Outils de Génie Génétique-2017

PLATEFORME DE GENOMIQUE FONCTIONNELLE
LABORATOIRE DE BIOTECHNOLOGIES
UNIVERSITE CHEIKH ANTA DIOP VEGETALES
DAKAR, SENEGAL
COURS DE BIOLOGIE MOLECULAIRE

Pour les étudiants de Licence 2 SV
Chapitre II : Les Outils du Génie Génétique
Dr. DIAGA DIOUF

Professeur titulaire
Enzymes de restriction
Enzymes bactériens permettant la résistance aux virus par coupure
de leur matériel génétique
Coupent l’ADN bicaténaire en des sites particuliers généralement
palindromiques appelés site de restriction. Coupent l’ADN au niveau
des ponts phosphodiesters
Permettent le clonage et l’établissement de carte de restriction
Restriction-modification (R-M) systems

restriction endonuclease (REase)
cognate methyltransferase (MTase)
Nomenclature
• 1ére lettre de dénomination de l’enzyme en majuscule - nom du genre de

la bactérie d’où a été extraite l’enzyme.
• 2e lettre et 3e° lettre (en minuscules) - nom de l’espèce de la bactérie d’où
l’enzyme est extraite.
• 4e° lettre écrite en majuscule - nom de la souche bactérienne.
• chiffre romain indique l’ordre de caractérisation de ces enzymes.
EcoR I
Genre: Escherichia Numéro d’ordre
coli
Souche
Pr. DIAGA DIOUF-UCAD- COURS DE BIOLOGIE MOLECULAIRE Pour les étudiants de Licence 2 BCGS - 2015
Les différents types d’enzymes de restriction
Type II Type III Type I
Structure Activités endo Enzyme Bi enzyme bi

nucléase et méthy fonctionelle fonctionnel
lase séparées 2 sous unités le 3
sous unités
Site de 4-6 pb souvent 5-7 pb Bipartite
Reconnaissance palindromique asymétrique asymétrique
Site de coupure même ou près 24-26 pb en aval non spécifi

site de reconnaissance site reconnaissance que, + de
1000 pb du
site recon-
naissance
Restriction/ séparées simultanées mutuelle-

Méthylation ment exclu-
sive
Besoin d’ATP Non Oui Oui

Pour coupure
Seuls les enzymes de types II sont utilisés au laboratoire
Listes de quelques enzymes de restriction
Enzymes Micro-organismes d’origine Sites de coupures Extrémités

produites
BamHI Bacillus amyloliquefaciens GGATCC Adhésives

CCTAGG
EcoRI Escherichia coli GAATTC Adhésives

CTTAAG
HindIII Haemophilus influenzae AAGCTT Adhésives

TTCGAA
KpnI Klebsiella pneumonia GGTACC Adhésives

CCATGG
PstI Providencia stuartii CTGCAG Adhésives

GACGTC
HpaI Haemophilus parainfluenzae GTTAAC Franches

CAATTG
DraII Deinococcus radiophilus GGGNCCC Adhésives

CCCNGGG
XbaI Xanthomonas badrii TCTAGA Adhésives

AGATCT
Lieu de coupure N: nucléotide indéterminé

Types de coupures générées par les enzymes de types II
Site de restriction de HaeIII
Après coupure bouts francs
5’ GGCC GG CC
CCGG CC GG
Site de restriction de BamHI

Après coupure
5’ GGATCC G GATCC
CCTAGG CCTAG G
Extrémités cohésives
5’ débordantes
(extrémités cohésives ou adhésives ou bouts collants)
Site de restriction de Pst1
CTGCAG CTGCA G
5’
GACGTC G ACGTC
Extrémités cohésives
3’ débordantes
HaeIII génère des bouts francs, BamHI et PstI génèrent des bouts collants ou Extrémités
adhésives. BamHI a une extrémité 5’ débordante tandis que PstI a une extrémité 3’
débordante
Action du couple EcoRI/EcoRI méthylase
EcoRI
G AAT T C
G AAT T C
C T TAA G
C T TAA G
EcoRI coupe au niveau de son site de restriction GAATTC
EcoRI CH3
Méthylase
G AAT T C G AAT T C
C T TAA G C T TAA G
CH3
EcoRI méthylase méthyle de site de restriction GAATTC de EcoRI
CH3 EcoRI CH3

G AAT T C G AAT T C
C T TAA G C T TAA G
CH3 CH3
L’activité de EcoRI est bloquée par la modification induite par la

EcoRI méthylase au niveau du site de restriction GAATTC
Utilisation des enzymes de restriction: Cartes de restriction
MseI
BamHI
XhoI
Sites de restriction Plasmide
ApaI
EcoRI
MseI EcoRI BamHI

EcoRI ApaI BamHI XhoI
-
Migration
Utilisation dans
- étude de la diversité génétique des espèces
- recherche de paternité
- police criminelle
Utilisation des enzymes de restriction chez le maïs
P1 P2 F1
Digestion avec EcoRI
Karp, A., Seberg, O. and Buiatti, M. (1996). Molecular techniques in the assessment of Botanical diversity. Annals
of Botany; 78: 143-149.
Les vecteurs
Définition
Ce sont des ADN dans lesquels on insère des petits fragments d’ADN afin de les
étudier. Ils possèdent des signaux de réplication (origine de réplication) mais ils ne
peuvent se répliquer que dans une cellule.
Les différents types de vecteurs
Types de vecteurs Taille maximale de

l’ADN cloné (kb)
Plasmide 10
Bactériophage Lambda 25
Cosmide 45
Bactériophage P1 80-300
Chromosome artificiel P1 (PAC) 80-300
Chromosome artificiel bactérien (BAC) 80-300
Chromosome artificiel de levure (YAC) 100-1000
Plasmides
Petite molécule d'ADN extra-chromosomique généralement circulaire présent chez les
bactéries ou certaines levures. Ils possèdent une origine de réplication (se réplique
indépendamment du chromosome, en utilisant la « machinerie » de sa cellule hôte. Ils
portent un petit nombre de gènes (en particulier des gènes de résistance aux
antibiotiques) qui confèrent à l’organisme des avantages sélectifs et ne portent
habituellement pas de gènes essentiels à la cellule procaryote. Leur pérennité dans une
lignée de bactéries dépend donc de divers moyens de stabilisation.
Les plasmides peuvent aussi se transmettre d'une bactérie à une autre par conjugaison
Les plasmides existent à l'état naturel mais des plasmides recombinants peuvent être
construits au laboratoire pour une utilisation comme vecteurs de clonage de gènes.
plasmide
Topoisomères d’un plasmide
Forme relâchée
Forme surenroulée
Forme relâchée Forme surenroulée
Topoisomère: deux molécule d’ADN ayant même séquence mais ne diffèrent que par le
nombre l’enlacement.
Forme relâchée: tension minimale sur la double hélice
Forme surenroulée: formation de supertour autour de l’axe de la double hélice. Tension
maximale sur la double hélice
Topoisomèrase: enzyme capable de modifier le nombre d’enlacement de l’ADN.
Ex. gyrase
Plasmides recombinants
Exemple pUC19 (plasmid of University Of California)
Composantes importantes
Polylinker ou site de clonage multiple [Multiple Cloning Site (MCS)]: C'est un petit
fragment nucléotidique double brin synthétisé chimiquement, introduit dans un vecteur
(phage ou plasmide) afin d'offrir un choix de sites de restriction uniques, c'est-à-dire tous
différents les uns des autres et n'existant pas ailleurs dans ce vecteur.
Promoteur: Région placée au début d’un gène qui porte les séquences régulatrice de
l’expression du gène pour qu’il soit exprimé. Le promoteur n'est pas "universel" il doit être
adapté à la cellule receveuse en cas de transfert du gène. Dans les plasmides de laboratoire
les promoteurs utilisés sont souvent d'origine virale (CMV, SV40) ou sont ceux trouvés en
amont de gènes fortement et constitutivement exprimés dans l'organisme hôte cible.
Gènes de sélection: Sont le plus souvent des gènes de résistance à des antibiotiques
(ampicilline, puromycine, kanamycine, tétracycline, néomycine, hygromycine). L'expression
de ces gènes permet de sélectionner les cellules contenant un (le plus souvent des)
plasmide(s) et de maintenir la présence du plasmide (pression sélective). L'expression du
gène de sélection est souvent sous la dépendance d'un promoteur fort virale (SV40).
Origine de réplication: Assure la réplication du plasmide dans la cellule hôte. Elle n’est pas
« universelle » et doit être adaptée à la cellule hôte.
Les Phages (ou virus à bactéries)
Bactériophage (ou phage): virus n'infectant que des bactéries. En grec, phageton signifie
nourriture/consommation. On les appelle également virus bactériens.
Les phages sont constitués d'une enveloppe protéique externe (appelée capside)
protégeant le matériel génétique (ADN ou ARN). Pour plus de 95 % des phages connus,
ce matériel est une molécule d'ADN double brin d'une taille de 5 à 650 kpb et leur
longueur varie de 24 et 200 nm.
Les bactériophages sont présents dans l'ensemble de la biosphère. Ils sont présents
partout, mais en quantité plus importante dans les excréments, le sol et les eaux d'égout.
Ils ont joué un rôle important dans la biologie moléculaire et dans le clonage pour insérer
l'ADN dans la bactérie. Le support génomique des bactériophages (aussi appelés phages)
peut être un ADN ou un ARN.
Types d'Infection Phagique
Les phages infectent une seule bactérie spécifique.

Phages virulents: aussitôt après infection ils se multiplient et font exploser la
cellule.
Phages peuvent entrer dans un état assez inoffensif en introduisant leur matériel
génétique dans l'ADN de l'hôte (bactérie) comme un rétrovirus ou comme des
plasmides un phénomène appelé conversion lysogène
Ex.: phage lambda de E. Coli.
Ils apportent de nouvelles fonctions au génome de la bactérie

Ex. l'inoffensive bactérie Vibrio qui, quand elle est transformée par un phage, cause le
choléra
Le bactériophage M13
Bactériophage spécifique d'E. Coli, constitué d'un simple brin d'ADN circulaire, d'une taille
d'environ 6,4 kb, appelé brin (+) par convention. Il possède dix gènes (I à X) et deux petites
régions non codantes «intergéniques ». L'ADN de Ml3 est recouvert de protéines donnant
au phage une forme de bâtonnet, dit "filamenteux".
Après modification on l’utilise pour cloner de petits fragments d'ADN, séquencer des
fragments d’ADN (technique de Sanger), produire des sondes.
Ces deux techniques pouvant être réalisées aujourd'hui sur ADN double brin (après
dénaturation), ces vecteurs sont maintenant abandonnés au profit des vecteurs plasmidiques
et apparentés.
M pour rappeler que c’est à Münich qu’il a été découvert (Hofschneider, 1963).
Le bactériophage λ (lambda)
Description
Bactériophage qui infecte la bactérie Escherichia coli.

 ADN double brin linéaire de 48,5 kb
 Extrémités de cet ADN est nommé cos (séquences complémentaires simple brin qui
peuvent s'apparier et ainsi circulariser le génome)
 Cycle lytique (qui conduit à la mort de la cellule hôte. Ex: E.Coli)
 Cycle lysogène durant lequel il insert son génome dans celui de la bactérie et subit
des réplications en même temps que le reste du génome bactérien
 Très utilisé comme vecteur de clonage de l'ADN.
ADN
Protéines de la tête
Le phage entre dans la cellule bactérienne par les

récepteurs servant à transporter le maltose à l’intérieur
de la cellule . La synthèse de ces récepteurs est induite par le
maltose et réprimée par le glucose.
Au laboratoire on ajoute du maltose dans le milieu de culture
pour augmenter ces récepteurs.
Protéines de la queue
Cycle du phage Lambda
Carte génétique du phage lambda
Complémentarité des
extrémités cohésives formant
le site cos
- Le gène cI code pour un
répresseur qui inhibe les
gènes codant pour les
- Protéines de la tête et celles
de la queue et d’autres gènes
- cycle lytique ou lysogène
dépend de l’activité de cI
Cycle lysogène
C’est un état de quiescence. Le phage intègre son génome dans celui de l’hôte et reste
dormant, n’induira pas la lyse. En se répliquant, l’hôte réplique en même temps l’ADN
du phage.
CIII N PL/OL PRM Cro tR1 CII
nutL CI PR/OR nutR PRE

tL
Régulateur antiterminateur represseur antirepresseur Régulateur
positif positif
Région de l’immunité
PRE:promoter for repressor establishment (reconnu en présence de la protéine CII), OL et

OR: opérateurs (site de fixation du répresseur pour bloquer la transcription) chevauchant
avec le promoteur qu’ils contrôlent.
Pas transcription maintien en phase lysogène.
Gène CI transcrit à partir du promoteur PRM (repressor maintenance), pas de
Ribosme Binding Site donc début = AUG et traduction inefficace et protéine de faible
poids moléculaire (répresseur)
Le répresseur se fixe indépendamment sur les deux opérateurs. Il a une fonction unique
sur OL mais deux au niveau de OR.
Sur OL le répresseur inhibe la transcription à partir du promoteur PL donc pas expression
de N. Blocage de l’expression des gènes situés à gauche , pas de cycle lytique.
Sur OR le répresseur inhibe expression du gène Cro et de ceux situés à droite. Il
permet aussi la transcription de CI à partir de PRM .
1ère étape après infection, N transcrit permet transcription de CIII et CI. La protéine CIII
empêche la dégradation de la protéine CII. CII permet transcription de CI à partir de PRE
CI PR/OR nutR PRE

tL nutL
Dimérisation
C
Connecteur
CI ARNm Fixation à
N
l’ADN
Répresseur en
monomère
Répresseur en
dimère
Transcription à partir de PRM

Possible mais impossible de
transcrire à partir de PL et PR
Dimérisation indispensable à l’activité lysogène
UV inactivent le répresseur
Forte concentration (4.10-7 M): lysogénie
Faible concentration: lyse
L’expression du gène CI inhibe l’expression de tous les gènes
situés à gauche et à droite et donc conduit à la lysogénie
La protéine CI forme un dimère puis se fixe sur les opérateurs OR1, OR2, OL1
et OL2. Elle comprend les parties N et C terminales. La fixation sur OR1 et
OR2 bloque la transcription à partir du promoteur PR. Par contre la fixation sur
OR2 favorise la transcription à partir du promoteur PRM. La fixation sur OL1 et
OL2 bloque la transcription à partir du promoteur PL.
Partiellement
réprimé
Autorégulation négative suite à l’intéraction des protéines CI fixées sur les sites OL et
OR, et à l’occupation de OL3 et OR3.
Hochschild and Lewis. (2009). The bacteriophage λ CI protein finds an asymmetric solution. Curr.
Opin. Struct. Biol. 19(1): 79-86.
Cycle lytique
Action de Cro
Schubert et al. 2007
Le gène lacZ est transcrit à partir du promoteur PRM mais la traduction a lieu à
partir de son propre Ribosome Binding Site (RBS). La protéine Cro possède un
domaine de fixation à l’ADN. On réalise une mutation de la manière suivante.
Cro-1 porte une mutation dans le domaine de fixation à l’ADN.
Schéma récapitulant la régulation de l’expression du gène cI. La

protéine Cro agit comme inhibiteur de l’expression du gène cI.
Schubert R.A., Dodd 1 I. B. , Egan 1 J. B., and Shearwin K. E. (2007). Cro’s role in the CI–Cro bistable switch is critical for ’s
transition from lysogeny to lytic development. Genes Dev. 21: 2461-2472
Cycle lytique (suite)
Le phage se multiplie dans la cellule et fini par la lyser. Les phages
libérés infectent d’autres cellules.
La protéine Cro inhibe la transcription à partir du promoteur
PRM et à partir des promoteurs PL et PR. Cro se fixe sur le même
site que celui du répresseur CI.

tL
CroARNm
Protéine Cro

tL
CI réprimé, pas production de répresseur

Les autres gènes sont exprimés
Démarrage du cycle lytique
Utilisation du phage Lambda
Le phage Lambda naturel possède 5 sites EcoRI et plus de sites

HindIII. Il faut donc modifier ce phage pour pouvoir y insérer un
fragment d’ADN. Dans les vecteurs modifiés, il n’existe qu’un seul
site EcoRI (vecteurs d’insertion). Mais cela doit obéir à certains
critères de viabilité qui décroît dès que la taille du génome dépasse
105% (51-52 kb) ou plus petite que 78% (38-38,5 kb). Pour
augmenter la taille du fragment à insérer on va éliminer certaines
parties non essentielles du phage notamment entre J et N.
Gènes protéines de Gènes impliqués dans
Tête Queue Réplication cycle lytique
J N
5’ 3’
3’ 5’
O kb 17 kb 35 kb 48,5 kb
λgt10 possède un seul site de restriction EcoRI. La taille de son

génome est de 43,3 kb. On peut y cloner, insérer des fragments
inférieurs à 7 kb pour constituer des banques d’ADNc. L’ADNc à
insérer doit donc avoir un adaptateur EcoRI pour pouvoir
l’insérer dans le site EcoRI. Le site EcoRI est situé dans le gène
CI pour bloquer le la lysogènie et favoriser le cycle lytique.
Les vecteurs de substitutions contiennent 2 sites de restriction
identiques séparés de quelques kb. On peut y insérer jusqu’à 23 kb.
Ex. EMBL3, EMBL4. On les utilise pour construire des banques
génomiques.
Utilisation du phage Lambda
Restriction de l’ADN
Ligation
Très petit pour être Encapsidation

encapsidé
Phage λ ayant un l’ADN

recombinant
Phage λ recombinant
clones
Infection par E. coli étalement
sur milieu solide
Les Cosmides
Utilisés depuis 1978, les cosmides sont des vecteurs artificiels
hybrides: plasmide-phage .
L'avantage des cosmides: possible de cloner de plus grands
fragments d'ADN étranger (35 à 45 kb) qu'avec les vecteurs
dérivant du phage , (23 kb au maximum).
fabriquer des banques génomiques et surtout les gènes étudiés
s'étendent sur une longueur de 30 à 40 kb.
Gène de résistance à l'ampicilline
Originalité des cosmides: le site cos d'un phage a été inclus dans
leur ADN circulaire. Ce site cos servira à ce que le cosmide puisse
être empaqueté dans la tête d'un phage . Lors de l'empaquetage,
les sites cos sont clivés, et une seule unité (linéaire) comprenant
l'ADN du cosmide (avec l'insert d'ADN étranger) limité par les
extrémités cohésives nées des sites cos sera empaquetée. Dans cette
réaction d'empaquetage in vitro, les protéines nécessaires à la
formation de la tête et de la queue doivent être ajoutées pour que les
phages puissent se constituer. Au moment de l'infection de E. coli
par une telle particule phagique, l'ADN linéaire recombinant est
injecté dans la bactérie. Les extrémités cohésives s'apparient et
forment alors un cosmide recombinant circulaire. Ce cosmide se
réplique dans la bactérie comme le ferait un plasmide (il se formera
donc des colonies bactériennes et non des plages de lyse). De plus il
conférera à cette bactérie une résistance à l'ampicilline.
Ainsi un cosmide dont la taille est approximativement de 5 kb peut
recevoir un ADN étranger de 33 a 47 kb.
Gène de résistance Site Cos
à l’ampicilline 4-6 kb Site de clonage (BglII)
Origine de réplication (Ori)
Cosmide: site cos du phage λ + plasmide

→ Clonage de fragment de 45 kb maximum (capacité λ ×3)
Sites cos λ
→ Encapsidation in vitro
→ Particules virales capables d'infecter E. coli
Origine de réplication plasmidique
→ Multiplication dans la bactérie de la même façon qu'un plasmide
YAC et BAC (Yeast or Bacterial Artificial
Chromosome)
Ils permettent de cloner de grands fragments d'ADN dont la

taille varie entre 200 et 500 kb ou plus sous forme de
chromosomes artificiels, dans la levure (yeast) ou dans la
bactérie.
Principe de cette technique
Il faut se doter de grands fragments d'ADN à cloner,
d’éléments nécessaires (par exemple centromère, origine de
réplication, télomères pour la levure) pour que la levure ou
la bactérie les réplique comme s'il s'agissait de ses propres
chromosomes.
Ces BAC et YAC ont facilité l’étude du génome humain (3 X

106 kb).
Couverture de l'ensemble du génome avec une banque YAC
d'environ 60 000 clones de taille moyenne 300 kb (donc 6 fois
le génome)
Vecteurs BAC (Bacterial artificial chromosome)
Promoteur T7 Promoteur Sp6
HindIII
BamHI
N otI NotI
CosN
Zone de
clonage
lacZ
parB CMR
BAC
7 kb F
OriS
parA
repE
Vecteur BAC (Bacterial artificial chromosome) est conçu pour la

cartographie et l’analyse des génomes complexes. Il est basé sur le
plasmide F. Taille maximale des inserts 300-350 kb, le plus souvent
100-150 kb. Il est utilisé pour le séquençage des génomes. Ex. Human
genome project
Structure des vecteurs BAC
oriS: origine de réplication; repE: réplication du plasmide à partie de
oriS; maintient du nombre de copies à 1-2 par cellule
parA, parB: contrôlent le nombre de copies; CMR: gène de
résistance au chloramphénicol
Site de clonage dans le gène lacZ: crible de sélection blanc/bleu
T7 et Sp6 promoteur de phage pour la transcription des gènes
insérés.
YAC (Yeast Artificial Chromosome)
CEN4: centromère du chromosome IV; TEL: télomère I; ori: origine

de réplication; ARS: origine de réplication levure
TRP1 et URA3 : gène impliqué dans la synthèse du tryptophane
(TRP1) et de l'uracile (URA3); souche de levure mutée pour ces gènes
Enzyme de Klenow
L’enzyme de Klenow est une enzyme généralement utilisée au

Laboratoire. Il a été isolé à partir de l’ADN polymérase I de E. coli
laquelle possède 2 sous unités. La grande sous unités possède les
activités polymérase 5’-3’ et exonucléase 3’-5’ (fonction d’édition).
Cette grande sous unité correspond à l’enzyme de Klenow. Quant
à la petite sous unité, elle possède une activité exonucléase 5’-3’.
La séquénase
C’est une ADN polymérase extraite de bactéries infectées par le

phage T4. Son activité exonucléase 3’-5’ a été éliminée.
Très utilisée dans le séquençage
La Taq polymérase
C’est une ADN polymérase extraite d’une bactérie appelée Thermus

aquaticus qui vit dans des sources chaudes. C’est pour cette raison que
sa température optimale est aux environs de 65°C.
Elle est beaucoup utilisée lors de la PCR (polymerase chain reaction)
et le séquençage.
Phosphatase alcaline
Enzyme active à pH alcalin et catalyse l’élimination d’un

groupement phosphate en 5’ d’un fragment pour empêcher une
circularisation
Kinases
Elles transfèrent un groupement phosphate d’un ATP à une

extrémité 5’ d’un ADN déphosphorylé
Ex. T4 polynucléotide kinase
La DNAase I
Elle est d’origine pancréatique de bœuf, a la propriété de couper au

hasard des ADN doubles ou simples brins engendrant des
fragments ayant des groupements phosphate en 5’.
En présence de Mn2+ la DNAase coupe l’ADN double brin en
petits fragments à bouts francs de 1 à 2 nucléotides
En présence de Mg2+ , elle attaque indépendamment les 2 brins de
l’ADN
Elle est utilisée dans des réactions de marquage d’une sonde
La nucléase S1
Isolée à partir d’un champignon, Aspergillus oryzae, la nucléase
S1 attaque les ADN simples brins. Les ADN double brin de même
que les hybrides ADN-ARN sont épargnés.
ADN polymérase
T4DNA ligase
ADN génomique
vecteur
(a)
(b+c)
Les ligases favorisent la formation de liaison ester entre un

fragment 5’-P et un fragment 3’-OH
T4 RNA ligase
La RNA ligase du bactériophage T4 catalyse la liaison des extrémités 5’-

phosphate des ADN ou ARN simple brin à 3’-OH d’autres fragments
simple brin d’ARN ou d’ADN. L’enzyme est capable de lier un fragment
d’un seul nucléotide.
La RNA ligase du bactériophage T4 est utilisée pour le marquage des ARN
sur leur extrémité 3’ et pour la synthèse d’oligonucléotides.
Exonucléase III
L’exonucléase III a une activité 3’-5’ exonucléase, qui s’attaque aux

extrémités 5’ protubérantes ou aux extrémités franches. Elle ne digère
pas l’ADN simple-brin. Cette activité de l’exo III est utile pour
déterminer les limites d’une interaction entre une protéine et un
fragment d’ADN.
Transcriptase réverse
Enzyme d’origine virale (virus à ARN) capable de synthétiser un
brin d’ADNc (ADN complémentaire) à partir d’un ARNm
Les RNAases
Ce sont des enzymes qui agissent sur les molécules ARN.
RNAase A
Elle est extraite du pancréas de Bœuf et couramment utilisée au
laboratoire pour digérer (éliminer) des fragments ARN lors des
procédures de purification de l’ADN.
ARN non digéré
RNase H
C’est une ribonucléase qui clive la chaine d'ARN à partir de

l'extrémité 3' des duplex ADN/ARN libérant un ADN simple
brin.
Chapitre III : Les techniques du génie
Génétique
Extraction des acides nucléiques
Broyer les tissus dans un mortier à l’aide d’un pilon en présence d’un
tampon d’extraction (composition dépend du protocole utilisé)
L’opération doit se faire au froid (4°C) pour éviter de dénaturer les
acides nucléiques
Se munir obligatoirement de
gants
2
1
Broyat contenant homogénéiser
ADN, ARN, protéines Centrifuger à
Sucres 13 000 rpm
phénol 4°C, 10 min
3 4
ADN, ARN récupérer

Protéines Surnageant
Phénol (ADN, ARN)
6
5
Centrifuger à
ADN, ARN homogénéiser 13 000 rpm
Phénol-chloroforme- 4°C, 10 min
Isoamyl alcool
(24-24-1) 8
7
récupérer
Surnageant + Isopropanol froid
(ADN, ARN) Ethanol 100%
ADN, ARN
Dosage des acides nucléiques
Absorption maximale des UV à 260 nm

Mesure de la densité optique (D.O.)
ADN double brin à 260 nm: 1 unité de D.O = 50 µg/ml
ARN à 260 nm: 1 unité de D.O = 40 µg/ml
Concentration en ADN: = DO260 x Facteur de dilution x 50 µg/ml
Concentration en ARN: = DO260 x Facteur de dilution x 40 µg/ml
Protéines maximum d’absorption à 280 nm
Polysaccharides maximum d’absorption à 230 nm
Calcul de la contamination en protéines: DO260/DO280 ≈ 1,8
Calcul de la contamination en polysaccharides: DO260/230 ≈ 0,5
spectrophotomètre Cuve en quartz
Nanodrop
Appareil de dernière génération pour la quantification des acides nucléiques (ADN, ARN)
Electrophorèse sur cuve horizontale
Bromure d’éthidium (BET)

Electrophorèse sur cuve verticale
Cuve verticale
Comment déterminer la taille des fragments
de restriction de l’ADN du phage utilisé ?
ADN viral prédigéré HindIII
Le marqueur, ADN de phage lambda digéré par l’enzyme Hind

III, est utilisé comme référence de taille : la taille de ses
fragments de restriction est connue et son profil d'électrophorèse
permet d'établir une courbe
La distance parcourue au cours de la migration dépend de la taille
dufragment
Hind III
Taille des fragments de

23100 9416 6557 4361 2322 2027
restriction (pb)
Distance parcourue par le
10 12.2 13.3 14.6 16.8 17.5
fragment (mm)
Réplication in vitro:
Amplification en chaîne par polymérase (Polymerase chain
reaction: PCR)
Principe
Fragment à amplifier par
2 régions de séquences
connues. Chaque cycle comprend
Etape 1: dénaturation à 92-95°C
Etape 2: hybridation des amorces
Etape 3: synthèse du brin complémentaire à 70-72°C grâce à la Taq
Polymérase (Thermus aquaticus)
n cycles: quantité d’ADN = 2n
ADN
Dénaturation
de l’ADN
Hybridation
Même séquence que l’amorce sens
des amorces
5’ATACTTTGAAGCGCTTGGGTTCAA GGTTGTGCATGGACTGAAGCCTA3’
3’ACACGTACCTGACTTCGGAT5’
5’ATACTTTGAAGCGCTTGGGT3’ Amorce de gauche (sens) Amorce de droite (antisens)
3’TATGAAACTTCGCGAACCCAAGTT CCA ACACGTACCTGACTTCGGAT5’
Même séquence que l’amorce antisens
Synthèse du brin
complémentaire
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
5’ 5’
1er cycle
Dénaturation (90-95°C) Synthèse (72°C)
Hybridation (50°C)
Conditions optimales pour le choix des amorces
1. La stabilité de l’extrémité 3’ conditionne une bonne initiation de la polymérisation.
3’
5’ 3’ 5’
Extrémité 3’ stable Extrémité 3’ instable
2. Les amorces ne doivent pas être complémentaire
Amorce sens
Amorce antisens
Autodimèrisation d’une amorce Dimèrisation entre des amorces
3. Les amorces ne doivent pas avoir un centre de symétrie
Formation d’un épingle à cheveux
4. Les amorces doivent avoir:

- une vingtaine de nucléotide de longueur (18-30 nucléotides)
- composition en GC (40-60%)
Amplification en chaîne par polymérase
Composition standard du milieu réactionnel, volume
total de 25 µl par exemple
H2O (ultra pure) xµl

Tampon de réaction 2,5 µl
Amorce 1 xµl
Amorce2 xµl
dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) xµl
Taq polymérase xµl
ADN xng
Si le tampon de réaction ne contient pas du MgCl 2, il faut

nécessairement l’ajouter
Effets de la concentration Effets de la température Effets de la concentration

du MgCl2 d’hybridation des amorces
M 1 2 3 4 5 6 M 50 52 54 56 58 60°C
M 0.1 0.2 0.5 1.0 µM
1: 1,5; 2: 2; 3: 2,5; 4: 3;
5: 3,5; 6: 4 mM MgCl2
49
Séquençage: Principe de la méthode de Sanger
Réaction de séquençage
Mélange réactionnel
• ADN matrice (double brin) Incubation → Thermocycleur
• Amorce marqué 32P • Dénaturation (92-95°C)
• dATP, dGTP, dTTP, dCTP • Hybridation des amorces (55-60°C)
• ddATP, ddGTP, ddTTP, ddCTP • Elongation (70-72°C)
• ADN polymérase thermostable
Autoradiogramme d’un gel de séquence d’ADN
(polyacrylamide)
3’
≈400 bases / gel
5’
Séquençage automatique d’ADN: principe du Dye primer
5’…..ATGCCGTANNNN….3’OH
ADN monocténaire
Hybridation d’une amorce
5’…..ATGCCGTANNNN….3’OH
3’OHNNNN….5’P
4 dNTPs
Taq polymérase
ddATP
ddGTP
ddTTP
ddCTP
Amplification PCR
Deoxy Electrophorèse en gel de polya

CTP crylamide ou capillaire
Détection
Chromatogramme
ATGCTT CGGC AA GACT C AA

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PLATEFORME DE GENOMIQUE FONCTIONNELLE

COURS DE BIOLOGIE MOLECULAIRE

Chapitre II : Les Outils du Génie Génétique

Dr. DIAGA DIOUF

Restriction-modification (R-M) systems

• 1ére lettre de dénomination de l’enzyme en majuscule - nom du genre de

Type II Type III Type I

Structure Activités endo Enzyme Bi enzyme bi

Site de coupure même ou près 24-26 pb en aval non spécifi

Restriction/ séparées simultanées mutuelle-

Besoin d’ATP Non Oui Oui

Seuls les enzymes de types II sont utilisés au laboratoire

Enzymes Micro-organismes d’origine Sites de coupures Extrémités

BamHI Bacillus amyloliquefaciens GGATCC Adhésives

EcoRI Escherichia coli GAATTC Adhésives

HindIII Haemophilus influenzae AAGCTT Adhésives

KpnI Klebsiella pneumonia GGTACC Adhésives

PstI Providencia stuartii CTGCAG Adhésives

HpaI Haemophilus parainfluenzae GTTAAC Franches

DraII Deinococcus radiophilus GGGNCCC Adhésives

XbaI Xanthomonas badrii TCTAGA Adhésives

Lieu de coupure N: nucléotide indéterminé

Site de restriction de HaeIII

Après coupure bouts francs

Site de restriction de BamHI

EcoRI coupe au niveau de son site de restriction GAATTC

EcoRI méthylase méthyle de site de restriction GAATTC de EcoRI

CH3 EcoRI CH3

L’activité de EcoRI est bloquée par la modification induite par la

MseI EcoRI BamHI

Digestion avec EcoRI

Les différents types de vecteurs

Types de vecteurs Taille maximale de

Forme relâchée Forme surenroulée

Les phages infectent une seule bactérie spécifique.

Ils apportent de nouvelles fonctions au génome de la bactérie

Bactériophage qui infecte la bactérie Escherichia coli.

Le phage entre dans la cellule bactérienne par les

CIII N PL/OL PRM Cro tR1 CII

nutL CI PR/OR nutR PRE

PRE:promoter for repressor establishment (reconnu en présence de la protéine CII), OL et

CI PR/OR nutR PRE

Transcription à partir de PRM

Schubert et al. 2007

Schéma récapitulant la régulation de l’expression du gène cI. La

CIII N PL/OL PRM Cro tR1 CII

nutL CI PR/OR nutR PRE

CIII N PL/OL PRM Cro tR1 CII

nutL CI PR/OR nutR PRE

CI réprimé, pas production de répresseur

Le phage Lambda naturel possède 5 sites EcoRI et plus de sites

λgt10 possède un seul site de restriction EcoRI. La taille de son

Très petit pour être Encapsidation

Phage λ ayant un l’ADN

Origine de réplication (Ori)

Cosmide: site cos du phage λ + plasmide

Ils permettent de cloner de grands fragments d'ADN dont la

Ces BAC et YAC ont facilité l’étude du génome humain (3 X

Vecteur BAC (Bacterial artificial chromosome) est conçu pour la

CEN4: centromère du chromosome IV; TEL: télomère I; ori: origine

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C’est une ADN polymérase extraite de bactéries infectées par le

C’est une ADN polymérase extraite d’une bactérie appelée Thermus