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Entérobactéries
Révision:11-juil-2023
StandardMéthode

But
Cette méthode vise à détecter les entérobactéries dans les ingrédients et les échantillons
environnementaux. La famille des Enterobacteriaceae comprend les micro-organismes qui
sont des bâtonnets droits anaérobies facultatifs, oxydase-négatifs et Gram-négatifs qui
fermentent le glucose en acide. Ils sont utilisés comme indicateurs d’hygiène dans le
processus de fabrication.

Sécurité
La section de sécurité ne remplace aucune procédure de sécurité indiquée par
votre plan d'hygiène chimique local.

NOTE:Des pratiques de laboratoire sécuritaires doivent être suivies à tout moment.

Familiarisez-vous avec tous les dangers potentiels et portez un équipement de
protection individuelle approprié avant d'utiliser cette méthode.)

Équipement
Incubateur, 35ºC ± 2°C ou 37ºC ± 1°C

Réactifs et matériaux
 Médias
 Diluant
 Filtre à membrane 0,45µm avec grille
 Écouvillons, éponges pour échantillons environnementaux
 Huile minérale stérile

Préparation et stockage des échantillons

Reportez-vous à la préparation des échantillons microbiologiques, SM-PR-640.

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Tableau 1. Méthode, milieux et incubation

Méthod Médias(Voir notes 1, 2 et 3) Incubation
e
 Gélose au glucose
biliaire rouge violet
(VRBGA) ou Agar au
Pour les échantillons filtrables : dextrose biliaire rouge
violet (VRBDA).
 RAPID'Entérobactériacées
Filtration membranaire (SM-PR-625) (BIO-RAD)

35°C ± 2°C
pendant 18-
24 heures
 Gélose au glucose (VRBGA ou
biliaire rouge violet VRBDA)
(VRBGA) ou gélose
Pour les échantillons non dextrose biliaire rouge
filtrables : violet
(VRBDA).
Plaque verseuse (SM-PR-655)  RAPID'Entérobactériacées 37°C ± 1°C
(BIO-RAD) pendant 18-
24 heures
( RAPIDE'
Entérobactéries
Moyen)
 Gélose au glucose
biliaire rouge violet
Pour les échantillons (VRBGA) ou Agar au
environnementaux : dextrose biliaire rouge
violet (VRBDA).
Échantillonnage
 RAPID'Entérobactériacées
environnementalTechni
(BIO-RAD)
que (SM-PR-694)

 Plaques de numération Suivre

Méthodologie 3M™
des entérobactéries 3M™ lainstruction
Petrifilm™(SM-PR-661)
Petrifilm™ du fabricant.

Note 1:Reportez-vous à Préparation et manipulation des supports (SM-PR-641) pour

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préparer les supports et les diluants.

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Note 2:Lors de l’utilisation de la méthode de coulée sur plaque avec VRBG Agar, il est
nécessaire de superposer la plaqueavec 5-8 ml de VRBGA. Le but de la deuxième
couche est de limiter l’envahissement de la surface, qui peut gêner la lecture.

Note 3:Lors de l'utilisation de la méthode sur plaque coulée avec

RAPID'Enterobacteriacea, un recouvrement estrecommandé avec 5 à 8 ml de
gélose au cas où une flore mésophile abondante serait attendue dans la matrice.

Procédure
Reportez-vous à la procédure appropriée dans le tableau 1 (voir ci-dessus) pour
procéder et commencez par diluer les échantillons si nécessaire, en utilisant la dilution
décimale SM-PR-648.
1. Incuber les plaques en position inversée à 35 °C ± 2 °C pendant 18 à 24 heures ou à 37
°C ± 1 °C pendant 18 à 24 heures selon le milieu utilisé.
2. Compter toutes les colonies caractéristiques (voir ci-dessous sous Interprétation)
d'Entérobactéries présentes sur la boîte de Pétri à la fin de la période d'incubation (18-24
heures). Si des dilutions ont été étalées, multiplier le nombre de colonies typiques
d’Enterobacteriaceae par l’inverse de la dilution utilisée.
3. Conserver la ou les plaques au cas où une analyse plus approfondie serait nécessaire.
4. Rapporter les résultats sous forme de nombre d’unités formant colonies (UFC)
d’entérobactéries par taille d’échantillon.

Interprétation

Gélose au glucose Comptez toutes les  Le cristal violet et les sels biliaires
biliaire rouge violet colonies rouge inhibent la flore Gram positif.
(VRBGA) - Voir pourpre, de 0,5 mm
Remarque 4  La dégradation du glucose
de diamètre ou s'accompagne d'une production d'acide
plus, entourées qui entraîne une diminution du pH,
d'un halo violet qui indiquée par un changement de couleur
est une zone vers le violet/rouge et par des zones
d'acides biliaires précipités entourant le
d'acides biliaires
glucose. colonies
précipités.

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Comptez tout le  Le cristal violet et les sels biliaires inhibent la

rougecolonies d'un flore Gram positif.
RAPID'Entérobactéri diamètre égal ou
esacéaMoyen –  La dégradation du glucose permet un haut
supérieur à 0,5
VoirRemarque 5 niveau de contraste des colonies
mm avec ou sans
d'Entérobactéries qui apparaissent en rouge
zone de
sur un milieu gris clair
précipitation.

Suivez le guide  https://multimedia.3m.com/mws/media/156674

d’interprétation du 8O/entérobactéries-compte-plaque-guide-
3M™ fabricant. d'interpretation-en-hr.pdf
Petrifilm™Méthod
ologie - Voir
Remarque 5

Remarque 4 :En cas d'utilisation du milieu VRBG, des tests de confirmation sont nécessaires,
notamment lorsque lela spécification est d'avoir zéro ou aucun organisme détecté. Certaines
Enterobacteriaceae peuvent également provoquer une décoloration de leurs colonies ou du
milieu. Par conséquent, choisissez au hasard cinq colonies rouge pourpre (s'il y a moins de 5
colonies typiques sur la plaque, prenez toutes les colonies présumées présentes) ou
lorsqu'aucune colonie caractéristique n'est présente, choisissez cinq colonies blanchâtres pour
confirmation. Le test d'oxydase et la fermentation du glucose sont les tests biochimiques à
réaliser.

Si vous souhaitez une identification, elle peut être réalisée par PCR, Vitex, API Strips ou autre
méthode d'identification.

Remarque 5 :Il n'est pas nécessaire de procéder à des tests de confirmation en utilisant le
milieu RAPID'Enterobacteriacea et la méthodologie 3M™ Petrifilm™.

Tests de confirmation :(colonies du milieu VRBG)

Test oxydase :

1. Pour garantir que le test d'oxydase est effectué avec des cultures pures, sous-
culturez les colonies présumées d'Enterobacteriaceae sur une gélose non sélective,
par exemple PCA, TSA, NA etincuber à 37 ° C pendant 24 h ± 2 h.
2. Utilisez un test d'oxydase commercial en suivant les instructions du fabricant ou
ajoutez 2 à 3 gouttes de réactif oxydase frais sur un papier filtre dans une boîte de
Pétri. Les colonies quidoit être confirmées sont transférées sur le papier filtre
prétraité à l’aide d’une anse d’inoculation en plastique ou en platine. Une réaction
positive à l'oxydase se manifeste par l'apparition d'une couleur bleu foncé en 30 s.
Ceci ne doit pas être observé pour les bactéries Enterobacteriaceae car elles sont
oxydase négatives.
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Test de fermentation du glucose

1. À l'aide d'un fil, transférez les mêmes colonies sélectionnées qui ont donné un test
d'oxydase négatif dans des tubes contenant du milieu Glucose OF. Superposer la surface
du milieu avec au moins 1 cm d’huile minérale stérile.
2. Incuber ces tubes à 37 °C pendant 24 h ± 2 h.
3. Si une couleur jaune apparaît dans tout le contenu du tube, considérez la réaction comme
positive..
Interprétation des résultats:

Les colonies oxydase-négatives et glucose-positives sont confirmées comme étant des

Enterobacteriaceae.

Les références
Préparation et manipulation des supports SM-PR-641
Dilutions décimales SM-PR-648

Méthode de la SM-PR-
plaque de 655SM-PR-
versementFiltration 625
membranaire

Échantillons de surveillance environnementale SM-PR-694

Méthodologie 3M™Petrifilm™ SM-PR-661
ISO 21528-2 - Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode
horizontale pour ladétection et dénombrement des Enterobacteriaceae —
Partie 2: Technique de comptage des colonies

Recueil de méthodes pour l'examen microbiologique

desAliments, cinquième édition – Chapitre 9

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Historique des révisions

Date de révision Résumé du changement

11-juil-2023  AdditionMilieu RAPID'Enterobacteriacea (Biorads)
 Clarification supplémentaire liée à la superposition dans les médias
 Inclus des échantillons environnementaux dans la portée
 Formaté dans le nouveau modèle
 Méthodologie 3M Petrifilm incluse
 Tests de confirmation inclus (fermentation de l'oxydase et du
glucose) lors de l'utilisation du milieu VRBG

13 décembre Nouveau document.

2013

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