Complément de cours de Génie Génétique 2019/2020 L2biotech

Le Génie Génétique

Définition

Le génie génétique est un ensemble de méthodes et de techniques permettant

• d'identifier
• d'isoler
• de cloner
• de transférer
• de modifier de manière contrôlée le matériel génétique.

I- Les outils du génie génétique

Définition du génie génétique
Les outils de base du génie génétique
Les enzymes agissant sur les acides nucléiques
Les vecteurs
II- Techniques de base en génie génétique

I. Les outils du Génie Génétique

Ils permettent de travailler avec les acides nucléiques, de les modifier, de les couper, de les associer etc...

1. les nucléases (DNases et RNases)

1-1. Les DNases
Leur fonction consiste à couper l’ADN au niveau de la liaison phosphodiester, libérant deux fragments un se
terminant, généralement, par un 3’OH et l’autre par un 5’ phosphate(Toutes les DNases ont besoin d'ions
divalent. Pour les inhiber, on peut donc utiliser un chélateur d'ion divalent tel que l'EDTA. Une solution d’ADN
comportant de l’EDTA sera donc stable). On distingue les exonucléases qui digèrent l'ADN en retirant les
nucléotides à partir de l'extrémité et les endonucléases qui coupent au milieu de l’ADN.

1-1-1. Les exonucléases

exonucléase III est une 3'→5’ exonucléase, elle retire les nucléotides
d'une manière séquentielle à partir de l'extrémité 3' (à la condition
qu'elle ne soit simple brin).

T7Gene exonucléase est une 5’→ 3’ exonucléase qui a comme substrat de l’ADN double brin avec un 5’
phosphate ou un 5’OH.

T7Gene exonucléase
1
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1-1-2. Les endonucléases

Les endonucléases ont diverses spécificités de substrat, certaines coupent l'ADN double brin d'autre l'ADN
simple brin enfin certaines reconnaissent et coupent au niveau de
séquences caractéristiques.

DNase I : endonucléase qui coupe l’ADN double ou simple brin.

Nucléase S1 : hydrolyse l’ADN et l’ARN simple brin.

Les endonucléases de restriction (ou enzyme de restriction) :

Les endonucléases de restriction sont des enzymes bactériennes participant à un mécanisme de défense des
bactéries vis-à-vis des virus. Pour détruire l’ADN du parasite, la bactérie exprime des gènes de restriction et de
méthylation. Les gènes de restriction permettent la synthèse d’endonucléases coupant l’ADN en des sites très
spécifiques. Afin de protéger l’ADN bactérien de l’hydrolyse par l’enzyme, une méthylase, codée par le gène de
méthylation, va modifier les nucléotides de l’ADN bactérien en les méthylant pour qu’ils ne soient plus reconnus
par l’enzyme de restriction.
L’ensemble du gène de restriction et du gène de méthylation constitue un système de défense de la bactérie vis-
à-vis des phages.
Il y a trois types d’enzymes de retriction : Le type I reconnaît une séquence d'ADN, puis se déplace, s'arrête
1000 à 5000 paires de bases plus loin et libère quelques dizaines de nucléotides
Le type II, coupe l'ADN au niveau de la séquence reconnue,
Le type III coupe une vingtaine de nucléotides plus loin que le site de reconnaissance.

Seuls les Enzymes de restriction de classe II sont utilisés en génie génétique : clivant spécifiquement les deux
brins de l' ADN au niveau d'une séquence, en général palindromique, parfaitement définie (de 4 à 8 nucléotides).
Le nom de chaque enzyme est dérivé du nom d’espèce ou de variété de la Bactérie qui la produit. On écrit
l’initiale du nom du genre, les deux initiales du nom de l’espèce, 1 lettre ou 1 nombre pour désigner la variété
(ou souche) et après un espace un chiffre romain pour désigner
l’ordre de découverte de l’enzyme chez cette souche, exemple :
EcoR I
Les enzymes de restriction sont des hydrolases, agissant sur des
liaisons esters, c’est-à-dire des estérases. Elles catalysent la
coupure de l’ADN, non méthylé en des endroits caractérisés
par une séquence spécifique de nucléotides (site de restriction formé de 4 à 8 nucléotides).
Les extrémités des fragments de restriction peuvent être formées de deux brins d’égale longueur (bouts francs)
ou bien présenter un brin plus long que l’autre de quelques nucléotides (bouts collants).
On appelle isoschizomères des enzymes qui reconnaissent et coupent la même séquence mais qui proviennent de
deux bactéries différentes.

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Organisme d’origine Enzyme Site de Taille du site Nature des

restriction extrémités

Escherichia coli EcoRV 5’ GATATC3’ 6 nucléotides Bouts francs

3’ CTATAG5’

Escherichia coli EcoRI 5’ GAATTC3’ 6 nucléotides Bouts

3’ CTTAAG5’
cohésif

5’ CTGCAG3’
Providencia stuarti PstI 6 sBouts cohésifs
3’ GACGTC5’ nucléotides 3’ sortant
5’ sortant

Haemophilus aegytius HaeIII 5’GGCC3’ 4 nucléotides Bouts francs

3’CCGG5’

Thermus aquaticus TaqI 5’ TCGA3’ 4 nucléotides Bouts cohésifs

3’ AGCT5’ 5’ sortant

Haemophilus HhaI 5’ GCGC3’ 4 nucléotides Bouts cohésifs

haemolyticus 3’ CGCG5’ 3’ sortant

EcoRV 5’ GATATC 3’ 5’ GAT 3’ 5 ’AT C 3’

3’ CTATAG 5’ 3’ CTA 5’ 3 ’T A G 5’

5’ GAATTC 3’
5’ G 3’ 5’ AATTC 3’
EcoRI 3’ CTTAAG 5’
3’ CTTAA 5’ 3’ G 5’

5’ CTGCAG 3’ 5 ’C T G C A 3 ’ 5’G 3’
PstI 3’ GACGTC 5’ 3 ’G 5 ’ 3 ’A C G T C
5’

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1-2. Les RNases

Ces nucléases coupent l’ARN. Quelques RNases sont utilisées en biologie moléculaire :
-RNAse A : coupe après (en 3') les résidus pyrimidiques (C, U).
-RNAse H : digère l'ARN dans un complexe ARN-ADN. On s’en sert pour éliminer l’ARN après avoir fabriqué
un premier brin de cDNA à l’aide de la reverse transcriptase.

2. Les polymérases
Toutes les polymérases synthétisent les acides nucléiques de 5' vers 3' en utilisant des nucléotides triphosphates.
2-1. Les ADN polymérases
On distingue les ADN polymérases, les reverse transcriptases et les terminal transférases
2-1-1. ADN polymérase
Elles synthétisent de l'ADN en prenant comme matrice de l'ADN. Les ADN polymérases ont besoin d'une base
déjà hybridée ou amorce.
Certaines DNA polymérase ont une activité exonucléase. L’activité 3’ → 5’ est souvent appelée activité de
correction. En effet si la polymérase fait une erreur, le dernier nucléotide n’est plus hybridé, la polymérisation
est bloquée. L’activité 3’→5’exonucléase retire le nucléotide non hybridé, la polymérisation peut continuer.

L’ADN
polymérase I de E. coli : c'est une enzyme de 109 kDa qui a une activité 5'-3' polymérase, une activité 3'-5'
exonucléase (activité de correction) et une activité 5'-3' exonucléase. Cette activité 5'-3' exonucléase de l’ADN
polymérase I est souvent gênante en biologie moléculaire. En 1970, Klenow et Henningsen ont enlevé cette
activité par protéolyse (en utilisant la subtilisine et donnant deux fragments). Le grand fragment protéique
obtenu (76 kDa) est dépourvu d'activité exonucléase 5'-3' mais garde l'activité polymérase et l'activité 3'-5'
exonuléase. Depuis le grand fragment est obtenu par expression d'un gène tronqué. C'est le fragment « Klenow »
de l’ADN polymérase I.
T4 et T7 ADN polymérases :
Elles ont les mêmes activités que la Klenow (5’-3’ polymérase et 3’-5’ exonucléase). L’activité exonucléase de
la T4 ADN polymérase est plus importante que l’activité exonucléase de la Klenow, elle sera donc préférée à la
Klenow lorsque cette activité est requise.

Les ADN polymérases thermostables

Les ADN pol thermostable ont permis l’automatisation de la réaction de polymérisation en chaine (PCR)
La Taq ADN polymérase
Elle a l’activités 5'-3' exonucléase. Son avantage est d'être thermostable. Comme elle est dépourvue d'activité 3'-
-4
5' exonucléase, le taux d'erreurs est d'environ 10 par base dupliquée.
L'activité 5'-3' exonucléase a été enlevée en délétant l'extrémité N-terminal de la Taq pol.
La Taq pol possède une activité Adényl terminal transférase : elle ajoute à la de chaque élongation un seul A.
La Taq pol permet d’amplifier par PCR des frangments d’ADN jusqu’à une taille de 3000pb.
La Pfu et la Pwo DNA polymérase :Elles proviennent de Pyrococcus furiosus, bactérie découverte dans des
sources géothermiques en Italie et de Pyrococcus woesei. Elles ont les mêmes séquences et ont donc des activités
identiques. Activité 5'-3' polymérase et 3'-5' exonucléase mais pas d'activité 5'-3' exonucléase. L’activité 3'-5'
-6
exonucléase dite correctrice permet de diminuer le taux d’erreurs à 10 par base dupliquée.
La Vent ADN polymérase Elle provient de Thermococcus littoralis et a les activités 5’-3’ polymérase et 3’-5’
exonucléase. Un mélange des ces dernières enzymes permet d’amplifier par PCR des fragments d’ADN de taille
allant jusqu’à 50kb. 4
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2-1-2 . Les reverses transcriptases

Cette enzyme a la même activité que l’ADN polymérase ADN dépendante, mais elle fabrique un ADN à partir
d’un ARN. Elle a donc une activité 5’→3’ ADN polymérase à la suite d'une amorce hybridée sur un ARN.
L’utilisation principale de cette enzyme est la synthèse d’ADN complémentaire (ADNc) à partir des ARN
messagers de cellules eucaryotes afin d’obtenir un ADNc ne comprenant que les exons.
2-1-3. Terminal transférase: Cette polymérase n'a pas besoin de matrice comme les autres polymérases, elle
ajoute des nucléotides en 3' à l'extrémité du brin d'ADN. Elle ajoute des nucléotides en 3' en présence de dNTP.
Si on veut en ajouter qu'un seul, on ajoute un ddNTP.
Utilisation : Fabrication d'une queue homopolymére pour les clonages Fabrication d'une extrémité cohésive en 3'

Enzyme Template Primer Other activities Other features

E. coli DNA pol I DNA DNA/RNA 3'-5' exo, 5'-3' exo monomeric
E. coli DNA pol
DNA DNA/RNA 3'-5' exo C-terminal fragment
I (Klenow fragment)
3'-5' exo (on a
E. coli DNA pol III DNA DNA/RNA multimeric structure
separate subunit)
extendase (adds 3'-A
Taq pol DNA DNA/RNA thermostable, used in PCR
overhangs)
reverse transcriptase DNA/RNA DNA/RNA (ribonuclease H) used to make cDNA
will synthesize DNA in non-
terminal transferase none required DNA
templated reaction

2-2. Les ARN polymérase

L’ARN polymérase reconnaît un promoteur et synthétise un ARN complémentaire au brin en aval de ce
promoteur. La synthèse s'effectue dans le sens 5'-3' en présence de ribonucléotides.
Le gène d’intérêt cloné dans un vecteur d’expression doit donc être cloné après un promoteur spécifique pour
l’ARN polymérase présente dans la cellule hôte. On utilise trois principales ARN polymérases, la T7 ARN
polymérase, la T3 ARN polymérase et la SP6 ARN polymérase. Ces trois polymérases sont issues des phages
T7, T3 ou SP6 (exprimées chez certaines souches de E.coli qui servent de cellules hôtes) et reconnaissent
chacune un promoteur spécifique, ainsi la T7 ARN polymérase reconnaît le promoteur T7 mais pas les
promoteurs T3 ou SP6.

3) Les ligases
Elle catalyse la formation d'un pont phosphodiester entre une
extrémité 3' OH et une extrémité 5' P. Elle a besoin d'ATP et ions
divalents
T4 ADN ligase
. Elle joint de l’ADN double brin.
Utilisation : ligation d'extrémités cohésives ou d'extrémités franches. Si les deux extrémités sont
déphosphorylés, la ligation ne peut avoir lieu, par contre si une seule
est déphosphorylée, la ligation a lieu sur un des deux brins.

ADN ligase d’E. coli

Ligue des extrémités cohésives double brin d’ADN. L’ADN ligase
d’E.coli est inefficace pour joindre des extrémités franches ou pour
liguer de l’ARN. Elle utilise du NAD comme cofacteur.

T4 ARN ligase
Catalyse la jonction entre un 5' phosphate d'un ARN ou d'un ADN
simple brin avec un 3' OH (ions divalents et ATP) 5
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4) Les phosphatases et kinases

Phosphatases alcalines
La plus utilisée est la phosphatase alcaline bovine. Elle catalyse le retrait du phosphate en 5'. Elle a besoin de
zinc et d’un pH entre 9 et 10 pour fonctionner et est stimulée par le magnésium. Elle est thermolabile, elle peut
être inactivée par incubation à 65°C pendant une heure.
Les phosphatases alcalines sont utilisées par exemple pour déphosphoryler les vecteurs avant de liguer un insert
pour éviter sa recircularisation.

T4 polynucléotide kinase
Transfert le phosphate en γ de l'ATP sur le 5'OH de l'ADN (double ou simple brin) ou sur l'ARN. Utilisation :
marquage de l'extrémité 5' de l'ADN, marquage des oligonucléotides

5) Les méthylases
Les enzymes de restriction sont produites par des bactéries pour se protéger des phages. Pour que l’ADN
bactérien ne soit pas lui-même digéré, la bactérie produit aussi des méthylases spécifiques qui inhibent la
m6
digestion. Ainsi EcoR I ne coupe pas GA ATTC. On pourra utiliser ces méthylases pour inhiber la digestion
d’un fragment.

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II Les vecteurs de clonage & les stratégies de clonage

Un vecteur est une structure biologique capable de complexer une macromolécule et de l’intégrer
spécifiquement dans une cellule vivante. C’est un transporteur capable de conduire une molécule à pénétrer dans une
cellule alors qu’elle n’est pas captée spontanément par cette cellule.
En biologie moléculaire et génie génétique, certains vecteurs sont étudiés pour faire entrer un acide
nucléique dans une cellule et permettre la réplication ou l’expression de cet acide nucléique dans la cellule qui le
reçoit.
Vecteur de clonage Taille de l'insert
Plasmide bactérien <10 Kb
Bactériophage à insertion <10 Kb
Bactériophage à remplacement 9-23 Kb
cosmides 35-45 Kb
BAC (chromosome bactérien artificiel) jusqu'à 300 Kb
YAC (chromosome artificial de levure) 0.2-2.0 Mb

Les plasmides bactériens, les bactériophages et de nombreux virus sont des vecteurs naturels permettant la
transformation de différents types de cellules hôtes. D’autres vecteurs encore plus performants ont été obtenus
artificiellement à partir de ceux-là grâce à des manipulations génétiques.
Les cellules qui sont habituellement transformées par des vecteurs contenant des fragments d’ADN, sont
destinées à permettre d’amplifier ce vecteur en même temps que leur croissance.

Caractéristiques des vecteurs:

1. réplication indépendante de l'ADN de la cellule hôte.
2. petite taille: facilité de manipulation et pour permettre l'insertion de grand fragment d'ADN étranger
3. présence de gènes de sélection: sélection des cellules hôtes qui ont intégré un vecteur.
4. présence de sites de restriction uniques localisés dans les gènes de sélection: permet de sélectionner les cellules
hôtes qui ont intégré un vecteur recombinant.
5. stabilité: maintient sans modification dans la cellule hôte, quel que soit le nombre de division.
1-Les plasmides
Ce sont des molécules d'ADN extra chromosomiques présentes naturellement dans les bactéries ainsi que chez
certains Eucaryotes inférieurs. L'ADN plasmidique est circulaire, double brin et super enroulé. La taille de ces
plasmides peut varier de 2 à 200 kb. Le plasmide porte très souvent un ou plusieurs gènes de résistance à un
antibiotique (ou à une drogue), ce qui permet de repérer leur présence. Il possède une origine de réplication
indépendante de celle du/des chromosome(s) de l'hôte. Ces origines de réplication déterminent le nombre de copies
d'un même plasmide dans une cellule (peut varier de 1 à 700 copies/cellule). Les plasmides permettent de cloner des
fragments d’ADN d’une longuer maximale de 10Kb.
Plasmides Intervenant dans la Nombres de copies par
(naturels) Tailles (Kb) conjugaison cellules phénotypes
1ère génération
R1 110 + 1-3 Résistance à des
antibiotiques
R6 110 + 1-3 Résistance à des
antibiotiques
Production de
ColE1 7 - 15 -20 colchicine
RSF1030 9,4 - 20 – 40 Résistance à
l’ampicilline

Plasmides Tailles (Kb) Intervenant dans la Nombres de copies par phénotypes

améliorés conjugaison cellules
pBR322 Résistance à
ème
(2 génération) 4 ,36 - 15 -20 l’ampicilline et la
tétracycline
pUC18 Résistance à
2,69 - 500 – 700 l’ampicilline+ gène
(3ème génération) de la -galactosidase
Limite des vecteurs plasmidiques:
- faible taille de l'insert: max 8 à 10 kb
- Pénétration du plasmide non-spontanée. 7
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1-1. Le pBR322

Le plasmide pBR322 est un ADN circulaire

double brin de 4361 paires de bases. Par convention le
nucléotide n°1 est situé au milieu du site de restriction
r
EcoR I en direction du gène tet .
Il contient une origine de réplication (2535),
r
un gène de résistance à la tétracycline (tet 861276) et
r
un gène de résistance à l’ampicilline (amp 4153-3293).
r
Le gène amp code pour une protéine (β-lactamase) de
286 acides aminés capable de cataboliser cet
antibiotique.
Le plasmide contient de nombreux sites de
restriction répartis sur toute la séquence. Beaucoup de
ces sites sont uniques, permettant de transformer
l’ADN circulaire en ADN linéaire. Exemple, le site
r
BamH I (position 375) au début du gène tet .

1-2. Les pUC

Les plasmides pUC18 et pUC19 sont des ADN

circulaires double brin de 2686 paires de bases (pb). Ils ont
été construits par recombinaison d’un fragment de pBR322
(2250 pb) et d’un fragment du phage M13 double brin (446
pb).
r
L’ADN issu de pBR322 contient le gène amp qui
permet la sélection par la résistance à l’ampicilline.
L’ADN issu de M13 contient le promoteur du gène lacZ
suivi d’une séquence modifiée comprenant un polylinker
(site multiple de clonage) et la séquence de la partie NH2
terminale du gène de la β-galactosidase. Cette séquence est
indispensable pour que la bactérie hôte puisse avoir
l’activité -galactosidase (phénomène d’α-
complémentation).

1-3 Les plasmides d’expression procaryote:

Comprend :

• Promoteur (constitutif ou inductible)

• Site de fixation des ribosomes
• Polylinker / Multiple cloning site (MCS)
• Signal de terminaison de transcription
• Séquence Tag (pour la purification)
• Codon Stop
• Origine de réplication dans les bactéries
• Gène de résistance à un antibiotique (marqueur de
sélection)
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Stratégie de clonage pour les plasmides pBR322 et pUC18

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2- Les virus

Le bactériophage lambda
Le bactériophage lambda, virus infectant E.coli,
(48,5 kb pour le bactériophage λ sauvage)
présente un génome sous la forme ADN double
brin linéaire avec à ses deux extrémités 12
nucléotides simple brin complémentaires
(extrémité cohésives ou cos).

A l'entrée dans la bactérie, les extrémités cohésives s'hybrident et l'ADN est lié par une ligase d'E. coli. Là,
il y a deux possibilités soit un cycle lysogénique avec intégration de l'ADN du phage dans le génome soit un cycle
lytique.

Dans les bactériophages utilisés comme vecteur de clonage, seul le cycle lytique est important. La
partie centrale du génome, contenant les gènes nécessaires au cycle lysogène sera donc délétée et remplacée par
l'ADN à cloner, qui pourra alors être amplifié lors du cycle lytique du bactériophage.

La seule limitation de ce système réside dans la longueur du fragment qui peut être introduit dans le phage. La taille
totale de l'ADN recombinant obtenu doit être comprise entre 85% et 105 % de la taille du génome originel afin que
l'encapsidation (assemblage du génome et de l'enveloppe du phage ou "capside") de cet ADN soit possible et que le
cycle lytique puisse se produire. Les bactériophages peuvent ainsi porter des fragments de 13 à 23kb environ.

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Stratégie de clonage moyennant le phage lambda comme vecteur

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3. Systèmes hybrides

Parmi les 2 types de vecteurs étudiés, les plasmides sont faciles à manipuler et le phage λ permet une transformation
efficace des bactéries. Des systèmes hybrides ont été réalisés à partir de ces 2 vecteurs :

3-1. Plasmide + phage λ = cosmide : Ce sont

des vecteurs hybrides portant à la fois :
-> des séquences d'origine phagique permettant
leur encapsidation in vitro (séquences cos)
-> des séquences d'origine plasmidique : gène
de résistance à un antibiotique et une origine de
réplication permettant au plasmide de se
répliquer dans une bactérie comme un simple
plasmide (séquence ori).
Ceci permet de se dispenser des régions
essentielles de l'ADN du phage et de construire
des ADN recombinants portant jusqu'à 45 kb
d'ADN étranger. Cet ADN pourra être
encapsidé in vitro dans le phage λ. Il pourra
donc être introduit avec une grande efficacité
dans la bactérie. Par contre une fois à l'intérieur,
il se répliquera comme un plasmide. Les
extrémités cos permettent donc de sélectionner
les recombinants avec de grands inserts (45 kb)
et à introduire le plasmide dans la bactérie.

Stratégie de clonage moyennant le cosmide comme vecteur

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4. les chromosomes artificiels

4-1. Les YAC (Yeast Artificial Chromosome)

Le YAC ou chromosome artificiel de levure
(Yeast Artificial Chromosome).
Les YAC permettent de cloner de 150 à 1 000 kb
de fragments d’ADN. Le génome de la levure
Saccharomyces cerevisiae est constitué de 16
chromosomes de taille comprise entre 250 et 2
000 kb. Chez la levure, trois régions
chromosomiques sont importantes pour sa
réplication. Les séquences télomériques (Tel),
centromériques (CEN), et une séquence ARS
(Autonomous Replicating Sequence).
On a donc construit des chromosomes artificiels
contenant ces régions essentielles et du DNA que
l’on désire cloner. La taille du DNA cloné peut
donc atteindre de 1 000 à 2 000 kb. Les YAC
n'exigent que les cellules de levures comme hôtes.

4-2 Les BAC (Bacterial Artificial Chromosome)

ont pour base le facteur sexuel F de Escherichia
coli. Ce facteur peut contenir de grands fragments
d'ADN. Les BAC peuvent incorporer des inserts
d'ADN étranger pouvant atteindre 300 kb. Le
plasmide F porte des gènes qui sont essentiels pour
réguler sa propre réplication et pour contrôler aussi
le nombre
de copies du plasmide F. Le plasmide F a aussi la
capacité de s'intégrer dans le chromosome
bactérien et de s'en exciser. Un plasmide qui a
cette capacité est appelé un épisome.
Les gènes oriS et repE régissent la réplication
unidirectionnelle du plasmide tandis
que les gènes parA et parB maintiennent le
nombre de copies de celui-ci à 1 à 2
copies par cellule.
Le vecteur BAC11 porte ces gènes essentiels ainsi
qu'un gène de résistance au chloramphénicol et
la portion lacZa du gène b-galactosidase avec 2 sites de
restriction HindIII et BamHI qui permettent le
clonage de fragments d'ADN étranger

4-3. Les PAC (P1 Artificial Chromosome)

Mise au point dans les années 1990 un vecteur

dérivé du bactériophage P1. Le vecteur PAC1
permet de cloner des fragments qui ont une taille
de 75 à 100 kb avec une efficacité qui est
intermédiaire entre celle des cosmides et celle
des YACs.

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LES BANQUES GÉNOMIQUES

La restrictionde l’ADN tout entier d’une cellule et son introduction dans des vecteurs
Construire une banque génomique consiste à fragmenter l’ADN tout entier d’une cellule et à introduire chaque
fragment dans un vecteur, puis dans un hôte approprié. Si la banque est correctement établie, elle contiendra, sous
une forme morcelée, l’ensemble de l’information d’un individu telle qu’elle existe dans son génome, d’où le terme
de banque génomique.
Une banque génomique ne sera représentative que si elle contient, au moins une fois, l’ensemble des séquences du
génome. Il est donc évident que plus les inserts seront longs, plus faible sera le nombre des clones nécessaires. Une
formule statistique permettant de déterminer le nombre de clones nécessaires, compte tenu de la longueur des inserts.
Cette formule, qui dérive de la loi de Poisson est :
log ( 1-P )
N =- --------------
log ( 1-1/n)
P = Probabilité de présence d’une séquence donnée
n = ( longueur du génome ) / ( longueur moyenne des fragments insérés ).

Probabilité de présence Longueur de l’insert en(kb)

d’une séquence donnée 15 20 30 35 40

0,99 860 640 430 370 320

0,95 560 415 280 240 210
0,90 430 320 215 185 160
0,80 300 225 150 130 115

Nombre de clones (en milliers) que doit contenir une banque génomique pour être représentative d’un génome
Humain.

Etablissement d’une banque génomique.

Les différentes étapes principales sont les suivantes :
· Extraction de l’ADN nucléaire
· Digestion du génome avec des enzymes de restriction
· Insertion des fragments d’ADN dans des vecteurs.
· Ligature avec l’ADN ligase
· Transformation (avec des plasmides) ou infection (avec phages) des bactéries
· Culture des bactéries sur des milieux sélectifs
LES BANQUES D’ADNc
L’ADN complémentaire (ADNc) est la copie sous forme d’ADN d’un ARN messager (ARNm). Un banque de
cDNA doit contenir au moins une copie de tous les ARNm présents dans la cellule. Ces banques sont essentiellement
tissulaires puisqu’une cellule d’un tissu donné ne possède pas tous les ARN messagers de l’individu, mais ceux dont
l’état de différentiation cellulaire permet la transcription. Le processus de formation de l’ADNc comprend deux
étapes:
1 - L’isolement de l’ARN poly A+ (poly adénine):
2 - Le passage de l’ARN à l’ADN
Cette étape est toujours réalisée grâce à la transcriptase reverse isolée d’un
rétrovirus. Plusieurs techniques sont utilisées pour la préparation de l’ADNc :
La technique « copie entière » par addition de queues uniformes « tailing»
Après la synthèse du premier brin de cDNA par la reverse transcriptase en présence d’un oligod(T), une queue poly
d© est créée à l’extrémité 3’ par la terminal transférase en présence dedCTP. Un poly d(G) synthétique est alors
utilisé pour s’hybrider à la queue poly dC et servir d’amorce pour la synthèse du brin complémentaire.
La technique « copie entière » par cassure à la RNase H.
Le début de l’opération est identique aux techniques précédentes. Après la synthèse du premier brin par la reverse
transcriptase, le brin de RNA est coupé en plusieurs endroits par la RNase H. Les courts fragment d’ARN servent
alors
d’amorce pour la DNA polymérase I qui synthétise le brin d’ADN par son activité polymérasique 5’ → 3’ et détruit
les restes d’ARN par son activité exonucléasique 3’→ 5’.
La technique du multi-amorçage au hasard : Cette méthode utilise la technique
de synthèse de l’ADNc utilisant un multi-amorçage au hasard avec des oligonucléotides de 6 à 10 nucléotides de
long : « Random primer ». la suite est identique à la méthode par la RNase H. La PCR : Cette technique permet
d’amplifier par la suite l’ADNc.
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III LES TECHNIQUES DE MANIPULATION DES ACIDES NUCLEIQUES

I - Purification des acides nucléiques

Les méthodes d'extraction des acides nucléiques peuvent se classer en trois principales classes en fonction du
principe auquel elles font appel : les méthodes utilisant des solvants organiques, les méthodes utilisant des solvants
non organiques, les méthodes basées sur l'utilisation de microcolonnes de résines échangeuses d'ions.

Nous détaillerons la méthode de base la plus utilisée à savoir celle utilisant l’extraction au phénol chloroforme après
un traitement avec un détergeant / protéinase K

Préparation de l’échantillon suivie par un traitement détergeant/protéinase K

Pour l’extraction d’ADN à partir du sang, les globules rouges du sang (anucléés) sont lysés par choc osmotique en le
mélangeant à une solution hypotonique. Les globules blancs nucléés sont récupérés par centrifugation.
Pour les extractions d’ADN à partir des tissus, une étape préliminaire de broyage suivie d’une homogénéisation est
nécessaire.
Les globules blancs pour l’extraction d’ADN à partir du sang et L’homogénat pour l’extraction d’ADN à partir de
tissus sont resuspendus dans une solution de lyse contenant du détergent : laurylsulfate de Sodium (SDS) avec la
protéinase K, pour détruire les protéines et en présence d’EDTA qui inhibent les nucléases.

Extraction au phénol chloroforme

La solution d’acides nucléiques et de protéines issues des préparations précédentes sont purifiées par addition d’un
même volume de phénol saturé de tampon Tris-EDTA afin d’extraire les protéines. Après agitation douce du
mélange, on sépare les phases par une centrifugation de 10 min sous 10000 g à la température de 4°C. A la sortie, on
distingue une phase aqueuse surnageante contenant les acides nucléiques en solution, une phase organique au fond
du tube : phénol + lipides et à l’interface un « gateau » de protéines précipitées.
On recueille la phase aqueuse avant de la laver par un mélange de chloroforme (CHCl3) etd’alcool isoamylique dans
un rapport 24:1 (v:v). Après, agitation douce du mélange et une centrifugation de 10 min sous 10000 g à la
température de 4°C, on obtient une phase aqueuse contenant l’ADN en solution et une phase organique (24:1)
contenant des restes de phénol, de protéines et de lipides. On recueille à nouveau la phase aqueuse.

Précipitation et lavage de l’ADN

La purification d’une solution d’ADN se fait le plus souvent par précipitations répétées dansl’alcool.• Une solution
d’ADN, portée à haute force ionique par addition de NaCl 3 M (1/10 du volume), est additionnée d’un large excès
d’éthanol absolu (2V) à -20°C. Au bout de quelques minutes, on voit apparaître un précipité blanchâtre, translucide
et filamenteux (la méduse d’ADN) constitué de longs filaments d’ADN précipité. On recueille ce précipité par
centrifugation à 10000 g pendant un quart d’heure environ. Pour laver l’ADN on resuspend le précipité dans de
l’éthanol à 70 % toujours à -20°C. Puis on centrifuge à nouveau. Le culot de cette dernière centrifugation est égoutté,
puis séché sous vide.

Redissolution et conservation de l’ADN

L’ADN est dissout immédiatement soit dans de l’eau pure stérile pour une utilisation immédiate, soit dans un tampon 15

Tris-EDTA 10 :1mM et conserver au froid -20°C, -80°C voire -173°C.

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II - Détection et dosage des acides nucléiques

On peut doser des solutions d'acides nucléiques purs en mesurant leur absorbance en UV à 260nm. Une DO
de 1 correspond approximativement à 50µg/ml d'ADN double brin et 40µg/ml d'ARN et 33 µg/ml d'ADN simple
brin.
On peut également avoir une information quant à la pureté de l'échantillon testé. En effet, l'ADN absorbe environ 1,8
fois moins à 280nm qu'à 260nm (A260/A280=1,8). La présence de protéines (les acides aminés aromatiques
absorbent à 280nm) dans l'échantillon entraîne une diminution de ce rapport.
Il est également possible de détecter les acides nucléiques par marquage radioactif ou par incorporation de
Bromure d'Ethidium après électrophorèse.

III - Electrophorèse des acides nucléiques

Comme pour les protéines, il est possible de séparer en fonction de leur taille et leur forme les acides
nucléiques par électrophorèse. Le principe consiste à faire migrer les molécules dans un gel sous l'action d'un champ
électrique. A pH neutre ou basique, les acides nucléiques sont chargés négativement et migrent vers l'anode.
Deux types de gels sont utilisés en fonction de la taille relative des molécules que l'on veut séparer : gel
d'agarose et gel de polyacrylamide. La résolution des gels d'acrylamide est nettement supérieure à celle des gels
d'agarose On utilisera par exemple un gel d'acrylamide pour séparer deux molécules de tailles très proche. Par contre,
si l'on veut analyser un ensemble de molécules très différentes en tailles on choisira un gel d'agarose.

Les acides nucléiques peuvent être détectés à l'intérieur du gel par incorporation de BET (Bromure
d'Ethidium). Cette molécule est un intercalant des acides nucléiques qui émet une fluorescence sous UV. Le
rendement e fluorescence augmente lorsqu'ils sont intercalés entre les plateaux de bases de l'ADN. L'intensité de la
fluorescence est
proportionnelle à la quantité
d'ADN. Cette technique
permet de détecter jusqu'à
1ng d'ADN. Pour des
quantités plus faibles, on
utilise le marquage à la
radioactivité.

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PCR (Polymerase Chain Reaction)

DEFINITION

C’est une réaction enzymatique qui permet d’amplifier sélectivement en une très grande quantité un fragment
d’ADN spécifique, qui peut être présent en très faible quantité au départ, parmi des millions d’autres fragments.

PRINCIPE
La PCR est une suite de cycles, qui se répètent en boucle, comportant chacun trois paliers de température. De plus,
chacun de ces paliers est caractérisé pas une réaction chimique distincte. En moyenne une PCR comporte entre 20 et
40 cycles.
Chaque cycle est donc constitué de trois étapes différentes:

1 Dénaturation
2 Hybridation
3 Elongation

1° La dénaturation:

Se fait à 95°C (92°C à 98°C) durant 15 s à 30 s. l’ADN se

dénature.
En effet, l’ADN perd sa structure caractéristique en double
hélice, les liaisons hydrogène reliant les bases de chaque brin
d’ADN étant instables à cette température. L’ADN double-
brin (2 brins) est dénaturé en ADN simple brin (1 brin).

2° L’hybridation:
La température d’hybridation est généralement comprise entre 40°C et 70°C et elle est fonction de la composition en
désoxyribonucléotides (dATP, dTTP, dGTP, et dCTP) des amorces.
Les amorces reconnaissent et se fixent à leurs séquences
complémentaires en reformant des liaisons hydrogène. On dit que les
amorces s’hybrident au brin d’ADN.

3° L’élongation:
Puis la température est réglée à 72°C, température idéale pour l’activité de la Taq polymérase.

Cette étape permet à la Taq polymérase de synthétiser le brin

complémentaire à l’ADN matrice, grâce aux dNTPs libres présents dans
le milieu réactionnel.

Au cycle suivant, les nouveaux fragments synthétisés servent à leur tour

de matrice pour la synthèse de nouveaux fragments d’ADN.

En théorie, à la fin de chaque cycle le nombre d’ADN cible est doublée.

Le premier cycle est fini et voilà qu’un nouveau cycle recommence. Cela se reproduira 30 fois (en fonction du
protocole de PCR) comme vous pouvez le voir sur le schéma.

A partir d’une copie d’ADN cible, on pourra donc obtenir 1 milliard de copie d’ADN cible.

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