Université Saad Dahleb-Blida

Faculté de Médecine
Département de Pharmacie

LES MILIEUX DE CULTURE UTILISÉS

EN
MYCOLOGIE MÉDICALE

Dr L.Rezkallah
Laboratoire de Parasitologie-Mycologie
Année universitaire: 2019-2020
 Introduction-Définition
Culture Technique de laboratoire

Présence ou absence
des champignons Conditions
optimales
Développement (isolement)
et Identification
des champignons

Culture en mycologie :
Primordiale, indispensable, obligatoire et systématique
Nécessaire au diagnostic et source de contamination
Intéresse tout type de prélèvement
 Intérêt de la culture
↗ % de résultats positifs
Redresser ED faussement négatif →↗ sensibilité de
l’ED
Culture combinée à Affirmer ou infirmer présence de champignon
l’examen direct (ED) Précise le genre et l’espèce du champignon
Source de contamination, Intérêt épidémiologique
Intérêt TRT, Réaliser un antifongigramme

Culture = technique de référence

Isolement Identification
(Macro et Micro)
Des champignons
 Intérêt de la culture
Culture est :

Nécessaire au diagnostic (en mycologie)

Utile (autres applications):
Source d’antigènes
Etudes immunologiques
Etudes de la physiologie et physiopathologie
Etudes biochimiques
Etudes d’essais thérapeutiques
Etudes génétiques (Taxonomie : Classification)
Didactiques
 Limites de la culture
ED (+) / Culture (-) Culture : Dangereuse

Patient sous traitement Champignons dimorphiques (Coccidioïdomycose)

Impossible de préciser l’agent S/Hotte à flux laminaire

en cause ( genre et espèce) Inoculation à l’animal

Prélèvement souillé
Culture en mycologie: Reproduire experimentalement la maladie
Utilise:
Milieux d’isolement et Milieux d’identification (choisis en fonction de
l’orientation Dg)
Depend:
Qualité et l’origine de l’agar
 pH des milieux
Température d’autoclavage : ½ contenant glucose:T° max d’autoclavage
(pas > 110°C)  Caramélisation
Milieux de culture en mycologie

Milieux
Milieux d’isolement
d’identification

Sabouraud-
Sabouraud-
Chloramophénicol- Choisis
Chloramophénicol
Actidione fonction du Dg
(SC)
(SAC)

Levuriformes Filamenteux
 Culture en mycologie
Milieux (1/2) d’isolement
Sabouraud glucosé
Glucose…………………………20g
NB:
•Milieux coulés en tubes:
Peptone……………………..10g
Préférable (aux boîtes de Pétri )
Agar……………………………20g
(quand croissance lente)
Eau distillée………………..1000ml
•Tubes fermés au coton :
pH 6 à 6,5
Préférables aux tubes à vis métalliques
Autoclaver pendant 15mn à 115°C
(Atmosphère en aérobie )
Conservation pendant 1 à 2 mois a + 4°C

A ce milieu de base, ajouter :

Sabouraud chloramphénicol : Sabouraud chloramphénicol -Actidione:
(SC) (SAC)
Chloramphénicol…………0,5g
Chloramphénicol…………0,5g Actidione…………..0,5g

Dissoudre l’actidione dans 10ml d’acétone. Homogénéiser dans le Sabouraud encore

liquide.
Actidione et le chloramphénicol: Thermostables
 Milieux d’isolement
Milieu Sabouraud-Chloramphénicol (SC): ++++Chloramphénicol inhibe:
la X° des bactéries à Csse plus rapide  empêcher la croissance des
champignons
Milieu Sabouraud-Chloramphénicol-Actidione (SAC):++++
Cycloheximide (Actidione) inhibe:
St Csse Nbreux contaminants (moisissures) pouvant masquer la présence
d’1 champignon (dermatophyte)
Csse de certaines levures pathogènes (Cryptococcus, C.glabrata,
C.parapsilosis, C.tropicalis et C.famata)

SC et SAC = 1/2 d’isolement (+) utilisés NB: Sensibilité à

l’actidione→critère
Milieu de Dixon (isolement de Malassezia furfur) : d’identification
Malt extract agar (Oxoid)……………………………..50g
Bile de bœuf desséchée (Oxoid)…………………..20g
Tween 40……………………………………………………..10ml
Eau distillée………………………………………………...1000ml
pH: 6,2
Pour une primoculture, il est conseille d’ajouter : chloramphenicol…………1g
Modes d’ensemencement des produits pathologiques
Produit Pathologique Technique
Piquer à la surface de gélose sans les "enfoncer" dans la gélose
Squames-Poils-
→ Déposer en 4 ou 5 points espacés afin d'obtenir des
Ongles
colonies distinctes
Incuber le sang dans du sabouraud liquide citraté à 37° C pdt
Hémocultures
24h→ Repiquer sur Sabouraud gélosé
Autres liquides
Ensemencer en stries à l'öse selon les techniques
biologiques
bactériologiques ou en nappe à la pipette
(Centrifugation)
Avant d'ensemencer les ½, broyer les prélèvements avec un peu
Biopsies de sable stérile de Fontainebleau ou dans un mortier
stérile→ fragments biopsiques déposés sur la gélose
Pour chaque prélèvement:
Ensemencer plusieurs tubes (SC et SAC) devant bec à bunsen:
2 tubes pour chaque ½ et les placer à des T° variables

En pratique au moins 2 tubes: 1 SC et 1 SAC

 Incubation
20-25° 30° 37°
Peau et phanères 1 SC 1 SC
Muqueuses 1 SAC 1 SAC
Prélèvements
profonds 1 SC
1 SAC
Liquides stériles
Délais de culture (durée d’incubation) f(champignon ) :
Levures: Devpt en 24-48h (>5j, 3-4 semaines: Cryptocoque,
plvt profond)
Moisissures ( Aspergillus, Penicillium, Mucor): en 2-4 (5) jours

Dermatophytes et la plupart des autres champignons pathogènes:

en 6-15jours (3 semaines-30j)
Cultures examinées 2 fois/semaine: Aspects macroscopiques
caractéristiques sont transitoires
 Milieux de culture
en mycologie

Milieux Milieux
d’isolement: d’identification:
SC et SAC Fonction du Dg

Champignons Champignons
Levuriformes Filamenteux
 Milieux d’identification
Pour la plupart des champignons filamenteux:
les milieux d’isolement sont des milieux
d’identification
Pour les levures  il faut des milieux
d’identification
 Milieux d’identification
Souche stréile sur ½ Sabouraud

Sporulation
(conidiogenèse, fructification)

Production de pigment

Identification d’une levure (culture levuriforme)

ou d’un champigon filamenteux
 Identification du champignon en
cause (genre et espèce) utile pour:

Sélectionner et adapter au mieux la thérapeutique

Déterminer source de contamination
Mieux comprendre l’épidémiologie de l’agent en
cause
Agir sur les facteurs favorisants
MILIEUX D’IDENTIFICATION
CHAMPIGNONS FILAMENTEUX
Milieu au LACTRIMEL (milieu de Borelli) :
Miel……………………………………07g
Farine de blé………………………14g
Lait écrème en poudre……….14g
Agar……………………………………20g
Chloramphénicol ……………….0,5g
Actidione …………………………..0,5g
Eau distillée………………………..1000ml T.rubrum M.canis
pH : 6,2
Autoclaver pendant 10mn a 105°C
Plus utilisé: Utilisé en premiere intention : Dermatophytes

Favorise:
Sporulation
Production de pigment:
•Rouge vineux (Rouge ou
violet) (T.rubrum)
•Jaune-orangé ( M.canis) T.rubrum M.canis
Milieu peptoné à 3% (Sabouraud conservation) :

Peptone…………………….30g
Agar………………………….20g
Eau distillée………………1000ml
pH : 6,5
Autoclaver 15mn à 120°C

Nécessaire M.persicolor de T.mentagrophytes

Colonie prend une couleur rose-lilas en 8 j blanc-crème

M.persicolor T.mentagrophytes
Brain-Heart Infusion Agar:
Brain-Heart Infusion (bioMerieux)……….37g
Agar …………………………………………………….20g
chloramphénicol………………………………….0,5g
Eau distillée ………………………………..qsp 1000ml
pH : 7,4
Ce milieu riche favorise, tout comme les géloses au sang, la Csse de
T.verrucosum → Incubation à 32°C est toutefois préférable pour cette
espèce
T.violaceum et T. schoenleinii
Milieu de Takashio (Sabouraud dilué) :
Glucose …………………………………………..02g
Néopeptone ……………………………………01g
MgSo4 ……………………………………………..01g
KH2PO4 …………………………………………...01g
Agar ……………………………………………….20g
Eau distillée ……………………………..qsp 1000ml
pH : 6,2
Favorise la sporulation.
Excellent milieu pour obtenir forme sexuée du complexe T.mentagrophytes
Milieu PDA (Potato-Dextrose-Agar) :
Difco TM Potato-dextrose-agar 39g
Eau distillée qsp 1000ml Autoclaver 15mn à 121°C
pH : 5,6

Stimule la sporulation et la pigmentation de nombreux dermatophytes:

(T.rubrum, M.canis, M.audouinii,…)

Milieu de Baxter (milieu au Lab-Lemco) :

Lab-Lemco (Oxoid) 2,5g
Glucose 5g Autoclaver 10mn à 120°C
Agar 20g
Eau distillée qsp 1000ml

Favorise la sporulation et la pigmentation pour la plupart

des dermatophytes
Milieu au bromocresol pourpre (BCP):
Solution A
Lait écrémé en poudre 80g
Solution alcoolique a 1,6% de BCP 2ml
Eau distillée qsp 1000ml
Solution B
Glucose 40g
Agar 30g
Eau distillée qsp 1000ml
Autoclaver les 2 préparations séparément :
A 115°C pdt 8mn pour la solution A
A 121°C pdt 15mn pour la solution B.
Refroidir à 45°C avant de mélanger les 2 préparations.
Homogénéiser, puis répartir en tubes stériles
pH final est d’environ 6,6
Couleur de milieu initialement est grise
Différencier T.rubrum, T.mentagrophytes et M.persicolor:
Reste gris bleu : M.persicolor et T.rubrum
Vire au bleu violacé :T.mentagrophytes var interdigitale
Milieu DTM (Dermatophyte Test Medium) de Taplin:

Phytone 10g
Glucose 10g
Agar 20g
Eau distillée qsp1000ml

•Porter à ébullition et ajouter 40ml de solution de rouge phénol:

(0,5g de rouge phénol-15ml NaOH 0,1N-eau distillée 85ml)

HCl 0,8N 6ml

Cycloheximide 0,5g Autoclaver 15mn à120°C

Chloramphénicol 0,5g
pH :5,5

Tous les dermatophytes font virer au rouge violacé le milieu de Taplin

(mais également de nombreux moisissures)
Milieu au Malt : Fructification T. rubrum
Extrait de malt…………………….20g
Glucose……………………………….20g
Peptone……………………………...01g Eau gélosée à 2% :
Agar……………………………………20g Agar……………………………20g
Eau distillée………………….......1000ml Eau distillée………………..1000ml
pH :5,8 pH : 6,3

Eau gélosée à 2% et gélose au malt:

Favorisent la sporulation de Nbreux moisissures
Corn meal agar :
Corn meal agar ………….17g
Agar………………..7g
Eau distillée………….1000ml
pH: 6
Milieu à l’extrait de malt (sur milieu maltosé) ou au corn-
meal agar→ favorise la production de capsule
polysaccharidique de C.neoformans si elle est réduite
Milieu de Czapek (identification des Aspergillus et Penicillium):
Saccharose………………………………………………................30g
Nitrate de sodium (NaNO3)………………………………………3g
Phosphate dipotassique(K2PO4)……………………………….1g
Chlorure de potassium(KCl)……………………………………..0,5g
Sulfate de magnésium(MgSO4, 7H2O)……………………..0,5g
Sulfate de fer (FeSO4, 7H2O)……………………………………..0,01g
Agar………………………………………………………………………..20g
Eau distillée…………………………………………………………….1000ml
pH : 7,3
 Milieu urée-indole ou gélose à l’urée de Christensen:
Contient un indicateur de pH:
Décomposition de l’urée  Alcalinisation du milieu  Virage
Technique consiste à ensemencer un fragment de la culture dans un
tube :
D’urée-indole (Bio-Rad): en milieu liquide
(bouillon urée-indole)
ou
D’urée de Christensen

Test est positif si le milieu de culture vire au rose fuchsia en 2 jours

pour le milieu urée-indole, en 6 -7jours pour le milieu de Christensen.
Incubation à 27°C
Recherche de l’uréase, différencie entre:
T.rubrum : uréase négatif (exceptées les souches africaines ou
asiatiques)
T.mentagrophytes var interdigitale: uréase positif
Milieu à l’urée de Christensen (pour recherche de l’uréase) :
Solution A
Peptone trypsique 1g
Glucose 1g
Dihydrogénophosphate 2g
de potassium
Chlorure de sodium 5g
Rouge de phénol 0,012g
Urée 20g
Eau distillée qsp100ml
Milieu de base
Agar 15g
Eau distillée qsp 900ml
Préparer la solution A et la stériliser par filtration.
Préparer le milieu de base en solubilisant l’agar par chauffage à ébullition.
Ajuster le pH à 6,8-7.
Répartir en tubes a vis a raison de 9ml/tube. Autoclaver 15mn à 121°C
Au moment de l’emploi: Incorporer 1ml de la solution A dans le milieu de base
Homogénéiser et incliner les tubes
 Milieux vitaminés:

Pour un isolement plus facile:

T.verrucosum:
Milieu de base (gélose de Sabouraud par exemple)
+
Mélange de vitamines ( thiamine, biotine, nicotinamide, inositol)

En pratique: Extrait de levures (yeast extract) à [ ] de 1 à 5g/l.

MILIEUX D’IDENTIFICATION
CHAMPIGNONS LEVURIFORME
Pommes de terre-Carotte-Bile (PCB) :
Pulpe de pommes de terre……………………20g
Pulpe de carottes………………………………….20g
Agar……………………………………………………..20g
Eau distillée………………………………………….1000ml
Bile fraiche filtrée………………………………...200ml

Laisser macérer les pulpes 1 heure.

Bouillir 5mn. Filtrer sur coton.
Ajouter la gélose et stériliser 20mn à 120°.
Refroidir à 45° et ajouter la bile filtrée stérilement

Milieu favorable pour l’obtention de:

Chlamydospores de Candida albicans
(Chlamydospores terminales)
 Crème de Riz-Agar-Tween (RAT):
Crème de riz……………………………10g
Tween 80………………………………..10ml
Agar………………………………………..14g
Eau distillée…………………………….1000ml
pH : 6,5
Mélanger eau et crème de riz.
Bouillir 30 secondes. Reposer 30 secondes. Filtrer sur coton.
Ajouter agar et tween.
Homogénéiser en chauffant jusqu'à émission de vapeur.
Mettre en tubes et stériliser 20mn à 120°

Rice Cream : Milieu à base de crème de riz

Formation des chlamydospores de Candida albicans

Production du pigment de T. rubrum
Recherche de la chlamydosporulation
Au microscope: Chlamydospores terminales de C.albicans:
Grosses spores terminales de résistance
rondes ou ovales, ≈ 6 à 12 µ de Ө à paroi épaisse, à double contour
Sabouraud-tétrazolium (milieu de Pagano-Levin et Trejo): Milieu
de TTC (chlorure des triphényl tetrazolium) (Milieu de CTT )

Sabouraud-chloramphénicol……………………………………..1000ml

Solution acqueuse stérile…………………………………………..10ml

à 1% de chlorydrate de
2,3,5 triphényl-tétrazolium

Solution aqueuse stérile à 1%.....................................100ml

d’extrait de levures

Recherche de la réductase
C.albicans  Blanc crème→ Rx négative
C.tropicalis  Rouge foncé à violet (Rouge violet)→ Rx positive
Guizzotia abyssinica (Milieu de Graines de Niger pour isolement de C.
neoformans) ou milieu de Shields-Ajello :
Graines de Niger broyées………………………………………70g
Eau distillée………………………………………………………….350ml
Autoclaver. Filtrer sur gaze. A 200ml de cet extrait, ajouter :
Eau distillée………………………………………………………....800ml
Glucose………………………………………………………………..10g
Agar……………………………………………………………………..20g
Créatinine…………………………………………………………….0,78g (facultative)
Chloramphénicol………………………………………………….0,5g
Autoclaver, refroidir. Ajouter :
Diphényle…………………………………….0,1g
dissous dans éthanol à 95°………..10ml

Favorise la pigmentation des colonies (brun foncé à noir)

(Recherche de la Phénoloxydase)
Milieu à l’Acétate de Sodium (MAS pour l’obtention des ascospores
de Saccharomyces cerevisiae) :
Acétate de sodium……………………………10g
Glucose…………………………………………….1g
Extrait de levures……………………………..2,5g
Agar…………………………………………………20g
Eau distillée…………………………………….1000ml
pH : 6,2
Milieu au V8 (pour reproduction sexuée des levures) :
Boite de V8………………………………………1 boite
Eau distillée…………………………………….même volume
Extrait de levures……………………………1%
Agar……………………………………………….20g
pH :7
Milieu de Gorodkowa (pour reproduction sexuée des levures) :
Glucose………………………………………….1g
Peptone………………………………………….10g
Chlorure de sodium………………………..5g
Agar……………………………………………….20g
Eau distillée…………………………………..1000ml
Milieux pour auxanogramme du carbone : Lodder
modifié (utilisation de sucres)

Assimilation des sucres :

Gélose lavée………………………………………………………..20g
Sulfate d’ammonium…………………………………………….2g
Phosphate mono potassique……………………………….1,5g
Sulfate de magnésium……………………………………..0,25g
Biotine……………………………………………………………….10-8g
Thiamine…………………………………………………………..10-6g
Pyridoxine…………………………………………………………10-6g
Ac. Nicotinique………………………………………………….10-6g
Pantothénate de Ca ………………………………………….10-6g
Insitol………………………………………………………………..10-5g
Oligo-éléments (solution de Berthelot)…………X gouttes
Eau bi distillée………………………………………………….1000ml
Sucres purs à étudier : glucose, galactose, maltose, saccharose,
lactose, raffinose
 Préparation de disques imprégnés de sucre :
Préparer la solution :
Sucre a tester………………………3g
Eau distillée…………………………100ml
Stériliser par filtration
Tremper les disques stériles dans la solution. Laisser imprégner. Sécher à
l’étuve à 37°

Déposer sur la surface de milieu (gélose) + inoculum→ un disque

imprégné d’un sucre (glucose, saccharose, maltose, galactose, raffinose,
lactose)
Lecture : 24 - 48 h à 30 - 37°C
Lorsque le sucre est utilisé, il se forme une zone de croissance autour
du disque
 il est facile alors de noter les éléments carbonés utilisés
 Milieu pour fermentation rapide des sucres
(Zymogramme)
Technique utilise une gélose + inoculum + glucide à étudier (source de
carbone) en absence d'oxygène.

Permet d’observer en 24 – 48 h les caractères fermentaires des

levures par formation de bulles de gaz à l’intérieur de la gélose + virage
au rouge de l’indicateur pH

Incubation 30 à 37°C

Lecture : Fermentation du sucre se traduit par :

Formation de bulles de gaz à l’intérieur de la gélose

Virage au rouge de l’indicateur pH

Gde majorité de ces tests biochimiques, repose :

Etude de l’assimilation (utilisation) des sucre

(source de Carbone) en aérobiose (auxanogramme)
Pour certains de la fermentation de sucres
(zymogramme)
↓
De Nbreux dispositifs miniaturisés et standardisés
sont commercialisés tels que les galeries Api® 20C
Aux ou ID® 32C commercialisés par bio Mérieux
 Actuellement des galeries colorométriques
sont commercialisées
Auxacolor : Auxanogramme colorimétrique:
 Repose sur l’assimilation des sucres
 Plus utilisé
 Identification des principales levures d’intérêt médical
 Levure placée en aérobiose en présence d’un panel +/-
large de sucres
 Sucres déjà distribuées S/F lyophilisée au fond des cupules
de la galerie.
 Lorsque la levure assimile le sucre

Croissance de levures est visualisée par virage d’1 indicateur

pH (bromocrésol pourpre)
 Actuellement des galeries colorométriques
sont commercialisées
Selon les dispositifs commerciaux, des levures peuvent être identifiées:
Espèces genre Candida (10-63 espèces peuvent être identifiées)
Mais aussi Cryptococcus, Trichosporon, Rhodotorula, Saccharomyces et
Geotrichum

Auxacolor®2 (Bio-Rad) :
15 tests colorimétriques dont 13 reposent sur l’assimilation de sucres
2 dernières cupules permettent la recherche des activités enzymatiques:
 Hexosaminidase (HEX)
Phénol oxydase (POX)/Proline arylamidase (PRO)

La galerie « Auxacolor »
Auxacolor®2 (Bio-
Rad): 16 cupules:
C Neg, assimilation
de 13 sucres, 2
enzymes ( HEX et
POX/PRO)

Espèces genre
Candida
Cryptococcus,
Trichosporon,
Rhodotorula ou
Saccharomyces
Geotrichum

Interprétation:
Après traduction du profil d’assimilation en un code numérique:
Identification de l’espèce est assurée par comparaison à des bases de
données
 Zymogramme:
Etude de l’assimilation des sucres en anaérobiose
(réalisée en recouvrant les cupules d’huile de paraffine)
Assimilation par la voie fermentative
↓
Virage de l’indicateur de pH en raison de production de
métabolites acides.
Discrimination entre C.albicans et C.dubliniensis, 2 espèces
très voisines :

Sur les galeries d’identification→ Pas toujours aisée

Caractères physiologiques peuvent être identiques (pr 2
espèces voisines dans certaines galeries)

Important: caractères macroscopiques et

microscopiques → Identification des levures

Exp: Nbreuses chlamydospores (C.dubliniensis)

Milieux fluorogéniques pour isolement et
identification des levures :
½ Fluoroplate® Candida (Merck): Après 24 à 48 h
d’incubation
↓
Détection et l’identification directe de C.albicans:
Examen des boîtes S/ lumière ultra-violette à
366 nm

Fluorescence bleutée des colonies

Milieux chromogènes (Milieux chromogéniques,
Géloses chromogéniques):
Contenant des substrats chromogènes qui révèlent des activités
enzymatiques propres à certaines espèces  Coloration particulière
f(espèce).
Coloration particulière f (espèce).
Hydrolyse
Substrat chromogénique Coloration spécifique
Enzyme spécifique

Exemple :
N-acétyl-β-D-
galactosaminidase
↓
C.albicans
 Milieux chromogènes (Milieux chromogéniques,
Géloses chromogéniques)
Particulièrement indiqués: Dg des candidoses
Plus onéreux que les milieux standards
Gain du temps (24 à 48 heures)
Facilite la détection des associations de levures
Identifier directement C.albicans (Identification du cplexe C. albicans/
C.dubliniensis): :
Colonies en bleu (Candida ID®2, bioMérieux)
Colonies en vert (CHROMagar® Candida, Becton-Dickinson)
Pas ≠ ciation entre colonies de C. dubliniensis et C.albicans (très
voisines) → Identification du cplexe C. albicans/ C.dubliniensis
Identification présomptive des espèces non albicans  Tests
complémentaires pour identification précise
Exp : isolement sur milieu chromogène CandiSelectTM4
C.albicans→ colonies rose violet
C.tropicalis→ colonies bleu (turquoise)

½ chromogénique (Candichrom II) :

C.albicans et C.dubliniensis  Colonies

bleues
Autres espèces  Colonies restent
incolores
ChromagarCandida

Avantage des milieux

spéciaux/aux milieux
conventionnels (5-6j)
Identification est rendu très
rapide pour Candida albicans→
24h-48h
Suspicion de C.tropicalis,
C.krusei et C.glabrata (résistantes
au fluconazole)  identification
(galeries )→ 48 h à 72 h
Détection facile de cultures
mixtes
 Autres milieux
Levures lipodépendantes (Malassezia) :
½ de Dixon, ½ de Leeming
½ de Sabouraud additionné d'huile d'olive (recouvert avant
l’ensemencement d’une fine couche d’huile d’olive)
M.pachydermatis (non lipodépendante): pousse sur½ Sabouraud usuel

Milieu de Leeming (pour isoler et st tester sensibilité de M.furfur

aux antifongiques) :
Peptone……………………………………….10g
Glucose………………………………………..5g
Extrait de levures…………………………0,1g Permet d’isoler
Bile de bœuf, desséchée……………..8g facilement M.furfur
Glycérol………………………………………1g Utilisé pour l’étude in
Monostearate de glycerol…………..0,5g vitro de la sensibilité de la
Tween 60…………………………………...0,5mg
Lait de vache (entier)…………………10ml
levure aux antifongiques
Agar……………………………………………12g
Eau distillée……………………………….1000ml
 Cryptococcus:
½ de Sabouraud standard sans cycloheximide (Actidione®)
Gélose à l’inositol→ Prélèvements polymicrobiens (Assimile l’inositol)
Rechercher de l’uréase sur milieu urée-indole :
Positive en 3 heures est déterminant à 37°C (en moins de 4h).

Recherche de la phénoloxydase :
Milieu de Guizzottia abyssinica (à base graines de niger) , en 2 à 3
jours, à 27°C:
Levure se colore en brun foncé à noir  Pigmentation des
colonies.
Cette couleur brune est due à la phénoloxydase
Ce caractère fait partie des galeries Auxacolor® et Fungichrom® et
se recherche en même temps que l’assimilation des sucres.

Milieux enrichis au sang :

Obtention des formes parasitaires des champignons dimorphiques
Hémocultures : (mycoses invasives)
Recommandé :

Bactec®IC/F Mycosis, Becton-Dickinson): lecture automatisée

Mesure du Co2 produit au cours de la croissance de champignon

Bact/ALERT® (bioMérieux): automatisé, même ½ de culture pour :

Détection des bactéries et des champignons.
Détection de la croissance fongique repose sur une méthode
colorimétrique (Bact/ALERT®) ou fluorimétrique (Bactec®).

Flacons devront être maintenus dans l’appareil au minimum 2 semaines

A défaut de méthodes automatisées:

Hémocultures pour bactériologie peuvent êtres utilisées (pour levures)

En particulier les flacons destinés aux bactéries aérobies
(C.glabrata : incapable de se multiplier en anaérobiose)
Hémocultures (Suite):
Système Isolator® (Lyse-centrifugation):

Libération des levures intracellulaires (Lyse de ç sanguines)

Concentration par centrifugation, et l’ensemencement du culot sur ½
de mycologie
Permettrait de raccourcir le délai de culture.
Intéressant : Recherche de formes « levures » d’Histoplasma capsulatum
var capsulatum

Ces ½ pour hémocultures :

Pas identification directe des levures.

En cas de positivité Réaliser un repiquage sur:

½ standard ou mieux ½ chromogénique

 Milieux pour antifongigrammes
Milieu synthétique (pour la 5 fluorocytosine) :
Yeast nitrogen base………………….6,7g
Glucose……………………………………5g
Agar………………………………………..22g
Eau distillée…………………………….1000ml
pH: 6,2
Milieu casitone (pour imidazolés
et polyènes) :
Casitone…………………………………………...9g
Extrait de levures………………………………5g
Citrate de sodium trisodique…………….10g
Phosphate disodique…………………………1g
Phosphate monosodique…………………….1g
Glucose……………………………………………..10g
Agar…………………………………………………..22g
Eau distillée……………………………………….1000ml
pH : 6,6
Détermination de la sensibilité aux
antifongiques «antifongiramme» :
Parallèlement à l’identification, la
détermination de la sensibilité aux
ATF :
Levure isolée d’une hémoculture
ou d’un site profond
Levure isolée d’un site superficiel,
en cas de récidive ou d’échec TRT
Enfin ID ou soumis à une forte
pression de sélection liée à une
prophylaxie (risque de résistance
secondaire) ou à un TRT ATF en cours
(azolés)
 Détermination de la sensibilité aux
antifongiques (ATF) «antifongiramme»:

Actuellement tests colorimétriques sont

commercialisés:
FUNGITEST® (BIO-RAD):
Appréciation de la croissance repose sur la
réduction de l'indicateur coloré qui entraîne un virage
du milieu du bleu au rose.
Lorsque la croissance est inhibée par l'antifongique,
le milieu reste bleu.
 FUNGITEST® (BIO-RAD)
Appréciation de la croissance repose sur la réduction de l'indicateur
coloré qui entraîne un virage du milieu du bleu au rose.
Lorsque la croissance est inhibée par l'antifongique, le milieu reste
bleu.

(T de croissance)
 Lecture et interprétation des résultats
N'effectuer la lecture que si les cupules Témoins de croissance (T+) sont roses.
Observer l'éventuel virage de couleur dans les cupules contenant les ATF par
rapport aux cupules témoin négatif (bleu).
Interpréter en fonction de la couleur des 2 cupules pour chaque
ATF :
Bleu-Bleu = absence de croissance : souche inhibée par l‘ATF
in vitro
Rose-Bleu = faible croissance : souche intermédiaire
Rose-Rose = croissance : souche non inhibée par l'antifongique in vitro.
 Antifongigramme: Aspergillose
exploration de l’activité direct sur le champignon

• Test en milieu gélosé=

• E-test/bandelettes imprégné
d’ATF
• Test la sensibilité à l’AmphoB
Itraconazole, Voriconazole ,
caspofungine
• Détermination de la CMI.
• Inconvénients:
1. Interprétation délicate
2. Difficulté de corrélation entre
CMI et efficacité clinique en
raison des facteurs liés à l’hôte.
Milieux de conservation
Milieux pauvres en éléments nutritifs
Assurent uniquement la survie de
champigonons
Ralentissent ou empêchent le
pléiomorphisme
Milieu peptoné à 3% (Sabouraud conservation) :
Pas de sucres
Milieu de Takashio (Sabouraud dilué)