucun résidu est laissé), rapidité d’action, une grande quantité de produits
sont stérilisés à la fois et sous leur emballage. Malgré leur faible rendement, les radiations ultra-
violettes sont le plus souvent utilisées pour la stérilisation des surfaces et de l'air ambiant en

atmosphère stérile, dans des locaux ou des hottes de protection, servant aux manipulations de
germes dangereux (Fig. 6). Par ailleurs, la région la plus active de leur spectre d’émission est
située entre 260 et 270 nm, ex : lampe germicide destinées à la stérilisation des salles
chirurgicales.
Figure 6 : Hotte - Poste de sécurité microbiologique (PSM - classe II) muni de lampe UV germicide.
2. Stérilisation par les méthodes chimiques
Des substances chimiques sont utilisées comme agent antimicrobien, avec un effet bactéricide,
en générale, on parle des désinfectants et des antiseptiques. Ces derniers sont des produits ayant
des propriétés antimicrobiennes et sont appliqués directement sur les tissus vivants. Cependant,
l’action antimicrobienne dépend du microorganisme lui-même, de l’agent antimicrobien et des
conditions de désinfection. Les désinfectants sont des produits ou des procédés utilisés pour la
décontamination des supports inertes (sols, matériels, des salles et plans de travail et pour la
désinfection du matériel plastique ou souillé utilisé en microbiologie et pour la verrerie qui ne
passe pas en autoclave) dans des conditions bien définies. Ils peuvent être classés selon leur
consistance en deux catégories :
2.1. Les désinfectants liquides : eau oxygénée, phénols, aldéhyde, dérivés mercuriels,
hypochlorite de sodium (eau de Javel), permanganate de potassium.
2.2. Les désinfectants gazeux : gaz sulfureux, oxyde d'éthylène et les vapeurs d'une solution
chauffée de formol sont utilisées pour désinfecter les pièces et les étuves et pour la
désinfection de certains matériels en plastique à usage unique. En conclusion, on notera qu’il
existe différentes techniques de stérilisation en fonction de la nature, l’action et le volume du
matériel à traiter.

CHAPITRE II : METHODES DE PRELEVEMENT
Chapitre II : Méthodes de prélèvement
CHAPITRE II : METHODES DE PRELEVEMENT
1. Echantillonnage
Un échantillonnage est l’action de prélever une quantité de substance ou de matériau pour les
analyser au laboratoire. L’échantillon peut être de différentes nature en allant d’un aliment vers
l’eau et en passant par l’environnement (sol, bois, plante, …etc). Cette étape très importante et
élémentaire, représente le premier portail d’une succession d’étape pour la réalisation d’une
analyse microbiologique fiable. Un échantillonnage approprié est essentiel pour fournir des
échantillons représentatifs au laboratoire d'analyse. Cependant, les modalités de
l'échantillonnage dépendront de l'objectif de celui-ci, mais aussi de la nature des échantillons.
2. But
Un échantillonnage destiné à une analyse microbiologique est réalisé dans plusieurs cas de
figures :
- Vérification de la conformité d’un produit ou un procédé à des exigences de qualité.

- Evaluation ponctuelle, surveillance et validation de la bonne application des bonnes
pratiques d’hygiène pour un procédé de fabrication donné.
- Recherche analytique visant à explorer ou discriminer un ou des microorganismes
donnés dans tous les domaines d’étude scientifique.
3. Précautions particulières
Afin de minimiser les risques associés à la contamination de l’échantillon par le préleveur, des
précautions élémentaires doivent être prises pour obtenir un échantillon représentatif :
- Les échantillons destinés aux analyses microbiologiques doivent toujours être prélevés dans
les contenants stériles à large ouverture fournis par les laboratoires spécialisés
- Le prélèvement des échantillons destinés à l’analyse microbiologique doit s’effectuer en
premier avant celui de ceux destinés à l’analyse chimique, le cas échéant ;
- Ne pas remplir complètement les récipients et laisser un espace de 2 cm entre la surface de
la substance prélevée et le bouchon, afin de faciliter l’homogénéisation de l’échantillon au
moment de son analyse en laboratoire ;

- Respecter les conditions d'asepsie nécessaires lors de la prise de l’échantillon en évitant le

contact manuel direct avec l’échantillon ou tout autre instrument. Il est recommandé de
porter des gants pour ne pas affecter les résultats.
- Utiliser un matériel d'échantillonnage stérilisé au préalable et préservé dans un endroit
propre et bien aéré ;
- Fermer hermétiquement tous les contenants après le prélèvement ;
- Prélever un volume et un nombre d’échantillons suffisant pour réaliser les analyses au
laboratoire selon les méthodes définies ;
- Etiqueter adéquatement tous les échantillons prélevés à l'aide d’un identifiant approprié
avant de les expédier au laboratoire ;
-Envelopper soigneusement le récipient de l'échantillon dans du papier solide ou du papier
d'aluminium pour éviter de renverser ;
- S’assurer que le temps et les conditions du transport soient respectés fiables pour maintenir
les échantillons en bon état dans le délai d'analyse spécifié.
4. Plan d’échantillonnage
Un plan d’échantillonnage est souvent établi dans le cadre d’un contrôle microbiologique des
aliments, d’une chaine de fabrication industrielle, des eaux de consommation et des eaux de
baignade. Il correspond à mettre en œuvre un programme d’échantillonnage dépendant des
paramètres temps, volume et nombre d’échantillons à prélever selon des critères prédéfinis par
le laboratoire agréé. Par conséquent, elle définit l'acceptabilité d'un produit, d'un lot d'aliment
ou d'un procédé en fonction de la présence, de l'absence ou du nombre de micro-organismes,
toxines / métabolites par unité de masse, de volume, de surface ou de lot. On distingue deux
plans d’échantillonnage utilisés en microbiologie alimentaire, plans à deux ou trois classes qui
ont été définis initialement par l’ICMSF (International Commission on Microbiological
Specifications for Foods - Commission Internationale pour la définition des caractéristiques
microbiologiques des aliments)
4.1.Un plan à deux classes : il est représenté par un nombre (n) d’unité constituant l’échantillon
prélevé aléatoirement et le nombre maximal (N) de résultats représentatifs, soit une valeur
supérieure à la limite (m) de concentration acceptable. L’interprétation des résultats
indiquera donc une qualité microbiologique satisfaisante ou non.

4.2.Un plan à trois classes : il est représenté par des valeurs comprises entre les limites des
concentrations acceptables (m) et les concentrations inacceptables (M). L’interprétation des
résultats indiquera donc une qualité microbiologique satisfaisante ou acceptable ou
insatisfaisante.
5. Mode de conservation
Tous les échantillons doivent être conservés à environ 4° C entre le moment du prélèvement et
la réception au laboratoire, grâce à l’utilisation des glacières dotées d’agents réfrigérants ou de
la glace. Ceci dit, il faut bien s’assurer que les glaciaires sont bien propres. Les prélèvements
arrivés au laboratoire sont directement analysés ou conservés au réfrigérateur. De plus, il ne
faut pas dépasser 8 heures entre le prélèvement et le début des analyses au laboratoire.

CHAPITRE III : LES MILIEUX DE CULTURE
Chapitre III : Les milieux de culture
CHAPITRE III : LES MILIEUX DE CULTURE
1. Définition
Les milieux de culture sont des préparations nutritives qui servent de support pour la croissance
des micro-organismes (bactéries, levures et moisissures) en leur apportant les éléments
essentiels à leur bon développement. Ils sont principalement utilisés dans les industries
agroalimentaires, cosmétiques, pharmaceutiques mais aussi dans l’environnement, la recherche
scientifique et l’enseignement.
2. Préparation des milieux

2.1.Considérations générales
La plupart des milieux se présentent sous forme déshydratée, ce qui assure une composition
constante, un stockage facile et une préparation simplifiée. Pendant la reconstitution du milieu,
mélanger la poudre avec la quantité d'eau recommandée, homogénéiser, puis la dissoudre
complètement en chauffant (le temps d'ébullition ne doit pas dépasser 1-2 minutes) à l’aide d’un
agitateur magnétique à plaque chauffante (Fig. 7). L’utilisation d’un erlenmeyer (marque
thermorésistante, ex. pyrex) est recommandé pour assurer une bonne homogénéisation et
diminue l’évaporation. Après refroidissement partiel, le milieu est réparti dans d'autres
récipients (flacons ou tubes à essai) pour être stérilisé, en général dans un autoclave. Le temps
et la température peuvent varier en fonction de la composition et du volume du milieu. En
général une stérilisation de 15-20 minutes à 120° C est préconisée. Ils peuvent ensuite être
conservés tels quels pour des utilisations ultérieures, ou coulés dans des boites de Pétri pour
une utilisation immédiate.

Figure 7 : Préparation d’un milieu de culture dans un Erlen Meyer sur un agitateur magnétique à
plaque chauffante
2.2.Cas particuliers
- Certains milieux nécessitent l'adjonction de produits ne supportant pas l'autoclavage

(sang frais, jaune d'œuf, antibiotiques, compléments vitaminiques...) qui doivent alors
être stérilisés au moment du prélèvement, généralement par filtration.
- Certains milieux nécessitent d'être régénérés avant utilisation : ils sont placés pendant
20 minutes dans un bain-marie bouillant de sorte à chasser l'oxygène dissout (Ex : gélose
viande-foie, milieu mannitol-mobilité, …etc).
- Les milieux qui doivent être ensemencés en profondeur ou à double couche sont
préalablement liquéfiés au bain marie, puis maintenus en surfusion (45-50° C) jusqu'à
leur ensemencement.
3. Types de milieux
Les caractéristiques des milieux de culture varient de même que leur composition ou leur
utilisation. Ils peuvent alors être liquides, solides ou semi-solides.

3.1.Classification selon la composition
3.1.1. Milieux synthétiques : Composition connue exactement qualitativement et

quantitativement. Ces milieux sont utilisés essentiellement pour l'étude de besoins nutritifs d'un
germe tel que : la gélose pour auxanogramme, Citrate de Simmons, Urée-Indole ... etc. Dans ce
cas, le carbone est apporté sous forme de carbonate de sodium et l'azote sous forme de nitrate
ou d'ammoniac.
3.1.2. Milieux complexes : Composition connue partiellement car utilisation de matières

premières plus ou moins complexes telles que : sérum, sang, peptone, foie, viande, soja et
caséine. Milieux usuels : composition et préparation simple, peu coûteux et convenant à un
grand nombre de germes. Par exemple : eau peptonée, bouillon nutritif, sont des milieux qui
contiennent des peptones très simple, adapté aux bactéries hétérotrophes sans exigences
particulières. Les milieux Colombia et Mueller-Hinton contiennent des peptones plus riches
peuvent être utilisées pour des bactéries plus exigeantes.
3.1.3. Milieux enrichis : addition de suspensions riches en molécules organiques (sang, sérum,
extrait globulaire,...etc) qui permet la croissance de germe exigeant. On citera quelques
exemples de milieux enrichis :
- Les géloses au sang frais de mouton ou de cheval (permet une meilleure expression de
l’activité hémolytique de certains Streptococcus du groupe D). On parle d'hémolyse alpha
(α) lorsqu'elle est partielle (zone verdâtre autour de la colonie), bêta (β) lorsqu'elle est totale,
ou de souche non-hémolytique. Il existe aussi une hémolyse α β.
- La gélose chocolat, qui définit un milieu de base additionné d’hémoglobine autoclavée. La
cuisson permet de libérer certains facteurs de croissance (telle que l'hémine).
- Gélose au sérum coagulé obtenu par séparation du coagulum d'un sang normal ou par
décantation d'un sang défibriné, stérilisé par filtration ou par tyndallisation et ajouté à 5-10
% dans les milieux, il permet la croissance des germes sérophiles (ex : Corynebacterium).
3.2.Classification selon l’utilisation
3.2.1. Milieux sélectifs : Contiennent des molécules qui inhibent certains micro-organismes
indésirables et des molécules qui stimulent la culture des micro-organismes. Par conséquent, ils

peuvent être utilisés pour séparer les bactéries des autres germes. La nature de l'inhibiteur est
variable et peut être :
- Sels : NaCl pour le milieu de Chapman à 7,5 % pour les Staphylococcus, bouillon hypersalé
à 6,5 % pour les Enterococcus. de sels biliaires (désoxycholate) pour les milieux de Mac
Conkey et d’Hektoen pour les Enterobacteriaceae.
- Antibiotiques : gélose au sang additionnée d’acide nalidixique colistine (ANC) pour les
Streptococcus ou la gélose au cétrimide pour les Pseudomonas
Il est à noter qu’on peut également augmenter la sélectivité des milieux en choisissant des
conditions de culture particulières, par exemple une température basse ou l’inverse ou
l’utilisation de jarre pour la culture des anaérobies, …etc
3.2.2. Milieux différentiels : ils facilitent la distinction entre les colonies du germe recherché
et les autres colonies présentent sur le même milieu. La plupart des milieux contiennent des
éléments permettant de mettre en évidence des caractères biochimiques, par exemple le virage
d'un indicateur de pH indiquant l’acidification du milieu par les produits de la fermentation
(milieu BCPL pour le lactose chez les coliformes, Chapman pour le mannitol chez les
Staphylococcus ...) ou par l’addition de réactifs comme l’acide suifanilique et d'α-naphtylamine
pour révéler la réduction des nitrates dans un bouillon nitraté.
3.2.3. Milieux d’enrichissement : très souvent d’aspect liquide, ils attribuent des conditions
favorables pour la culture d’un microorganisme particulier, ce qui en favorise sa multiplication.
Ces milieux sont utilisés pour accélérer la croissance d’un germe exigeant ou de croissance
lente. Par exemple : le milieu sélénite pour favoriser la croissance des salmonelles et des
shigelles dans de selles. Le bouillon Todd-Hewitt est utilisé pour enrichir les milieux pour les
streptocoques.
4. Caractéristiques de quelques milieux de culture
Baird Parker : milieu sélectif des Staphylococcus
- La réduction du tellurite en tellure noir.

- Protéolyse du jaune d'œuf, résultant en un halo transparent autour de la colonie.

- Hydrolyse enzymatique de la lécithine, aboutit à des zones blanches opaques (précipitation

blanche d'acides gras)
BCPL : Le milieu BCPL ou bouillon lactosé au pourpre de bromocrésol (BCP de l'anglais

« bromocresol purple ») : C’est un milieu différentiel de culture utilisé en microbiologie pour
l’isolement des Entérobactéries. Il comporte un indicateur de pH, le pourpre de bromocrésol
qui donne une couleur pourpre au milieu, et passe au jaune si le lactose du milieu est utilisé par
les bactéries, par fermentation. La cloche de Durham permet le recueil des gaz dégagés par la
présence de coliformes.
Eau peptonée exempte d’indole : L'addition de réactif de Kovacs montre la production

d'indole par l’apparition d’un anneau rouge
Gélose glucosée à l’oxytétracycline (base OGA) : La croissance des levures et des moisissures
est favorisée en présence de glucose et d’extrait de levure. L'ajout temporaire d'oxytétracycline
ou de chloramphénicol ou de chloramphénicol + gentamicine ou d'oxytétracycline +
gentamicine peut inhiber les bactéries, y compris les lactobacilles (micro-organismes
acidophiles, qui peuvent représenter la flore prédominante de certains aliments).

CHAPITRE IV : METHODES D’OBSERVATION DES MICROORGANISMES
Chapitre IV : Méthodes d’observation des microorganismes
CHAPITRE IV : METHODES D’OBSERVATION DES MICROORGANISMES
Il est possible d'observer les microorganismes, soit lorsqu'ils sont regroupés en colonies sur
boîte visible à l’œil, il s'agit alors d'une observation macroscopique, ou soit à l'état de cellule,
il s'agit alors d'une observation microscopique.
1. OBSERVATION MACROSCOPIQUE DES COLONIES
C'est l'étude de l'aspect des colonies qui représente un amas de cellules microbiennes, visible à
l’œil nu, constitué par des milliards de descendants d'une seule cellule et dont la taille, la forme,
la couleur, la consistance sont caractéristiques de chaque espèce. L'étude de l'apparence de la
colonie doit être observée à l'œil nu sous une lumière naturelle et artificielle, par un éclairage
direct et par la transparence de la colonie.
1.1.Conditions d'examen
L'examen macroscopique de la culture est le premier examen réalisé à partir de la purification

de la souche après incubation. L'apparence des colonies dépend du milieu utilisé, de la durée
de la culture et de la température. Il ne pourra être décrit convenablement qu'à partir de colonies
bien isolées : les colonies sont d'autant plus petites qu'elles sont rapprochées. Les colonies sont
observées par transparence, réflexion ou transillumination oblique.
1.2.Aspect des colonies
La description des colonies doit mentionner (Fig. 8) :
- La taille ou le diamètre de la colonie : elle peut être mesurée à l'aide d'une règle graduée
pour les grandes colonies.
- La forme : allure des contours lisses, dentelés, déchiquetés réguliers et irréguliers.
- Relief ou surface : bombée, demi-bombée, plate centre parfois surélevée, parfois
ombiliquée (en creux).
- L'aspect : lisse ou rugueux,
- L'opacité : opaques (ne laissent pas passer la lumière), translucides (laissent passer la
lumière mais on ne voit pas les formes au travers), transparentes (laissent passer la lumière
et voir les formes au travers, comme le verre)

- La consistance : c’est au moment du prélèvement qu’il est possible d'apprécier si les

colonies sont grasses, crémeuses (on obtient facilement des suspensions homogènes),
sèches ou encore muqueuses (on obtient difficilement des suspensions homogènes).
- La couleur (pigmentation) : une couleur différente est due à des pigments : jaune, rouge,
orange, violette ...
- L’odeur : une odeur caractéristique peut être présente ex : Proteus qui présente une odeur
désagréable qui ressemble à celle du poisson pourri ou du chou.
Figure 8 : Morphologie des colonies bactériennes
1.3.Principaux types de colonies
En rassemblant les critères précédemment décrits, trois sortes de colonies peuvent être
distinguées :
- Colonies S (de l'anglais Smooth - Lisse) : colonies à surface lisse et bords réguliers,
bombées, de consistance crémeuse et donnent des suspensions homogènes ;
- Colonies R (de l'anglais Rough - Rugueux) : colonies à surface rugueuse et bords dentelés,
plates, de consistance sèche et donnent des suspensions hétérogènes ;
- Colonies M (= Muqueuse) : colonies à surface lisse et bords réguliers, bombées, filantes
sous l'anse, et donnant des suspensions hétérogènes.

2. OBSERVATION MICROSCOPIQUE
L'observation microscopique permet d’étudier la morphologique des cellules d'une espèce

microbienne, ce qui constitue le premier critère d’identification. Elle comprend l'examen à l'état
frais (entre lame et lamelle des germes vivants) et l'examen post-coloration (sur frottis séchés
et fixés des germes morts).
2.1.Examen à l’état frais
En microbiologie, une préparation à l’état frais consiste à enfermer entre lame et lamelle une
suspension de microorganismes vivants (Fig. 9). Il permet alors d’observer : la forme des
cellules, leur mode de groupement, leur mobilité et le nombre approximatif des bactéries par
champ microscopique. Toutes ces informations définissent la morphologie bactérienne ce qui
constituent les premières critères d’identification. Un microscope optique est utilisé pour
effectuer la mise au point avec un objectif grossissant x40 sous une faible lumière (ouverture
fermée). De plus, certains organites colorés peuvent être visibles par cet examen tel que les
chloroplastes chez les cyanobactéries.
Figure 9 : Etapes de préparation d’une lame d’examen à l’état frais
4.4.3. Les formes sont extrêmement diverses (Fig. 10). La forme des cellules est un caractère
très important en bactériologie : - une forme sphérique : les coccis (ex : ordre des
Micrococcales) - une forme allongée en bâtonnet : les bacilles (ex : ordre des Bacillales), les
coccobacilles (ex : Entérobactéries) - une forme en virgule (ex : genre Vibrio) ou en ondulation
(ex : Leptospira) - une forme spiralée (ex : Spirillum) - une forme ramifiée (ex :
Actinobactéries).
4.4.4. Le mode de groupements retrouvés dans les cultures, est lié au mode de division des
germes. Ce qui vient compléter les données morphologiques et fournit de précieuses

informations pour l'identification. Ainsi, les différents groupements observés sont

caractéristiques d'un genre donné (Fig. 10).
4.4.5. La mobilité est le caractère le plus important mis en évidence à l'état frais car les cellules
sont vivantes et expriment leurs propriétés physiologiques parmi lesquelles : la mobilité. Cela
est mis en évidence par un mouvement aléatoire qui parcourt tous les sens du champ
microscopique. Ceci dit, la mobilité ne doit pas être confondue avec les mouvements browniens
qui sont dus aux forces d’agitation moléculaire causées par l’élévation de la température de la
préparation par les faisceaux lumineux émis par la lampe. D’autre part, les mouvements
transmis par les courants liquides (toutes les bactéries sont entrainées dans la même sens), sont
souvent observés et ne représentent pas la mobilité microbienne.
Cocci isolée Diplocoque Flamme de bougie Grain de café Tétrade Amas (grappe de raisin) Chainette
Exemples Pneumococcus Streptococcus Neisseria Micrococcus Staphylocoque Streptocoque
Pneumoniae
Isolée Coccobacille Diplobacille Amas Pallissade Chainette
Clostridium Entérobactéries Pseudomonas Corynebacterium Bacillus

aeruginosa anthracis
Figure 10 : Formes et modes de groupements des cellules bactériennes
2.2.Examen après coloration
Si la plupart des bactéries et des microbes peuvent être observés en suspension aqueuse, cette
observation est grandement facilitée par l'application de colorants (Fig. 11). Cet examen permet
l’étude microscopique des bactéries mortes après fixation et coloration. Cette dernière est
réalisée sur des frottis séchés et fixés, et peut être simple (1 seul colorant) ou double (deux
colorants). Le but de la réalisation d’un frotti est de tuer les bactéries et faire adhérer leur
structure cytologique à la lame (grâce à l’action de la flamme du bec Bunsen).

Figure 11 : Préparation d’un frottis bactérien sur une lame en verre
2.2.1. Coloration simple
C’est une coloration qui n’implique qu’un seul colorant. L’exemple le plus étudié de la
coloration simple est celle au bleu de méthylène. C’est une coloration complémentaire de
l’examen à l’état frais, utilisée pour appuyer cette observation si cette dernière n’est pas assez
claire sauf pour la mobilité. Le frottis est recouvert pendant trois minutes au bleu de méthylène
(Fig. 12), puis rincé à l’eau distillée et enfin séché au-dessus de la flamme du bec Bunsen.
Comme toute coloration, l’observation se fait à l’aide d’une goutte d’huile d’immersion avec
une forte luminosité (diaphragme ouvert) avec l'objectif ayant le grossissement ×100.
Figure 12 : Observation microscopique de bactéries de forme bacille groupées en courte chainette

après coloration simple au bleu de méthylène au grossissement × 100.

2.2.2. Coloration spécifique
La ciliature : la coloration des cils est réalisée sous l’action d’un mordant et d’un colorant. Les
cils s’épaississent et deviennent visibles
Les spores : c’est des formes de résistance n’existant que chez certaines espèces bactériennes,
leur présence permet à elle seule de ranger les bactéries aérobies dans la famille des Bacillaceae.
De plus la spore et sa position permettent la classification des bactéries en groupes à l'intérieur
d'une famille. Leur mise ne évidence se fait grâce à la coloration au vert de malachite.
2.2.3. Coloration différentielle
La coloration de Gram est la coloration double différentielle, réalisée lors d'un examen
microscopique de bactéries (Tab. 1). Elle permet non seulement d'observer la forme des cellules
mais aussi de diviser les bactéries en deux grands groupes taxonomiquement différents :
bactéries Gram-positif bactéries Gram-négatif (Fig. 13).
Figure 13 : Observation microscopique de la coloration de Gram de bactéries sous microscope optique

au grossissement X100 (A- Cocci Gram positif, B- Bacille Gram négatif).

Tableau 1 : Etapes de réalisation de la coloration de Gram
ETAPES MODE OPERATOIRE TEMPS PRINCIPE
PREMIERE 1 minute Le colorant violet pénètre dans les

COLORATION - Recouvrir la lame de cristal violet ou cellules bactériennes
violet de gentiane
- Rincer à l’eau distillée
MORDANÇAGE - Recouvrir de Lugol 1 minute Lugol fixe le violet de gentiane sur
- Rincer à l’eau distillée et l’égoutter les structures cellulaires
cytoplasmiques et durcit la cellule
DECOLORATION - Tenir la lame inclinée et faire couler 5 L'alcool dissout le violet de
pendant quelques secondes de l'alcool à secondes gentiane, si la paroi bactérienne est
90° jusqu'à écoulement incolore. environ perméable à l'alcool (il pénètre dans
- Rincer immédiatement à l’eau distillée les bactéries et décolore leur
et égoutter cytoplasme). Les bactéries sont dites
- Cette étape est critique car la fiabilité Gram négatif
de tout le test repose sur la maîtrise du Si les bactéries ont une paroi
temps d’action d’alcool. Car un contact imperméable à l'alcool, elles restent
prolongé faussera les résultats et conduit colorées en violet et elles sont dites
à des interprétations des bactéries Gram positif.
faussement Gram négatif.
DEUXIEME 1 minute La fuchsine recolore en rose les
COLORATION - Recouvrir la lame de fuchsine bactéries précédemment décolorées :
- Rincer à l’eau distillée les bactéries Gram négatif.
SECHAGE Par-dessus la flamme du bec Bunsun ou

simplement laisser sécher à l’air libre

CHAPITRE V : TECHNIQUES DE LA CULTURE BACTERIENNE
Chapitre V : Techniques de la culture bactérienne
CHAPITRE V : TECHNIQUES DE LA CULTURE BACTERIENNE
L’observation des bactéries, à l’aide d’un microscope, à l’état frais puis après la coloration de
Gram doit être complétée par des techniques d’isolement et d’identification. Pour ce faire, les
laboratoires ont recours à différentes techniques selon les exigences et les caractéristiques des
germes et des objectifs fixés.
1. Notions sur la culture bactérienne
Il convient d’abord de présenter la notion de croissance qui est définie comme « l’accroissement
ordonnée de tous les composants d’un organisme », chez les microorganismes, elle aboutit à
une augmentation du nombre cellulaire. Pour cela, un certain nombre de substances nutritives
doivent être présentes dans le milieu de culture (Tab. 2), qui se divise en deux types :
- Les substances élémentaires : composées des matières constitutives (C, O, H, N) et l’énergie

nécessaire pour réaliser la synthèse de ses propres constituants.
- Les facteurs de croissance : c’est des composés spécifiques additionnés aux premiers,
nécessaire à la synthèse d’un composé indispensable à la croissance.
Par ailleurs, ces composés doivent être apportés dans certaines conditions environnementales.
Des facteurs physicochimiques peuvent favoriser ou inhiber cet apport nutritionnel et donc la
culture bactérienne.

Tableau 2 : Types nutritionnels des microorganismes
Besoins Microorganismes
Lumière Phototrophe
Oxydation des produits Chimiotrophe
Source d’énergie
chimiques organiques et
minéraux
Source de carbone Matière inorganique + CO2 Autotrophe
Matière organique Hétérotrophe
Facteur de croissance Pas nécessaire Prototrophe
Nécessaire Auxotrophe
20-40° C Mésophile
0-10° C Psychrophile
Température
≤0° C Cryophile
45-55° C Thermophile
≥70° C Thermophile extrême
≤6 Acidophile
≥8 Basophile/alcalophile
pH
6,5 – 7,5 Neutrophile
Exige la présence de l’O2 Aérobie stricte
Absence de l’O2 Anaérobie stricte
Oxygène
Avec ou sans O2 Aéro-anaérobie facultatif
Faible besoin en O2 Micro-aérophile
≤ 0,2 M Non-halophile
= 0,2 M Halophile
Pression osmotique
0,2-5,2 M Halophile extrême
- Halotolérant
Eau Résistance à la dessiccation Xérophile

2. Réalisation d’une dilution décimale ou au dixième : 1/10 ou 10-1
Cette technique est basée sur une estimation statistique de la charge bactérienne de la
solution à analyser (Fig. 14). Elle a pour but de créer des concentrations décroissantes de
l'échantillon original qui sont ensuite ensemencées afin d’obtenir un nombre de bactéries
suffisamment faible pour compter les colonies individuelles.
2.1. Matériel
- Un tube de diluant de 9 mL (eau physiologique, eau peptonée, tryptone-sel-eau,…)

- Une série de pipettes stériles graduées (1-10 mL)
- Un vortex (facultatif)
- Chaque dilution nécessite un tube de diluant de 9 mL et d’une pipette stérile de 1 mL.
Ainsi, la réalisation d’une gamme de dilutions jusqu’à 10-5 nécessite : 5 tubes et 5
pipettes.
2.2. Mode opératoire de la réalisation des dilutions en série ou successives (10-1, 10-2,
10-3,….)
- Homogénéiser la suspension microbienne mère à prélever (agitation par mouvements

de retournement pendant 10 secondes environ ou à l’aide d’un vortex).
- Desserrer délicatement le bouchon et flamber l’ouverture du tube.
- Utiliser une pipette stérile pour prélever 1 mL de suspension.
- Flamber et refermer le tube. Ouvrir le tube de 9 mL de diluant, flamber l’ouverture, y
introduire le volume prélevé (sur la paroi sans toucher le liquide). Cette solution
constitue la première dilution (10-1).
- Flamber et refermer le tube, jeter la pipette souillée dans le bac à eau de Javel
- La dilution suivante s’effectue en partant du tube de la dilution précédente. 1 mL de la

dilution précédente dans 9 mL de diluant nous donne la dilution suivante. L’opération
est poursuivi jusqu’à la dilution désirée (10-5)
- L’estimation du nombre de dilutions dépond de l’estimation de la charge microbienne
initiale.

Figure 14 : Préparation des dilutions décimales consécutives
Parmi les boites comptables, on ne considèrera que les boites qui ont donné un nombre de
colonies compris entre 30 et 300 colonies.
3. Technique d’ensemencement
L’ensemencement consiste à déposer dans un milieu de culture stérile (solide ou liquide) des
germes prélevés à partir d’une culture mère. Le transport est en général effectué avec une anse
ou une pipette Pasteur stérile.
3.1.Principe et but
L’ensemencement a comme objectif d’étaler et de cultiver les microorganismes présents dans

le produit à analyser. Il doit être réalisé avec un maximum de précaution pour ne rien modifier
en la semence (ni la contaminer, ni la stériliser).

3.2.Technique de l’ensemencement
- La pipette (ou anse) et l’ouverture du tube de la culture microbienne sont passées

rapidement dans la flamme bleue du bec Bunsen ;
- L'effilure est cassée à la pince dans la zone stérile dans le cas d’une aspiration d’une culture
en solution à l’aide d’une poire ;
- La solution aspirée (en général 1 mL) grâce à une poire, est alors déposée sur le milieu de
culture ;
- Selon la matière à analyser, l’ensemencement est alors réalisé en masse, en surface ou par piqure
centrale ;
-Ensemencement de surface sous forme de stries (Fig. 15) dans le sens de la flèche ou par
étalement (dilution)
Figure 15 : Boite de Pétri ensemencée en strie sur la surface d’un milieu de culture solide
4. Techniques d'isolement
Pour étudier les microorganismes, il est indispensable de les isoler (Fig. 16) et d'en faire une
culture pure (vérification de la pureté d’une souche). L'objectif de l'isolement est donc d'obtenir
pour chaque micro-organisme différent des clones séparés. Une souche est dite pure lorsque
toutes les colonies la constituant sont identiques. Ainsi, les colonies obtenues, par l’étalement

d’une souche pure, doivent toutes présenter les mêmes caractéristiques. La méthode des stries
est très souvent utilisée dans l’isolement (Il faut faire des stries serrées pour avoir un bon
isolement).
Figure 16 : Etapes de réalisation d’un ensemencement en strie sur un milieu solide à l’aide d’une
pipette Pasteur
5. Conservation des souches pures
Dans le secteur de l’enseignement, le contrôle, la recherche et la production industrielle, les

laboratoires ont le souci de conserver les souches qui vont servir de référence dans des pratiques
antérieures. L’American Type Culture Collection (ATCC) est considérée parmi les plus grandes
sociétés des souches de référence. Les souches sont alors maintenues en survie dans un milieu
nutritif additionné d’un cryoprotecteur (protecteur du froid, ex : glycérol) à des températures
très basses (jusqu’à – 80° C) dans des cupules (trois répétitions). Cependant, la lyophilisation
est considérée comme la meilleure technique de conservation des souches car ça ne nécessite
pas la réfrigération en cas de panne d’électricité par exemple.

CHAPITRE VI : DENOMBREMENT DES MICROORGANISMES
Chapitre VI : Dénombrement des microorganismes
CHAPITRE VI : DENOMBREMENT DES MICROORGANISMES
Les techniques de dénombrement des microorganismes sont fondées sur l’évolution de leur
nombre ou de leur masse par unité de volume ou du poids du milieu. Plusieurs modalités de
techniques peuvent être proposées mais la plus habituelle est la culture en boite de Pétri. Un
volume fixe de culture bactérienne est ensemencé à la surface d’un milieu gélosé ou incorporé
au milieu avant sa solidification.
1. But
Le but du comptage (ou dénombrement) microbien est de déterminer la concentration de germes

renfermées dans l’échantillon initial. Dans le cas du contrôle de la qualité, les dénombrements
des différents groupes microbiens permet déterminer les limites d’acceptation ou de
présence/absence des contaminants microbiens selon la législation en vigueur, afin de préserver
la santé du consommateur et pour vérifier le respect des critères d’hygiène et les bonnes
pratiques de fabrication.
2. Numération en surface
2.1. Technique de « SURFACE COUNT »
C’est la technique classique d’un ensemencement en surface d’une gélose, pour la culture des
microorganismes aérobies. Un volume connu d’inoculum, par exemple 0,1 mL prélevé par une
micropipette, est déposé sur la surface et étalé à l’aide d’une pipette construite en râteau ou un
étaleur en verre. On compte alors les colonies qui se sont développées en surface.
2.2. Technique des gouttes « DROP COUNT »
Connue sous l’appellation de méthode de Miles et Misra (1938), elle consiste à déposer sur la
surface de la gélose des petites gouttes calibrées de la culture à étudier. Les colonies qui se
développent dans les zones ensemencées sont comptées au moyen d’un système grossissant
après une durée d’incubation.

2.3. Technique de dénombrement sur la membrane
Des membranes filtrantes sont utilisées dans le cas des liquides alimentaires. En effet, le
développement des colonies sur les membranes elle-même sont obtenues en les plaçant sur un
milieu gélosé approprié après un temps d’incubation. Les colonies sont donc comptées comme
elles le sont habituellement sur un milieu gélosé. Toutefois, sur une membrane de 47 mm de
diamètre, il ne faut pas dépasser 60 à 80 colonies.
2.4. Technique de « DIP SLIDES » ou les lames à immerger
Les deux surfaces de ces lames sont recouvertes de milieu d'agar desséché, qui est utilisé pour
le lait mais aussi généralement pour l'analyse microbiologique des liquides. En effet, la lame
est plongée dans l’échantillon liquide puis incubée dans un tube. La lame sur laquelle les
colonies se sont développées est comparée à une lame témoin. La capacité d’absorption de la
lame étant connue, il est possible de convertir le nombre de colonies observées en un nombre
de cellule par ml.
2.5. Cellules de comptage
Il existe différents types de cellules de comptage qui diffèrent par leur quadrillage, mais toutes
permettent de dénombrer, dans un volume précis et connu, tous les éléments visibles à l’objectif
40. Cette technique consiste à déposer entre la cellule et la lamelle, une goutte de l’échantillon,
dilué ou non, puis on compte dans le quadrillage les éléments voulus.
Le résultat est exprimé en éléments par litre de liquide. On citera l’exemple de la cellule de
« Thoma » avec un volume de totale du quadrillage de 0,1 µL (V) . comporte 16 grands carrés
contenant chacun 16 petits carrés, 4 groupes de 3 lignes horizontales et 4 groupes de 3 lignes
verticales (Fig. 17). La numération des cellules totales (vivantes et mortes) par carré : N cellules
Concentration cellulaire = (N/V) x facteur dilution
Figure 17 : Schéma d’une cellule de comptage des bactéries « cellule de Thoma »

3. Numération en milieu gélosé (en masse)
3.1.Technique standard « PLATE COUNT »
Cette technique consiste à déposer 1 mL d’une dilution dans le fond d’une boite de Pétri vide
et stérile et de verser dessus le milieu gélosé en surfusion (45° C). La culture est donc mélangée
au milieu en faisant pivoter la boite dans le sens d’une aiguille d’une montre tout en la
maintenant sur la surface de la paillasse.
3.2.Technique de la double couche
Cette technique est utilisée dans le but d’éviter le l’envahissement des colonies en surface. On
coule d’abord les ¾ de la quantité du milieu gélosé, l’ensemencement est effectué après
solidification du milieu. Le ¼ restant maintenu en surfusion au bain-marie, sera coulé par-
dessus la première couche.
3.3.Technique du « ROLL TUBE COUNT »
Comme son nom l’indique, cette technique implique l’emploi des tubes de 25 mL à bouchon
vissé. 2 à 4 mL de milieu gélosé est coulé dans ces tubes qui sont maintenu en surfusion (45°
C) au bain-Marie et 0,1 mL de chaque dilution est ajouté dans les tubes qui sont ensuite roulés
horizontalement sous l’eau froide jusqu’à ce que le milieu forme un dépôt régulier sur les parois.
Cette technique n’est plus en usage, elle a été proposée pour la culture des bactéries aérobies
strictes et les bacilles de koch dont la croissance est difficile. Le milieu utilisé est transparent
permettant un comptage facile des colonies
3.4. Technique des gouttelettes d’agar
Cette technique est proposée sous format miniaturisée et économique, elle consiste à mélanger
un broyat dilué de produit alimentaire quelconque dans l’agar fondu et refroidi à 45° C et
distribué en gouttelettes de 0,1 mL au fond d’une boite de Pétri. Il est possible donc de déposer
5 gouttelettes de 4 dilutions successives dans la même boite. Après incubation, un projecteur
spécial agrandit le diamètre des gouttelettes, permettant ainsi le comptage de colonies
ponctiformes.

4. Exemples de numération : Dénombrement des coliformes totaux et fécaux (colimétrie)
La colimétrie est l'ensemble des méthodes permettant la recherche et le dénombrement des

coliformes, indicateurs d’une contamination fécale (Fig. 18). Les coliformes totaux sont des
bâtonnets, à Gram négatif, aéro-anaérobies facultatifs, non sporulés. La différence entre les
coliformes fécaux et les coliformes totaux est que les fécaux prolifèrent même à une
température de 44 ° C.
4.1.Principe
Les bactéries coliformes ont la propriété particulière de fermenter le lactose en acide lactique
et de libérer du gaz, de manière à acidifier le milieu de culture, entraînant un changement de
l'indicateur de pH. En outre, une production de gaz apparaît dans les cloches renversées.
4.2.Mode opératoire
- Ensemencer une série de 9 tubes (avec cloche de Durham) de BCPL dont 3 tubes en
double concentré avec 10 mL d'échantillon, 3 tubes en simple concentration avec 1 mL,
et 3 tubes en double concentration avec 1 mL ;
- Incuber à 37° C pendant 48 h ;
- A partir d'un tube positif de BCPL (acidification du milieu plus dégagement du gaz),
ensemencer par 1ml un tube de 10ml contenant l'eau peptonée exempte d'indole + cloche
de Durham et incuber à 44° C pendant 24 h ;
- Apres l'incubation, ajouter au tube quelques gouttes de réactif de KOVACS.
4.3.Expression des résultats
- Virage de la couleur au jaune avec le trouble et production

de gaz dans la série de 9 tubes. Cloche de
Durham
- Après l'incubation, on observe une trouble le tube
contenant l'eau peptonée exempt d'indole, et après
l'addition de réactif de KOVACS on observe qu'il y a
production de gaz et un anneau rouge-cerise à la surface
de tube (Fig. 18).
Figure 18 : Résultat positif de la
- Le nombre de bactéries coliformes est déterminé par la
présence des coliformes fécaux
table Mac Grady. (production de gaz et apparition
d’un anneau rouge à la surface)

4.4.Méthode NPP (table de Mac Grady)

4.4.1. Principe
Nombre le Plus Probable (NPP), utilise une méthode statistique pour connaitre le nombre de
bactéries présentes dans un ml de dilution, cette technique utilise plusieurs tubes de dilution (2
à 5) et on compare les résultats à une table statistique : Table de Mac Grady (Tab. 3).
4.4.2. Technique
- Réaliser une gamme de dilution

- Ensemencer un ml de chaque dilution dans plusieurs tubes d’un milieu liquide
correctement choisi ;
- Incuber à la température adaptée du germe à rechercher. Exemple : pour les bactéries
telluriques, on incube à 30° C.
-
Tableau 3 : Table partielle de Mac Grady
Nombre de tubes positifs au niveau Le nombre le plus probable
des trois séries de dilution
000 ≤ 0,3
001 0,3
010 0,3
020 0,6
100 0,4
101 0,7
110 0,7
111 1,1
120 1,1
121 1,5
La formule utilisée est la suivante :
NPP × F 1,1 × 10
N= =
V ×D 1×10-1
N : Nombre des bactéries dans 1 mL d’eau (UFC/mL)

F : Facteur de dilution
D : Dilution
V : Volume ensemencé (1 mL)
UFC : unité formant colonie (bactérie)

Eau à
analyser
Figure 19 : Dénombrement des coliformes totaux et fécaux sur milieu liquide

CHAPITRE VII : MISE EN EVIDENCE DU TYPE DE METABOLISME
BACTERIEN
Chapitre VII : Mise en évidence du type de métabolisme bactérien
CHAPITRE VII : MISE EN EVIDENCE DU TYPE DU METABOLISME

BACTERIEN
Le métabolisme bactérien est défini comme l'ensemble des transformations chimiques

(réactions de biosynthèse et de dégradation), qui assurent l'élaboration des constituants
bactériens et leur fonctionnement. Ces transformations sont catalysées par des enzymes
spécifiques. La mise en évidence de ce métabolisme est un critère essentiel dans la classification
bactérienne.
1. Métabolisme énergétique
1.1.Type respiratoire
L’étude du type respiratoire d’un micro-organisme permet de définir ses rapports avec
l’oxygène (certaines bactéries nécessitent l’O2, d’autres l’absence d’O2). Le milieu utilisé est la
gélose viande-foie, conditionnée dans le tube de Prévot, un gradient de pression partielle en
oxygène est créé. Cette gélose est dépourvue de nitrates ce qui empêche le développement des
bactéries aérobies strictes ayant une nitrate réductase, en condition d’anaérobiose.
1.1.1. Mode opératoire
- Régénérer le milieu pendant 20 min au bain-marie (bouchon légèrement dévissé).

- Laisser refroidir jusqu’à 45° C (milieu en surfusion).
- Réaliser un ensemencement en spirale dans la masse, à l’aide d’une pipette Pasteur chargée
de la suspension bactérienne à étudier.
- Laisser solidifier puis incuber pendant 24h à une température optimale avec bouchon
dévissé.
1.1.2. Interprétation des résultats
Le type respiratoire peut donc être observé à travers le tube incubé qui aurait permis la
croissance des bactéries à différents endroits du tube selon la figure ci-dessous.

Figure 20 : Représentation des différents types respiratoires bactériens
1.2.Test de catalase
La catalase est une enzyme qui catalyse la décomposition du peroxyde d’hydrogène (H2O2)
:
H2O2 → ½ O2 + H2O
Une colonie microbienne est mise en présence d’une goutte d’eau oxygénée (3 %) sur une
lame. L’apparition de bulles gazeuses signifie la présence d’une catalase (Fig. 21).
Figure 21 : Photographie d’un résultat positif de la présence d’une catalase
1.3.Test d’oxydase
La recherche de l'oxydase est un test fondamental pour l'identification bactérienne. C’est une
enzyme de la chaîne respiratoire bactérienne qui catalyse des réactions d'oxydation du type :
DH2 + ½ O2 D + H2O
Déposer sur une lame propre un disque de papier filtre, l’imprégner d’une goutte de réactif.
Prélever une colonie parfaitement isolée avec une pipette Pasteur boulée et l’écraser sur le
disque pendant une dizaine de secondes et observer immédiatement (Fig. 22). L’apparition
d’une coloration rose/violette montre l’oxydation du réactif (souche oxydase +).

Figure 22 : Photographie des différentes réactions de la recherche du cytochrome-oxydase sur disque
1.4.Recherche de la nitrate réductase (Test de GRIESS-ILOSVAY)
Le test consiste à mettre en évidence des nitrates réductases (NRI et NRII) en présence des
nitrites dans le milieu de culture (Fig. 23) :
- Si les nitrites sont présents, ils donnent une réaction colorée rose en présence d’acide
sulfanilique et de naphtylamine. Ces réactifs portent le nom de réactifs de GRIESS.
- En absence de nitrites, la réduction des nitrates, est réalisée par addition de zinc, ce qui a
pour rôle de réduire les nitrates en nitrites

- Ensemencer la souche à étudier dans un bouillon Nitrate à (0,1 % KNO3)
- Après incubation, on ajoute les réactifs de révélation :
Acide Sulfanilique et alpha-naphtylamine : si le milieu devient rouge : présence de nitrites,

cela signifie que la bactérie possède une nitrate réductase.
Poudre de Zinc : si les nitrates sont encore présents dans le milieu, le zinc va les réduire en
nitrites donc la bactérie ne possède pas une nitrate réductase.
Figure 23 : Photographie de la réaction

de la recherche des nitrates réductases
(Réaction positive signifie la présence
de l’enzyme nitrate réductase, Réaction
négative signifie leur absence).

1.5.Épreuve de HUGH et LEIFSON
Milieu Hugh et Leifson est un Milieu d’Etude de la Voie d’Attaque des Glucides (M.E.V.A.G)
: Géloses semi-solide (molle), faiblement peptonée, additionnées de glucose à 1 %, coulées en
culot, fondues au moment de l’emploi .L’ensemencement se fait par piqûre centrale de 2 tubes
de même milieu, à partir d’une suspension du germe à étudier. Un tube est laissé ouvert « O »
tandis que l’autre est fermé par une couche de vaseline « F ». L’observation du résultat est basée
sur l’acidification du milieu (Fig. 24).
Figure 24 : Résultats des différents métabolismes bactériens
1.6.Test du mannitol-mobilité-nitrate
La dégradation en anaérobiose du mannitol conduit à la formation de fructose dont l’attaque

conduit elle-même à la formation d’acides à chaînes courtes. Les bactéries très mobiles peuvent
se déplacer dans la gélose molle : étude de la mobilité (Fig. 25). Les nitrates du milieu peuvent

être réduits en nitrites puis en N2 : test nitrate réductase. Ensemencer par piqûre centrale à l’aide
d’un fil droit.
Figure 25 : Interprétation du test de mannitol-mobilité-nitrate
2. Métabolisme Glucidique
2.1.Auxanogramme
C’est l’étude de la dégradation des sucres par la bactérie (en milieu liquide ou solide) deux
types de milieux existent :
- Milieux simples (contiennent un seul sucre) : gélose + sucre + indicateur de pH

(exemple : le milieu Mannitol-mobilité-nitrate)
- Milieux complexes (contiennent plusieurs sucres), ex : TSI (Tri-Sugar-Iron) et KIA
(Kligler-Iron-agar). Ce sont des géloses inclinées contenant : 0,1 % de glucose et 1 %
de lactose et 1 % de saccharose. L’indicateur de pH est le rouge de phénol (Fig. 25).
Figure 25 : Différentes interprétations de l’auxanogramme

- Pente jaune : les bactéries utilisent le glucose comme source de carbone et d'énergie. Cette
utilisation s'accompagne de la production d'acides organiques d'où le virage du rouge au
jaune du milieu.
- Pente rouge : l’attaque des peptones alcalinise la pente
- Culot rouge : pas de dégradation du lactose et saccharose
- Culot jaune : acidification par attaque du lactose et saccharose
2.2.Etude de la voie fermentaire des Acides
Cette étude nécessite l’utilisation du bouillon CLARK et LUBS, ensemencé avec une goutte de
suspension bactérienne de la souche à étudier. Après incubation pendant 18h à 37° C, le
bouillon est divisé dans 2 tubes stériles. Chaque tube sert à révéler une des 2 voies : RM ou VP.
- Ensemencer le milieu avec quelques gouttes de suspension bactérienne.

- Incuber pendant 24 à 48 h à 37° C.
2.2.2. Test au ROUGE de METHYL (test au RM)
- Transférer à l'aide d'une pipette Pasteur environ 0,5 mL du milieu dans un tube à
hémolyse.
- Ajouter 1 goutte de rouge de méthyle puis boucher le tube avec du coton cardé.
Interprétation
- Apparition de coloration rouge : le milieu est acide à cause de la fermentation du glucose

par la voie des acides mixtes (production d’acides forts) : souche RM +
- Pas de coloration rouge : le milieu n’est pas acide donc pas de fermentation du glucose
par la voie des acides mixtes : souche RM –
2.2.3. Réaction de VOGES-PROSKAUER (test VP)
- Transférer dans un tube à hémolyse (non stérile), à l'aide d'une pipette Pasteur, environ 0,5
mL de milieu Clark et Lubs ; y ajouter, volume à volume, la soude et l'a-naphtol (environ
0,5 mL de chaque réactif),

- Boucher le tube avec du cordon cardé, agiter et incliner le tube pour favoriser
l’oxygénation du milieu
- Attendre 10 min avant de conclure à un résultat négatif.
Interprétation
- Voie Butylène-Glycolique permet la mise en évidence de la production d'acétoïne (ou 3-

hydroxy-butanone) : Addition de 2 gouttes de KOH à 10 % et d’Alpha-naphtol
- L’apparition d’une coloration rouge (en surface) :
présence d’acétoïne indique la fermentation du glucose par la voie butylène glycolique avec
production d’acétoïne : souche VP +
- pas d’apparition de coloration rouge : absence d’acétoïne
ce qui indique que le glucose ne s’est pas fermenté par la voie butylène glycolique (pas
de production d’acétoïne) : souche VP –
2.3.Test ONPG : recherche de la β galactosidase
La recherche de la β-galactosidase est un des premiers tests enzymatiques qui explore la

présence d’une enzyme du métabolisme du lactose : la β-galactosidase qui catalyse son
hydrolyse en glucose et galactose. Cette enzyme peut être mise en évidence facilement car elle
est capable d’hydrolyser toute molécule analogue du lactose. En laboratoire, on utilise l’Ortho
Nitro Phényl Galactopyranoside. (ONPG) (Fig. 27).

- Réaliser une suspension épaisse des bactéries testées en eau distillée.
- Ajouter avec une pince flambée mais refroidie un disque imprégné d’ONPG.
- Incuber 30 min à 37°C.
- L’hydrolyse de l’ONPG par une β-galactosidase libère du galactose et de l'orthonitrophénol
(ONP), composé de couleur jaune
Figure 27 : Réaction de l’hydrolyse d’un analogue de la β galactosidase (ONPG)

3. Métabolisme protidique
3.1.Métabolisme de l’urée et du tryptophane
Trois activités enzymatiques peuvent être recherchées à partir du milieu Urée-Tryptophane :

uréase, tryptophane désaminase et tryptophanase. Ce milieu ne contient pas de source de
carbone utilisable, les bactéries ne pourront pas se multiplier.
- L’uréase est l’enzyme qui hydrolyse l’urée, son activité est directement détectable par le
suivi de l'alcalinisation du milieu qui se traduit par une coloration rouge
- La tryptophane désaminase (TDA), après addition de chlorure de Fer III. Le Fer III forme
un complexe avec le produit de l'activité de la TDA, l'acide indole-pyruvique, complexe
décelable par la formation d'un précipité marron
- La tryptophanase, après addition du réactif de Kovacs. Le diméthyl-amino-4-

benzaldéhyde contenu dans le réactif de Kovacs réagit avec l'indole, produit de l'activité de
la tryptophanase, et forme un composé coloré en rouge.
3.2.Recherche des décarboxylases LDC et ODC et de l’arginine dihydrolase ADH
Le diagnostic différentiel des espèces appartenant aux familles des Enterobacteriaceae,

Vibrionaceae et Pseudomonadaceae, est souvent facilité par la recherche de la lysine
décarboxylase (LDC), de l'ornithine décarboxylase (ODC) et de l'arginine dihydrolase (ADH).
Les deux types d'enzymes (décarboxylase et dihydrolase) ont été rassemblés parce que leurs
techniques de recherche sont similaires. De plus, en ce qui concerne l'ADH, la technique utilisée
ne permet pas de distinguer entre deux activités enzymatiques : l'activité dihydrolase et l'activité
décarboxylase.

Les milieux (milieu de Moeller) sont répartis dans des tubes à vis sous un volume de 4,5 ml.
Ces milieux ne renferment qu'un seul acide aminé, celui dont on veut étudier l'utilisation, du
glucose et le bromocrésol pourpre comme indicateur de pH (zone de virage du violet au jaune
entre pH 5,4 et 7)
La fermentation du glucose entraîne une baisse de pH importante. La production, ainsi que
l'activité, des décarboxylases et de l'ADH sera favorisée par un pH acide. D'autre part la lecture
de l'alcalinisation nécessite une anaérobiose relative :
- Une bactérie non décarboxylante utilisera les peptones du milieu, et produira des acides
organiques ainsi que des bases faibles comme l'ammoniac.
- Une bactérie décarboxylante après avoir utilisé le glucose va produire du dioxyde de carbone
et des amines. L'alcalinité des amines est importante, et le virage de l'indicateur de pH sera
obtenu.
4. Activité hydrolytique
Certaines souches ont la capacité d’hydrolyser la matière organique présente dans leur
environnement (exo-enzymes). Cette capacité peut être considérée comme un critère de
classification.
4.1.Hydrolyse des protéines
- Le test d'hydrolyse de la gélatine est inspiré par la technique d'Egamberdiyeva (2004), en

utilisant un bouillon nutritif enrichi de 50 g/l de poudre de gélatine qui servira d'agent
solidifiant, préalablement filtré par un papier filtre (0.22 µm). Après incubation à 20 ° C / 7
h, la liquéfaction du milieu (ensemencement par piqure centrale) reflète l'activité de
décomposition de la gélatine.
- L'activité uréolytique est révélée par un ensemencement en spot, sur le milieu de la gélose
à l'urée de Christensen (peptone 1 g, dextrose 1 g, chlorure de sodium 5 g, phosphate de
potassium monobasique 2 g, urée 20 g, rouge de phénol 0,012 g, gélose 15 g) et le passage
du jaune au rose fuchsia indique une réaction positive.
- L'hydrolyse de la caséine est testée sur gélose MH complétée avec 10 % de lait écrémé par
un ensemencement en spot de la suspension bactérienne et incubée à 37° C / 24 h ; une

réaction positive se traduit par l'apparition d'un halo transparent autour de la colonie (Castro-
Escarpulli et al., 2003).
4.2.Hydrolyse des polysaccharides
- L'activité amylolytique a été détectée sur la gélose Tryptic Soya Agar (TSA 1/10)
additionnée d'amidon à 1 %, après un ensemencement en spots, les boites sont incubés et la
révélation se fait en inondant les plats avec une solution d'iode (Lugol). L'hydrolyse de
l'amidon produit un halo clair autour de la colonie (Fig. 28), contrairement aux zones à arcs
bleus (Delarras, 2014).
- L'hydrolyse de la cellulose est démontrée sur milieu gélosé, complétée par de la pâte moulue
comme source de cellulose et l'activité cellulosique est démontrée par l'apparition d'un halo
clair autour de la colonie (Lesel et al., 1985).

négatif
Figure 28 : Photographie de quelques colonies microbiennes présentant une activité amylolytique

(Résultat positif : halo transparent, résultat négatif : halo bleu).
4.3.Hydrolyse des lipides
La révélation de la lécithinase peut être effectuée sur une gélose nutritive ordinaire complétée
par une émulsion de jaune d'œuf et d'eau distillée (2 mL / 20 mL). Ensuite, l'opacification de
l'agar autour de la colonie reflète la présence d'une lécithinase tandis que l'apparition d'un halo
blanc opaque signifie la présence de lipase (Delarras, 2007).
5. Galeries API
5.1.Définition
Une galerie API (Analytical Profile Index) est un ensemble de petits tubes miniaturisés sous
nommés tubules contenant des substrats déshydratés prêts à l’emploi permettant l'identification
de microorganismes par la réalisation de tests biochimiques majoritairement glucidique,
protidique et enzymatique. Chaque type de galerie est muni d’un mode d’emploi et d’une fiche
d’interprétation des résultats. Les galeries API les plus connues sont : 20 E, 20 Staph, 10 NH,
50 CHB et 20 NE (BioMèrieux, Lyon, France). Cependant, il est nécessaire d’humidifier la
galerie par ajout des gouttes d’eau stérile dans les cupules de la boite, cela empêche
l’assèchement des tests.
5.2.Choix de la galerie
Le choix du type de galerie à utiliser repose sur les caractères suivants (Figure 28) :
- La forme : cocci ou bacille ;
- Le type de Gram : Gram positif ou négatif ;
- Le test de catalase ;
- Le test de cytochrome-oxydase ;
- La présence de spore (pour les bacilles Gram positif).

5.3.Technique
- Recueillir fond et couvercle d’une boite d’incubation (support en plastique) et répartir

de l’eau dans les alvéoles pour créer une atmosphère humide ;
- Déposer stérilement la galerie dans la boite d’incubation
- Préparer l’inoculum ou la suspension bactérienne dans une ampoule pré-fournie ou dans
un tube d’eau distillée physiologique selon les recommandations de la galerie (turbidité
= 0,5 McFarland) ;
- Introduire la suspension dans les tubes de la galerie en évitant la formation des bulles ;
- Pour les caractères soulignés, remplir les cupules d’huile de paraffine ;
- Pour les caractères encadrés, remplir les tubes et les cupules ;
- Pour les caractères non spécifié, seul le tube doit être rempli ;
- Après incubation, la lecture de la galerie doit se faire en se référant au tableau de lecture
dédié à chaque galerie ;
- Effectuer les tests nécessitant l’ajout de réactifs.

Figure 29 : Guide de choix de la galerie Api (A- Guide pour les bacilles Gram négatif ; B- Guide pour les bacilles Gram positif ; C- Guide pour
les cocci Gram positif et négatif).
5.2.Exemples de galeries API
5.2.1. API 20 E
API 20 E représente un système d’identification des entérobactéries.
Tableau de lecture
QTE RÉSULTATS
TESTS COMPOSANTS ACTIFS RÉACTIONS/ENZYMES
(mg/cup.) NÉGATIF POSITIF
Β-galactosidase (Ortho
2-nitrophényl-βD-
ONPG 0.223 NitroPhényl-βD- Incolore Jaune
galactopyranoside
Galactopyranosidase)
ADH L-arginine 1.9 Arginine DiHydrolase Jaune Rouge / Orangé
LDC L-lysine 1.9 Lysine DéCarboxylase Jaune Rouge / Orangé

ODC L-ornithine 1.9 Ornithine DéCarboxylase Jaune Rouge / Orangé
CIT Trisodium citrate 0.756 Utilization du CITrate Vert pâle / jaune Rouge / Orangé
Dépot noir / fin
H2S Sodium citrate 0.075 Utilization d’H2S Incolore / grisâtre
liseré
URE Urée 0.76 UREase Jaune Rouge/Orangé
TDA / immediate
TDA L-tryptophane 0.38 Tryptophane DésAminase
Jaune Marron-rougeâtre
JAMES / immédiat
IND L-tryptophane 0.19 Production d’INDole Incolore
rose
vert pâle/jaune
Production d’acétoïne (Voges VP 1+VP 2 / 10 min
Sodium pyruvate 1.9
VP Proskauer) Incolore / rose pâle Rose / rouge
Gélatine (origine Diffusion du
GEL 0.6 Gélatinase (GELatine) Non diffusion
bovine) pigment noir
Fermentation / Oxydation
GLU D-glucose 1.9 Bleu / bleu-vert Jaune / Jaune gris
(GLUcose)
MAN D-mannitol 1.9 Bleu /bleu-vert Jaune
(MANnitol)
INO Inositol 1.9 Bleu /bleu-vert Jaune
(INOsitol)
SOR D-sorbitol 1.9 Bleu /bleu-vert Jaune
(SORbitol)
RHA L-rhamnose 1.9 Bleu /bleu-vert Jaune
(RHAmnose)
SAC D-saccharose 1.9 Bleu /bleu-vert Jaune
(SACchrose)
MEL D-melibiose 1.9 Bleu /bleu-vert Jaune
(MELibiose)
AMY Amygdaline 0.57 Bleu /bleu-vert Jaune
(AMYgdaline)
ARA L-arabinose 1.9 Bleu /bleu-vert Jaune
(ARAbinose)
OX (Voir notice du test oxydase) Cytochrome-oxydase (Voir notice du test oxydase)

5.2.2. API 20 Staph

API Staph représente un système d’identification des genres Staphylococcus, Micrococcus et
Kocuria.
Tableau de lecture
Tests Composition actifs Réaction / Enzymes Résultats
Négatif Positif
0 Aucun Témoin (-) Rouge -
GLU D-glucose Témoin (+)
FRU D-fructose
MNE D-mannose
Acidification
Rouge
Jaune
MAL D-maltose
LAC D-lactose (origine bovine)
TRE D-tréhalose
MAN D-mannitol
XLT Xylitol
MEL D-mélibiose
NIT Nitrate de potassium Réaction des nitrates en NIT1+ NIT* 2
nitrites Incolore, Rose Rouge
pâle
PAL β-naphtyl phosphate Phosphate ALcaline ZYMA+ZYM*B
Jaune Rouge
VP Sodium Pyruvate Acétyl méthyl-carbinol VP1+ VP*2
Incolore, Rose Violet - Rose
pâle
RAF D-raffinose
Acidification
XYL D-xylose
Rouge
Jaune
SAC D-saccharose
MDG Méthyle-αD-glucopyranoside
NAG N-acéthyl-glucosamine
ADH L-arginine Arginine DiHydrolase Jaune Orange - Rouge
URE Urée UREase Rouge - Violet
*NIT : Réactif nitrates réductase ; ZYM : Réactif de ZYM ; VP : Réactif Voges Proskauer.

5.2.2. API 20 NE
API 20 NE est un système d’identification des bacilles Gram négatif non entérobactérie
(Pseudomonas, Acinetobacter, Flavobacterium, Moroxella, Vibrio, Aeromonas).
Tableau de lecture

NO3 Nitrate de potassium Réaction de nitrates en NIT1+NIT*2 / 5min
nitrates Incolore Rose
Réaction de nitrates en Zn / 5 min
azote Rose Incolore
TRP L-Tryptophane Formation d’indole JAMES* / Immédiat
(Tryptophane) Incolore / jaune Rose
GLU D-glucose Fermentation Blue à vert Jaune
ADH L-arginine Arginine DiHydrolase Jaune Orange / Rose /
rouge
URE Urée UREase Jaune Orange / Rose /
rouge
ESC Esculine citrate de fer Hydrolyse (β-glucosidase) Jaune Gris / marron /
noir
GEL Gelatine Hydrolyse (protéine) Pas de diffusion Diffusion de
(Gélatinase) du pigment pigment noir
PNPG 4-nitrophényl-βD- β-glucosidase (Para- Incolore Jaune
galactopyranoside NitroPhényl-ßD-
Galactopyranosidase)
GLU D-glucose
ARA L-arabinose
MNE D-mannose
MAN D-mannitole
NAG N-acétyl-glucosamine
Assimilation
Transparent
Opaque
MAL D-maltose
GNT Gluconate de
potassium
CAP Acide caprique
ADI Acide adipique
MLI Acide malique
CIT Trisodium citrate
PAC Acide phénylacétique
OX Oxydase Cytochrome-oxydase Voir la notice du test d'oxydase
*NIT : Réactif nitrates réductase ; JAMES : Réactif de James.

5.2.3. API 20 Strep

API 20 Strep est un système d’identification des Streptocoques et Entérocoques.
Tableau de lecture
Négatif Positif
VP Pyruvate de sodium Production d'acétoïne VP 1 + VP* 2 / 10 min
(Voges Proskauer) Incolore Rose / rouge
HIP Acide hypurique Hydrolyse d’Acide NiN*/ 10 min
HYPpurique Incolore – Bleu Bleu foncé /
pâle Violet
ESC Esculine citrate de fer Hydrolyse (β- 4h 24h 4h 24h
glucosidase) Incolore Incolore Gris Noir
jaune jaune noir
pâle pâle
PYRA Acide PYRrolidonyl Arylamidase ZYM A ; ZYM B* / 10 min
pyroglutamique Incolore / Orange Orange
β-naphtylamide
αGAL 6-bromo-2-naphthyl- α-GALactosidase Incolore Violet
αD-
galactopyranoside
βGUR acide naphtol-ASBI β-GLUeuROnidase Incolore Blue
glucuronique
βGAL 2-naphtyl-ßD β-GALactosidase Incolore / Violet Violet
galactopyranoside pâle
PAL 2-naphyl phosphate Phosphatase alcaline Incolore Violet
LAP L-leucine-β- Leucine aminoPeptidase Incolore Orange
naphthylamide
ADH L-arginine Argnine Dihydrolase Jaune Rouge
RIB D-ribose 4h 24h 4h 24h
Rouge Orange - Orange Jaune
Rouge Jaune
ARA L-arabinose Rouge Orange- Orange Jaune
Rouge Jaune
MAN D-mannitol Rouge Orange Orange Jaune
Rouge Jaune
SOR D-sorbitol Rouge Orange Orange Jaune
Acidification
Rouge Jaune
LAC D-lactose Rouge Orange Orange Jaune
Rouge Jaune
TRE D-tréhalose Rouge Orange Orange Jaune
Rouge Jaune
INU Inuline Rouge Orange Orange Jaune
Rouge Jaune
RAF D-raffinose Rouge Orange Orange Jaune
Rouge Jaune
AMD Amidon Rouge Orange Orange Jaune
Rouge Jaune
GLYG Glycogène Orange - Rouge Jaune Vif
* VP : Réactif Voges Proskauer ; ZYM : Réactif de ZYM ; NiN : Réactif de NiN.

CHAPITRE VII : ANTIBIOGRAMME
Chapitre VII : Antibiogramme
CHAPITRE VII : ANTIBIOGRAMME
L’antibiotique a été découvert la première fois par le scientifique britannique « Alexander

Fleming » (1881-1955). En effet ce dernier a remarqué l’inhibition de la croissance d’une
souche de staphylocoque par un champignon, le Penicillium dont il a décidé de filtrer la culture
qu’il nomma : pénicilline. Cette dernière présenta un fort pouvoir bactéricide et une faible
toxicité pour l’homme et donc a été purifié en 1940 et l’air des antibiotiques débuta.
1. Définition
Un antibiogramme est une procédure réalisée en laboratoire permettant de tester la sensibilité

de souches bactériennes à différents antibiotiques. L'antibiogramme est utilisé pour adapter les
traitements cliniques d’antibiotiques.
2. But et principe
Le but est d’estimer la probabilité de réussite d’une antibiothérapie sur un isolat bactérien
spécifique. Il consiste à mettre le germe en contact avec des disques de papier buvard imprégnés
d'un antibiotique donné à des concentrations déterminées par la standardisation de
l'antibiogramme selon le Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI),
3. Mode opératoire
Des étapes simples mais essentielles sont réalisées pour effectuer un bon antibiogramme (Fig.
30) :
- Préparer les boites préalablement coulées par la gélose Muller-Hinton ;
- Préparer la solution bactérienne à tester et ajuster à la densité bactérienne de 0,5 Mc
Farland, dans un tube à essai ; (utiliser le tube témoin de la densité fourni dans le kit de
test)
- Imprégner un écouvillon stérile dans la solution préparée et l’essorer légèrement sur la
paroi du tube ;
- Prendre l’écouvillon et le déposer sur la surface de la gélose en réalisant un
ensemencement par étalement (Fig. 30) de haut en bas de la boite, refaire cette opération
deux fois en inclinant la boite à 60°,dans le but de bien couvrir toute la surface ;

- Déposer les disques des antibiotiques à tester à l’aide d’un distributeur de disques, ou
manuellement par une pince, par-dessus la gélose ensemencée (un maximum de 9
disques) ;
- Incuber les boites à 37° C pendant 24 h.
-
-
Figure 30 : Ensemencement de la culture bactérienne à l’aide d’un écouvillon stérile
(écouvillonnage) sur la surface de la gélose Muller-Hinton.
Figure 31 : Etapes de réalisation d’un antibiogramme

4. Interprétation des résultats
Les résultats de l’antibiogramme sont interprétés par la mesure de la zone d’inhibition (mm)
qui apparait ou pas autour d’un disque d’antibiotique donné (Fig. 32), en la comparant aux
normes indiquées par la législation en vigueur. En fait, les souches bactériennes testées peuvent
être divisées en trois catégories :
- Sensible (S) : probabilité de succès thérapeutique acceptable en cas de traitement à dose

habituelle par voie générale. La zone d’inhibition est significativement grande.
- Intermédiaire (I) : succès thérapeutique imprévisible ensemble hétérogène pour lequel la
seule valeur de la CMI n'est pas prédictive. La zone d’inhibition est moyennement
significative.
- Résistant (R) : forte probabilité d'échec thérapeutique quel que soit le traitement. Absence
ou faible zone d’inhibition.
Figure 32 : Photographie de l’antibiogramme de la souche de référence Echerichia coli

ATCC 25922 aux antibiotiques
5. Concentration minimale inhibitrice (CMI)

5.1.Définition
La CMI correspond à la plus faible concentration d’antibiotique capable d’inhiber la croissance
bactérienne visible à l’œil nu.
5.2.But
La CMI nous renseigne sur la concentration ou dose suffisante d’antibiotique à appliquer pour
le traitement des infections bactériennes chez l’homme et l’animal.

5.3.Technique
Différente techniques existent pour la mesurer, sauf qu’en milieu clinique, ça nécessite une
pratique rapide et efficace. A cet effet, des bandelettes prêtes à l’emploi sont utilisée, elles sont
imprégnées de concentrations croissantes de l’antibiotique à tester, c’est le ETEST®. C’est une
bandelette contenant un gradient prédéfini et continu de 15 concentrations d'antibiotiques. Une
bandelette est déposée sur la gélose Muller-Hinton préalablement ensemencée par la culture
bactérienne à l’aide d’un écouvillon tout comme pour l’antibiogramme. La lecture de la CMI
correspond à la première concentration qui inhibe la croissance bactérienne. .
CMI
Figure 33 : Bandelette de détermination de CMI pour Ceftolozane/Tazobactam

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
Références bibliographiques
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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program in food microbiology by interlaboratory comparison: analytical methods in use, impact
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Lebensmitteluntersuchung und Hygiene, 95(1), 32-44.
7. Delarras, C. 2007. Microbiologie pratique pour le laboratoire d'analyses ou de contrôle sanitaire.
Edition Tec & Doc, Lavoisier, Paris, France.
8. Delarras, C. 2014. Pratique en microbiologie de laboratoire : recherche de bactéries et de
levures-moisissures. Edition Tec & Doc, Lavoisier, Paris, France.
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Références bibliographiques
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19. Courvalin P., Goldstein P., Philippon A., Sirot J. 1985. L'antibiogramme. MPC Videom,
Bruxelles, 343 p

EXERCICES ET CORRIGES
Exercices
EXERCICES
Exercice I :
A partir de trois sols différents, une suspension de 1 g de sol tamisé dans 10 ml d'eau
physiologique stérile a été préparée. Des séries de dilutions de 10-1 à 10-5 ont été préparées dans
l’eau physiologique à partir de chaque suspension de sol. Ensuite, 1 ml de chaque dilution
préparée a été ensemencé dans un milieu de culture TSA (Tryptic Soya Agar), à raison de trois
répétitions pour chaque dilution et incubées à 28° C pendant 5 jours. Les résultats obtenus sont
représentés ci-dessous :
Dilutions 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

Sol 1 534 314 185 120 28
Sol 2 598 421 380 321 145
Sol 3 602 513 406 302 173
1) Calculez le nombre de bactéries par gramme de sol pour les trois types de sol.
Exercice II
Le dénombrement des coliformes fécaux dans une eau de consommation a été réalisé par la
méthode du NPP (Nombre le plus probable).
Tableau de Mac Crady (3 tubes par dilution)
NPP NPP NPP

Exercices
Dilutions 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

Résultats (tubes positifs) + + + + + + + + - + - - - - -
Nombre de résultats 3 3 2 1 0
positifs
Regroupement 332 321 210 - -
1. En prenant en compte le tableau des résultats ci-dessus et le tableau de Mac Crady, calculez
la concentration des coliformes fécaux dans l’eau analysée.
Exercice III : Répondre par vrai ou faux
1. Le four Pasteur est une étuve à air chaud et humide.

Vrai Faux
2. La stérilisation par la chaleur humide s’opère à des températures inférieures à celles qui sont
nécessaires en milieu sec.
Vrai Faux
3. La pasteurisation est toujours suivie d’un refroidissement rapide.
Vrai Faux
4. Un milieu de culture complexe est un milieu de composition connue qualitativement et
quantitativement.
Vrai Faux
5. Le milieu d’enrichissement est très rarement sous forme solide.
Vrai Faux
6. La coloration de Gram est une coloration simple.
Vrai Faux
7. L’oxydase est une enzyme de la chaine respiratoire bactérienne.
Vrai Faux
8. Le milieu Roth est un milieu d’enrichissement des Streptocoques.
Vrai Faux

Exercices
Exercice IV : QCM
1. Les échantillons prélevés à analyser doivent être conservés à :

a) 8°C pour une durée maximale de transport de 24H.
b) 8°C pour une durée maximale de transport de 8H.
c) 4°C pour une durée maximale de transport de 24H.
d) 4°C pour une durée maximale de transport de 8H.
2. La stérilisation par le four Pasteur est réalisée à :

a) 100-120°C pendant 1H
b) 170-180°C pendant 30mn
c) 160°C pendant 1H
d) 130°C pendant 20mn
3. La tyndallisation consiste à :
a) Une série de 2 pasteurisations séparées par un intervalle de 12 H.
b) Une série de 3 pasteurisations séparées par un intervalle de 12 H.
c) Une série de 2 pasteurisations séparées par un intervalle de 24 H.
d) Une série de 3 pasteurisations séparées par un intervalle de 24 H.
4. La composition d’un milieu de culture synthétique est :

a) Inconnue quantitativement et qualitativement
b) Connue exactement quantitativement et qualitativement
c) Connue partiellement quantitativement et qualitativement
d) Essentiellement complexe
5. La mobilité des bactéries est observée grâce à :

a) Un examen après une coloration simple
b) Un examen après une coloration différentielle
c) Un examen macroscopique
d) Un examen à l’état frais

Exercices
6. Un microorganisme prototrophe est celui qui :

a) Se prolifère dans un milieu basique.
b) Nécessite quelques facteurs de croissance.
c) Ne synthétise pas les substances nécessaires à sa prolifération
d) Se prolifère dans un milieu très riche.
7. Une concentration minimale inhibitrice (CMI) est :

a) La plus faible concentration d’antibiotique capable d’inhiber la croissance bactérienne.
b) La concentration la plus élevée d’antibiotique capable d’inhiber la croissance
bactérienne.
c) La concentration moyenne d’antibiotique capable d’inhiber la croissance bactérienne.
d) La concentration inconnue d’antibiotique capable d’inhiber la croissance bactérienne.
8. La méthode NPP signifie :

a) Le nombre le plus grand de bactéries présentent dans un 1 ml de dilution.
b) Le nombre le plus faible de bactéries présentent dans un 1 ml de dilution.
c) Le nombre le plus probable de bactéries présentent dans un 1 ml de dilution.
d) Le nombre le moins probable de bactéries présentent dans un 1 ml de dilution.
Exercice V : Complétez les expressions suivantes :
1. Le terme……………….. désigne les bactéries de forme sphérique

2. La composition et la structure de la paroi des bactéries Gram ………………font que
l’alcool puisse pénétrer très difficilement
3. Un milieu de culture qui facilite la distinction entre les colonies de la bactérie recherchée
et les autres bactéries, est un milieu…………………………
4. Selon son utilisation, un milieu de culture peut être : ………………………….
ou………………………. ou …………………………….
5. L’hypochlorite de sodium est mieux connu sous l’appellation de………………….
6. La ………………… est l’opération qui a pour objet de tuer tous les………………..
7. ……………………….. permet de déterminer la nature des substrats utilisés par les
microorganismes comme source d’énergie et de carbone.
8. Les colonies à surface lisse et bords réguliers, bombées de consistance crémeuse, sont des
colonies de type…………………

Exercices
9. Un microorganisme qui nécessite la présence de facteur (s) de croissance, est un

microorganisme………………………………
10. Un test positif de catalase sets démontré par le dégagement de
…………………………………………….
11. Le bouillon nitraté KNO3 est utilisé dans la recherche
des……………………………………………………..
12. L’antibiogramme est une procédure réalisée au laboratoire permettant de tester
……………….. ou ……………….. d’un germe bactérien vis-à-vis d’un ou
plusieurs……………………
Exercice VI : L’observation au microscope d’une certaine bactérie par-dessous une lamelle

donne la figure ci-dessous. Donnez un titre avec une brève description de ce que vous observez
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………

Exercices
RESOLUTION DES EXERCICES
Exercice I
Dans le cas d’échantillons solides, comme le sol, on doit passer par une étape de préparation de
l’échantillon (ici broyage de 1g (V) de sol et sa dissolution dans 10 mL d’eau physiologique
stérile pour préparer la solution mère et passer à la dilution décimale (10-1 : Facteur de dilution).
Cette étape est à considérer lors des calculs pour ramener au gramme de sol.
Pour exprimer le résultat par gramme de sol, on considère que la préparation de la suspension
initiale (1g dans 10 ml) est équivalente à une dilution au 1/10 du sol étudié. Ainsi le nombre
trouvé ci-dessous sera multiplié par 10
Sol 1 : il existe deux nombre (N) à prendre en considération (30 ≤ N ≤ 300)

N1 : 185 correspondant à la dilution 10-3
N2 : 120 correspondant à la dilution 10-4
La formule utilisée est la suivante :ex : dilution 10-3
N × F 185 × 10
C= = = 1,85 106 UFC/gr
- V ×D 1× 10 -3
Sol 2 :
N : 145 correspondants à la dilution 10-5
La formule utilisée est la suivante : (ex : dilution 10-3
N × F 145 × 10
C= = = 1,45 108 UFC/gr
V ×D 1× 10-5
Sol 3 :
N : 173 correspondant à la dilution 10-5
La formule utilisée est la suivante : ex : dilution 10-3
N × F 173 × 10
C= = = 1,73 108 UFC/gr
V ×D 1× 10-5
Exercice II
Pour la méthode du nombre le plus probable, on se base sur des tables statistiques qui donnent
le nombre le plus probable de germes dans un milieu tenant compte du nombre de tubes positifs
obtenus dans cette expérience. Le nombre de tubes positifs relevés nous permet de calculer un
nombre caractéristique qui est formé de trois chiffres. Le premier nombre correspond au nombre
enregistré à la dilution maximale, ce qui donne le nombre maximum de tubes positifs. Cette

Exercices
dilution sera prise en compte dans le calcul. Les deux autres nombres correspondent
respectivement au nombre de tubes positifs dans les deux dilutions suivantes.
D’après la table de Mac Grady, chaque numéro de caractéristique correspond à un nombre plus
probable de bactéries en considérant la quantité d'ensemencement de la dilution.
Les nombres caractéristiques sont :
- 332 à la dilution 10-1 (NPP correspondant dans la table de Mac Grady : 110)
- 321 à la dilution 10-2 (NPP correspondant dans la table de Mac Grady : 15)
La formule utilisée est la suivante : (ex : dilution 10-1
NPP × F 110 × 10
N= = = 1,1 104 UFC/ml
- V ×D 1× 10-1
Exercice III : vrai ou faux
1 : faux, 2 : vrai, 3 : vrai, 4 : faux, 5 : vrai, 6 : faux, 7 : vrai, 8 : vrai.
Exercice IV : QCM
9. Les échantillons prélevés à analyser doivent être conservés à :

4°C pour une durée maximale de transport de 8H.
10. La stérilisation par le four Pasteur est réalisée à :
170-180°C pendant 30mn
11. La tyndallisation consiste à :
Une série de 3 pasteurisations séparées par un intervalle de 24 H.
12. La composition d’un milieu de culture synthétique est :
Connue exactement quantitativement et qualitativement
13. La mobilité des bactéries est observée grâce à :
Un examen à l’état frais
14. Un microorganisme prototrophe est celui qui :
Ne synthétise pas les substances nécessaires à sa prolifération
15. Une concentration minimale inhibitrice (CMI) est :

Exercices
La plus faible concentration d’antibiotique capable d’inhiber la croissance bactérienne.

16. La méthode NPP signifie :
Le nombre le plus probable de bactéries présentent dans un 1 ml de dilution.
Exercice V
1. Cocci
2. Positif
3. Différentiel
4. Sélectif, différentiel et enrichissement
5. Eau de javel
6. Stérilisation,microorganismes
7. Auxanogramme
8. Smooth (type S)
9. Auxotrophe
10. Bulles d’air
11. Nitrates réductase
12. Sensibilité, résistance, antibiotiques
Exercice VI
Titre de la figure : Observation de bactérie de forme cocci, isolée ou en amas au microscope
photonique à un grossissement 40
Description : cette observation est le résultat d’un examen à l’état frais car présence d’une
lamelle par-dessus la goutte de culture déposée sur la lame, ce qui a permis de voir la forme et
le mode de groupement et d’enduire le grossissement du microscope
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Book · March 2021

Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) and drought tolerance View project

Phenolic compounds View project

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TECHNIQUES D’ANALYSE MICROBIOLOGIQUE

3ème Année Licence Microbiologie

- Ce document ne dispense pas les étudiants de la responsabilité d'assister aux cours -

Pour toutes suggestions, e-mail : benaissa.asmaa@yahoo.fr

Maître de conférences B au département des Sciences Biologiques, Université de Tamanrasset (CUT) et

Houari Boumediene (FSB/USTHB), Alger.

Je remercie de tout cœur le Professeur Ahmed ABDERRAHMANI (USTHB) et le Docteur Abdelkader

BEKHTI (Université d’Adrar) pour l’évaluation de ce manuscrit.

Chapitre I : Techniques de stérilisation 1

1. Stérilisation par les méthodes physiques 1

Chapitre II : Méthodes de Prélèvement 7

Chapitre III : Les milieux de culture 10

1. Observation macroscopique des colonies 15

Chapitre V : Techniques de la culture bactérienne 22

1. Notions sur la culture 22

Chapitre V : Dénombrement des microorganismes 28

Chapitre VI : Mise en évidence du type de métabolisme bactérien 34

Chapitre VII : Antibiogramme 51

Résolution des exercices 62

ADH : Arginine di-hydrolase

g.L-1 : Gramme par litre

Figure 1 : Flambage d’une pipette Pasteur au niveau de la flamme bleue du bec 2

Figure 2 : Photographie représentant un four Pasteur 2

Figure 3 : Photographie d’un autoclave de paillasse 3

Figure 4 : Photographies de deux modèles de bain-marie de paillasse 4

Figure 5 : Illustration d’une stérilisation par filtration 5

Figure 6 : Hotte - Poste de sécurité microbiologique (PSM - classe II) muni de 6

Figure 7 : Préparation d’un milieu de culture dans un flacon de 1L sur un agitateur 11

Figure 8 : Morphologie des colonies bactériennes 17

Figure 9 : Etapes de préparation d’une lame d’examen à l’état frais 17

Figure 10 : Formes et modes de groupements des cellules bactériennes 18

Figure 11 : Préparation d’un frottis bactérien sur une lame en verre 19

Figure 12 : Observation microscopique de bactéries de forme bacille groupées en 19

Figure 13 : Observation microscopique de la coloration de Gram de bactéries sous 20

Figure 14 : Préparation des dilutions décimales consécutives 25

Figure 16 : Etapes de réalisation d’un ensemencement en strie sur un milieu solide à 27

Figure 17 : Schéma d’une cellule de comptage des bactéries « Thoma » 29

Figure 18 : Résultat positif de la présence des coliformes fécaux (production de gaz 31

Figure 20 : Représentation des différents types respiratoires bactériens 35

Figure 21 : Photographie d’un résultat positif de la présence d’une catalase 35

Figure 22 : Photographie des différentes réactions de la recherche du cytochrome- 36

Figure 23 : Photographie de la réaction de la recherche des nitrates réductases 36

Figure 24 : Résultats des différents métabolismes bactériens 37

Figure 25 : Interprétation du test de mannitol-mobilité-nitrate 38

Figure 26 : Différentes interprétations de l’auxanogramme 38

Figure 27 : Réaction de l’hydrolyse d’un analogue de la β galactosidase (ONPG) 41

Figure 28 : Photographie de quelques colonies microbiennes présentant une activité 44

Figure 30 : Ensemencement de la culture bactérienne à l’aide d’un écouvillon stérile 52

Figure 31 : Etapes de réalisation d’un antibiogramme 52

Figure 32 : Photographie de l’antibiogramme de la souche de référence Echerichia 53

Figure 33 : Bandelettes de détermination de CMI pour Ceftolozane/Tazobactam 54

Tableau 1 : Etapes de réalisation de la coloration de Gram 21

Tableau 2 : Types nutritionnels des microorganismes 23

Tableau 3 : Table partielle de Mac Grady 32

CHAPITRE I : TECHNIQUES DE STERILISATION

1. Stérilisation par les méthodes physiques

Techniques d’Analyse Microbiologique/ Dr. Asmaa BENAISSA (2020) 1