Introduction 

:
Les bactéries sont identifiées dans les laboratoires par diverses méthodes, notamment la
microscopie (états frai, après coloration), l'observation des caractéristiques de croissance (liste
des milieux de culture), la détermination des réactions aux composés organiques et
inorganiques (Galerie API, Technique microbiologique) et les techniques moléculaires.

Objectif :

 Permet d'utiliser les caractéristiques connues d'un groupe taxonomique pour en

évaluer les risques.

Matériel :

 Les lames

 Microscope optique

 Les tubes

 Support

 Incubateur

 pipettes pasteur

 Des colonies

 Les colorations

 bain d’eau froide

 Mode opératoire :

Coloration de gram :
 On met la bactérie (1) dans un frottis

 À partir d'un prélèvement, un frottis est

fait, On sèche à l'air et fixé à la chaleur.

 La première application est réalisée

avec du violet de gentiane, pendant 60
sec.
 La lame est ensuite rincée à l'eau pour
une 2 ème application de lugol,
pendant 60 sec.

 La lame est de nouveau rincée à l'eau

pour une 3 ème application d'alcool
éthylique (15 sec).

 Une derrière étape de rinçage à l'eau

et l'application d'un contre-colorant de
la fuchsine.

 La lame est ensuite rincée et séchée

pour une analyse des résultats de la
procédure de coloration au microscope.

Test de la gélose VF :

 On prend une colonie par la pipette boulée chargée

et plongée au fond du tube

 En ensemencement totaux spirale

 On fait l’incubation à 37 °C pendant 24 heures

 Test de catalase :

 À l'aide d'une pipette boutonnée stérile,

prélevez une colonie bien isolée d’une
culture pure (18 à 24 heures d’incubation) et
placez-la sur la lame de microscope.

 À l'aide d'un compte-gouttes ou d'une pipette

Pasteur, déposez 1 goutte de H2O + O2 à 3%
sur la colonie. Ne pas mélanger.

 Couvrez immédiatement la boîte de Pétri

avec un couvercle et observez la formation immédiate de bulles (O 2 + eau =
bulles)

Test d’oxydase :

 Un carré de papier buvard imbibé de substrat

est posé sur une lame de verre

 des fragments de colonies sont fixés sur

la lame de verre avec une pipette pasteur boutonnée

 on ajoute quelque gout d’eau distillé

Test Biochimique (MEVAG) :

 Régénérer le tube 20 minutes à 100°C
 Additionner stérilement le glucose

pour une concentration finale de 1%

 Solidifier le milieu en le plaçant dans

un bain d’eau froide

 Ensemencer par une piqûre centrale

à l’aide du fil droit.

 Incuber 24h à 37°C, bouchon dévissé.

Test de gélose TSI :

 A partir d’une colonie suspecte prélevée

sur un milieu d’isolement sélectif

 Ensemencement le culot par piquer centrale

et la surface par des stries serrées

 Incuber pendant 24 heures à 37°C

Test de mannitol mobilité :

 Ensemencer avec 'une pipette Pasteur,

par piqûre centrale, jusqu’au fond du tube de gélose

 Incuber pendant 24 heures à 37°C

Test de citrate de Simmons :

 Suspendre les composants, poudre déshydratée,

dans l'eau (23.3 g dans 1000 ml d'eau distillée).
 Le milieu est bouilli pendant quelques secondes
jusqu'à dissolution complète des ingrédients.
 Répartir dans des tubes ou flacons et stériliser
par autoclavage à 121°C pendant 15 minutes.
 Laisser les tubes refroidir en pente.
 Résultat :

Gram Positive (+) Oxydase Positive (+)

VF aérobie Stricte
Catalase positive (+)
 Mannitol Rouge mobile Citrate vert négative (-)

MEVAG fermentation H2S+ positive

 Interprétation :

Coloration de Gram :

La coloration de Gram se présente positive, les bactéries peuvent être des coques ou des

bacilles et selon leur présentation, les micro-organismes observés sont des Streptococcus
pyogènes

Test de gélose de VF :

Ce milieu est ensemencé lors de l’étude du type respiratoire bactérien. Le tube présente deux
zones dans lesquelles la composition en oxygène est différente : les bactéries en fonction de
leur type respiratoire vont se développer dans une zone, On remarque que la bactérie pousse
au fond du tube donc c’est une bactérie anaérobie stricte.

Test de catalase :
Le test consiste à mettre des bactéries en quantité suffisante en contacte de peroxyde
d'hydrogène (H2O2). On remarque qu’ils possèdent la catalase (positif), elles dégradent le
peroxyde d'hydrogène en eau et dioxygène visible par la formation de bulles

Test d’oxydase :

Le papier présente une coloration bleu foncé à violet : le substrat a été oxydé, la bactérie
possède une oxydase

Test Biochimique (MEVAG) :

On remarque que es deux tubes sont jaunes (PH acide), acidification dans les deux
tubes : Métabolisme fermentatif et oxydatif du glucose.

Test de gélose TSI :

On remarque qu’il y a des étahes noir donc il y a production des gaz et H2S+ :

 La production de gaz (CO 2 et O 2) est détectée par la divisidion (décollement) de la

gélose et Le précipité noir indique que les bactéries ont été capables de produire du
sulfure d'hydrogène (H 2S) à partir du thiosulfate de sodium. Comme le H 2S est incolore,
le citrate d'ammonium ferrique est utilisé comme indicateur de formation de sulfure
ferreux insoluble -La formation de H 2S nécessite un environnement acide ; ceci veut dire
que même si la couleur du culot ne peut pas être vue à cause du noircissement du milieu,
la bactérie est glucose (+) car s'il n'y avait pas consommation de glucose et acidification
du milieu la formation de l'H2S ne pourrait pas avoir lieu.
Test de mannitol mobilité :

On remarque aucune production d’acide donc il y a pas la fermentation : mannitol –

Test de citrate de Simmons :

On remarque que le milieu est vert et ne présente aucune culture. La bactérie n’utilise pas le
citrate comme seul e source de carbone : Citrate –

Conclusion :
L'identification bactérienne est essentielle dans le processus d'un examen bactériologique en
donnant au clinicien des informations importantes sur la gravité, l'origine ou le traitement
d'une infection. Pour cela, elle doit être à la fois fiable et rapide, certaines circonstances
l'exigeant.