Chapitre 3 : Les milieux de cultures en

mycologie médicale

-De très nombreux milieux sont utilisables pour la culture des champignons, certains
sont très spécifiques d'un groupe d'espèces, d'autres permettent la culture de très
nombreuses espèces.

-L'aspect cultural des moisissures peut considérablement changer d'un milieu à

l'autre.

3.1. Les milieux d’isolement

- A l’exception du sang, tous les produits pathologiques sont ensemencés sur des
milieux gélosés dont le choix dépend de l’origine du prélèvement. Les milieux les
plus largement utilisés en mycologie médicale restent les géloses de Sabouraud
additionnée d’ATB (chloramphénicol, gentamycine, ou association des deux)

- Pour les prélèvements de peau et phanères, le milieu Sabouraud est additionné de

cycloheximide (Actidione), antibiotique antifongique qui inhibe la croissance de
nombreuses moisissures indésirables, mais qui est sans effet sur les dermatophytes

- Des milieux flurogéniques ou chromogéniques (mettant en évidence la N-Acétyl-

galactosaminidase de C. albicans ) ont été développés récemment pour dépister des
associations de levures ou d’identifier certaines espèces

Par ailleurs, on a recours dans certains cas à des milieux plus spécifiques tels que :

- milieu gélosé au malt : certains champignons filamenteux

-milieu gélosé à l’inositol : milieu semi sélectif pour l’isolement des cryptocoques

- gélose au sang qui facilite l’isolement de certains champignons dimorphiques ex :

histoplames

- Enfin, en cas de suspicion de septicémie d’origine fongique, des hémocultures sont

réalisées sur milieu diphasique Hémoline TM Performance (bioMérieux)

Tous ces milieux peuvent être conditionnés en boite pour les levures et en tubes
pour les autres champignons, tout particulièrement les dermatophytes de culture
lente. Les tubes limitent la déshydratation.

La température de culture est fixée avec intelligence :

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 les prélèvements cutanés ou de phanères sont incubés à 30°C, température
proche des lieux de prélèvements. Les dermatophytes ne cultivent pas, en
général, à 37°C…
 les prélèvements internes peuvent être incubés à 37°C puisque le champignon
s'est développé à cette température. Les Aspergillus en particulier cultivent
souvent très bien à 37°C…

La durée de culture est très variable :

* Les champignons des mycoses superficielles se développent à 27°C.

Les champignons des mycoses profondes cultivent à 27°C, mais cultivent également
à 37°C.

* Les champignons saprophytes cultivent à 30°C, mais pas à 37°C (ou très
lentement).

* Délai de culture :

Levures: 24 à 48 heures.
Moisissures: 2 à 4 jours.
Dermatophytes: 6 à 15 jours.

Principaux
Milieux Intérêts
constituants
MILIEU Milieu de Sabouraud peptone -étude morphologique
D'ENRICHISSEM (liquide) glucose des levures
ENT -contrôles de stérilité…
Gélose Sabouraud peptone -isolement des
glucose champignons pathogènes
pH = 5-5,6 agar à partir de produits non
MILIEU souillés par des bactéries
D'ISOLEMENT ou champignons
NON SÉLECTIF saprophytes
-contrôles de stérilité
(produits pharmaceutique
s)
GéloseSabouraud -Sabouraud Inhibition de la plupart
+chloramphénicol(C -CMP :antibiotique à des contaminants
MP) largespectre bactériens
Gélose Sabouraud -Sabouraud inhibition des bacilles à
MILIEUX
+ gentamicine - Gram négatif résistants
D'ISOLEMENT
gentamicine : inhibition au CMP
SÉLECTIFS
des bacilles à Gram
négatif résistants au
CMP

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 Gélose Sabouraud -Sabouraud Isolement sélectif des
+ cycloheximide -cycloheximide : inhibe dermatophytes (et
(=actidione) les champignons autreschampignons
saprophytes pathogènes)
Gélose Sabouraud cf ci-dessus Isolement sélectif des
+ chloramphénicol levures et
+ gentamicine autreschampignons
Gélose Sabouraud cf ci-dessus Isolement sélectif des
+ cycloheximide dermatophytes et
+ chloramphénicol autreschampignons
résistants au
cycloheximide
Milieu Peptone Tous les dermatophytes
DTM(Dermatophyte Glucose font virer
Test Medium) de Cycloheximide au rouge violacé le milieu
Taplin Chloramphénicol de Taplin (mais aussi
Rouge de phénol d’autres moisissures)
Agar
chromID Candida/S substrat chromogène Isolement des levures et
GC d'hexosaminidase/genta identification
Document 2 mici-ne et de Candidaalbicans/isole
chloramphénicol ment des levures et
moisissures
PCB Pomme de terre Milieu pauvre pour
(Pomme de terre, Carotte la miseen évidence de :
Carotte, Bile) Bile (agent tensio-actif : -pseudomycélium
favorise la formation de -blastospores
pseudo-mycélium) -chlamydospores
(identification
de Candidaalbicans)
RAT Riz Idem PCB
(Riz, Agar, Tween (agent tensio-
Tween) actif)
Agar
MILIEUX Milieu pour blastèse Identification
D'IDENTIFICATI de Candidaalbicans
ON Milieu PDA Pomme de terre Culture et numération des
(Pomme dextrose levures et moisissures
de terre,Dextrose, Agar
Agar)
Milieu de Czapek saccharose Identification
sels des Aspergillus
agar
Milieu peptoné à 3% Différencier M.
(Sabouraud persicolor (colonies rose-
conservation) lilas) de T.
mentagrophytes (colonies
blanc-crème)

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3.2. Composition de quelques milieux de culture

Nous donnons la composition de quelques milieux parmi les plus fréquemment

utilisés pour l'étude des champignons.

Les quantités sont exprimées pour un litre de milieu (eau distillée q.s.p. 1 litre).
La stérilisation s'effectue à 121° C pendant 20 minutes, sauf indication contraire.
La plupart des milieux suivants sont solidifiés par addition de 1.5 % d'agar, mais ils
peuvent être utilisés liquides (sans agar).

 Milieux à base de malt

* Malt

 Malt 10 g
 Agar 15 g

* MYA : Milieu glucosé aux extraits de malt et de levures (CBS)

 extrait de malt 10 g
 extrait de levures 4,0 g
 glucose 4,0 g
 agar 15,0 g
 Ajuster le pH à 7,3.

* M2 (ou M2YA) : Milieu aux extraits de malt et de levures

 extrait de malt 20,0 g

 extrait de levures 2,0 g
 agar 15,0 g

Ce milieu convient à un très grand nombre d'espèces. On peut faire varier la

concentration en extrait de malt et y ajouter des fragments de carotte, pomme de
terre,orange, ...
Il peut également être additionné d'antibiotiques : pénicilline 50 unités/ml,
streptomycine 100 unités/ml (les antibiotiques sont filtrés sur filtre 0,2 µm et
ajoutés après autoclavage).

* M2S5 : Milieu salé aux extraits de malt et de levures

 extrait de malt : 20,0 g

 extrait de levures : 2,0 g
 Na Cl : 50,0 g
 agar : 15,0 g

Milieu utilisé pour la culture des espèces osmophiles.

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  Milieux synthétiques ou semi synthétiques

* CZ : Milieu de Czapek

 NaNO3 : 3,0 g
 MgSO4 7H2O : 0,5 g
 KCl : 0,5 g
 FeSO4 7H2O 0,01 g
 K2HPO4 : 1,0 g
 saccharose : 30,0 g
 agar : 15,0 g
 Il est conseillé de compléter ce milieu par 1 ml d'une solution de
ZnSO4 7H2O 1,0 g, CuSO4 5H2O 0,5 g dans 100 ml d'eau.

Dans la bibliographie c'est le milieu de référence pour la mise en culture

des Aspergillus.
Ce milieu peut être complété à 400 g.l-1 de saccharose pour l'isolement et la culture
des champignons osmophiles (Eurotium sp., Wallemia sebi,... )

* CYA : Czapek + extrait de levures

 Milieu CZ : 1 litre
 extrait de levures : 5,0 g

* G25 N : Glycérol nitrate agar

 sels minéraux du CZ q.s.p. : 750 ml

 extrait de levures : 3,7 g
 glycérol, pour analyses : 250,0 g
 agar : 15,0 g

Ce milieu est utilisé pour la détermination des Penicillium.

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 Chapitre 4 : Identification des champignons
d’intérêt médical

Principales espèces responsables d’infections fongiques Candida (C. albicans, C.

glabrata, C.tropicalis, C.parapsilosis, C. krusei… ) Cryptococcus (C. neoformans )
Aspergillus (A. fumigatus, A. flavus, A. nidulans, A. terreus…) Autres champignons
filamenteux responsables de mycoses invasives de l’immunodéprimés
Mucorales=Zygomycètes (Absidia, Mucor, Rhizopus, Rhizomucor…) Fusarium spp.
Scedosporium spp. Dermatophytes (Trichophyton, Microsporum )

L’identification est essentiellement basée sur :

 Les critères macroscopiques

 Les critères microscopiques
 Les critères physiologiques, moléculaires, …..

Travail personnel donné aux étudiants

sous forme d’exposés car ce chapitre a déjà

été abordé dans la module « Mycologie

fondamentale »

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 ANNEXES

2
3 7
4
6
5

1- Ecouvillon 4- Curette 7- Lampe de Wood

2- Vaccinostyle 5- Ciseaux 8- Pince coupante
3- Pince 6- Boite de Pétri

- Lampe de Wood : Certains dermatophytes qui infectent les cheveux produisent un

métabolite (Ptéridine). Une fluorescence verte jaune apparait lorsqu’on fait une
observtation à la lampe de Wood (366nm). Utilisée pour la détection de Microsporum
canis et Microsporum audouinii

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- Coloration à l’acide périodique Schiff (PAS) : elle met en évidence l’oxydation de
certains polysaccharides. Elle peut aider au diagnostic des tumeurs et aussi de
détecter des maladies fongiques (mise en évidence les filaments et les spores qui
seront colorés en rouge. Coloration due à la leucofushine de Schiff).

- Coloration May-Grünwald Giemsa : elle repose sur l'action combinée de deux

colorants neutres :
* Le May-Grünwald, contenant un colorant acide, l'éosine, et un colorant basique,
le bleu de méthylène.
* Le Giemsa, contenant lui aussi le colorant acide, l'éosine, et un colorant basique
(qui est métachromatique), l'azur de méthylène
Ces deux colorants sont en solution dans l'alcool méthylique sous forme inactive.
Lors de l'addition d'eau, les sels (éosinate de méthylène et azur de méthylène)
précipitent et se fixent sélectivement sur les constituants cellulaires.

- Les constituants cellulaires acides, fixeront électivement les colorants basiques.

Ces éléments sont qualifiés de basophiles (ADN, cytoplasme
des lymphocytes riche en ARN).
- Les constituants cellulaires basiques, fixeront électivement les colorants acides.
Ces éléments sont qualifiés d'acidophiles ou d'éosinophiles (cas de
l'hémoglobine et des granulations des polynucléaires éosinophiles).
- Les constituants fixant les deux types de colorants sont dits neutrophiles.

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