Université Moulay Ismaïl, Session de rattrapage 2017

Faculté des Sciences Filière SVI, S5

Département de Biologie Meknès Durée 1 h
Pr. MOUMNI
Examen écrit de Biologie Moléculaire

Soient les deux séquences nucléotidiques suivantes :

Séquence 1
3’ GGGCCATTAACCGGTCGTAACATGCGGCCTTAATACCGATTGCAACGTACGTAATGCATTGCATGGCTATCTTACGCTACGGTACTGCTTAAGGTACTGCCGTACGTACAT 5'

Séquence 2
3’ GGGCCAUUAACCGGUCGUAACAUGCGGCCUUAAUACCGAUUGCAACGUACGUAAUGCAUUGCAUGGCUAUCUUACGCUACGGUACUGCUUAAGGUACUGCCGUACGUACAU 5'

A- On veut amplifier la totalité de la séquence par PCR, en utilisant deux amorces de 8 bases chacune.
1- Montrer par un schéma, un cycle complet de PCR, en prenant soin de placer les amorces sur la séquence à amplifier (montrez
seulement les 15 premiers nucléotides de chaque côté, complétez le milieu par un trait).
2- Donner la composition de la réaction de l’amplification par PCR.
3- Donner le résultat de l’amplification sur gel d’agarose coloré par le bromure d’éthidium.
4- Donner le résultat sur gel d’agarose lorsque le produit de l’amplification est traité par Eco RI (on donne le site Eco RI : GAATTC).

B- Nous avons utilisé une sonde de 20 bases marquée par le 32P afin de révéler la séquence 2 en image autoradiographique.
5- Donner le protocole expérimental sous forme d’étapes, ainsi que le résultat de l’autoradiographie.
C- Nous voulons synthétiser le premier brin d’un ADNc, donner la composition de la réaction pour cette synthèse. Faire un schéma (avec
les séquences) pour montrer le processus de synthèse pour seulement, les 20 premiers nucléotides.
D- En utilisant l’une des deux amorces de la question A, montrer le processus de synthèse (par un schéma) des 20 premiers nucléotides en
utilisant le fragment de klenow. Donner la composition de la réaction de cette synthèse.

E- Donner le protocole expérimental de la précipitation alcoolique des acides nucléiques.

 A-
1- Amplification par PCR de la séquence 1 après synthèse du 2eme brin :

3’GGGCCATTAACCGGT CTGCCGTACGTACAT 5'

5’CCCGGTAATTGGCCA GACGGCATGCATGTA3’

Dénaturation

3’GGGCCATTAACCGGT CTGCCGTACGTACAT 5'

5’CCCGGTAATTGGCCA GACGGCATGCATGTA3’

Fixation des amorces

3’GGGCCATTAACCGGT CTGCCGTACGTACAT 5'

5’CCCGGTAA

ACGTACAT 5’
5’CCCGGTAATTGGCCA GACGGCATGCATGTA3’

Synthèse

3’GGGCCATTAACCGGT CTGCCGTACGTACAT 5'

5’CCCGGTAATTGGCCA GACGGCATGCATGTA3’

3’GGGCCATTAACCGGT CTGCCGTACGTACAT 5’
5’CCCGGTAATTGGCCA GACGGCATGCATGTA3’
2- composition de la réaction d’amplification par PCR :
- ADN matrice à amplifier

- 2 amorces spécifiques à la région à amplifier

- Tampon de l’enzyme

- Les dNTP

- MgCl2

- H2O

- Taq polymérase
3- résultats sur gel d’agarose d’amplification : 4-résultats sur gel d’agarose après traitement par EcoR1 :

111pb 92pb

19pb

B-

5- étapes de marquage de la séquence 2 en 5’ :

Électrophorèse de la séquence 2

Northern blot

Marquage de la sonde de 20 pb par le (ɣ_32P) ATP

Hybridation

Autoradiographie
 Résultats :

111 bases

C- la composition de la réaction de synthèse du premier brin d'ADNc:

– ARN matrice (séquence 2)

– Amorce 1

– Les dNTP

– Transcriptase inverse

– tampon d’enzyme

– Schémas de cette synthèse :

3’ GGGCCAUUAACCGGUCGUAA AGGUACUGCCGUACGUACAU 5’
Fixation d’amorce 1

3’GGGCCAUUAACCGGUCGUAA AGGUACUGCCGUACGUACAU 5’
5’CCCGGTAA
Synthèse par la transcriptase reverse

3’ GGGCCAUUAACCGGUCGUAA AGGUACUGCCGUACGUACAU5’
5’ CCCGGTAATTGGCCAGCATT TCCATGACGGCATGCATCAT3’
D- shémas de la synthèse du deuxième brin d'ADN par le fragment de Klenow

3’ GGGCCAUUAACCGGUCGUAA AGGUACUGCCGUACGUACAU5’
5’ CCCGGTAATTGGCCAGCATT TCCATGACGGCATGCATCAT3’
Dénaturation

3’ GGGCCAUUAACCGGUCGUAA AGGUACUGCCGUACGUACAU5’

5’ CCCGGTAATTGGCCAGCATT TCCATGACGGCATGCATCAT3’

Fixation d’amorce 2

3’ GGGCCAUUAACCGGUCGUAA AGGUACUGCCGUACGUACAU5’

TGCATGTA5’
5’ CCCGGTAATTGGCCAGCATT TCCATGACGGCATGCATCAT3’
Synthèse par le fragment de Klenow

3’ GGGCCAUUAACCGGUCGUAA AGGUACUGCCGUACGUACAU5’ séquence 2 : ARN

3’ GGGCCATTAACCGGTCGTAA AGGTACTGCCGTTGCATGTA5’ 2 eme brin d'ADNc

5’ CCCGGTAATTGGCCAGCATT TCCATGACGGCATGCATCAT3’ 1 er brin d'ADNc
 - composition de la réaction
- hybride ADN+ARN (Hétéroduplexe)

- amorce 2

- dNTP

- tampon

- H2O

- fragment de Klenow

E- protocole expérimentale de précipitation alcoolique :

- solution d’acide nucléique

- sels 1/10 de volume

- 2V d’éthanol absolu

- Agitation et centrifugation