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Etapes de clonage du région codante de 30c02 pour

construire le géne 35S : 30c02

➢ Préparation de la région codante du géne 30c02 :


• Par amplification(PCR) du région codante de 30CO2 en créant au meme temps des
sites de restrictions pour HindIII dans le coté 5’ et XbaI dans le coté 3’.

➢ Préparation du promoteur 35S :


• Par digestion enzymatique à partir d’un plasmide( PUC18 )

PUC18
KanR
6Kb
➢ Préparation du vecteur de clonage (le plasmide PUC18).
➢ Transformation des bactéries.
1) Préparation de la région codante du géne 30CO2

➢ Pour péparer la région codante du génes 30c02, on a besoin de


la séquence de cet région et des amorces spéciques pour CDS
du 30c02:
WWW.NCBI.NLM.NIH.GOV

5’ 3’
Brin sens = non transcrit Région codante

• 2 Amorces spécifiques .
• Calcule du T° d’hybridation.

PCR

Electrophorése
sur gel d’agarose
1) Préparation de la région codante du géne 30C02

• CDS du géne 30C02: 387 bp


1 5’atgaggaaac ttccattctt gctcttattt tctgcttgtt gctacttaca acggaaggaa
61 gtatatttcg ccgaaaaaaa cagaaagaaa aattcatcga gcagcgaaca aaaaacacaa
121 agaagaaacc gagggtatgg ccgaagtcgc actttttcaa atggcaatgg catgtatggc
181 caatcgaatg gattttcaaa tggccgattt ggcggctcca gtgtctattc aaatagcggc
241 cggtcgaata gctttccaaa tggtggattt ggcggctcca gtggcttttc atcgatggga
301 cataactcgg gcggacttca cggctttggg tccggcccac cttctggagg ctacggatac
361 ggaagcggtt ttggtggaag aaaatga 3’

amorce R\ Tm=50°C
3’AA AACCAGGTTC TTTTACT AGATCT 5’
5’atgaggaaac ttccattctt………ggaagcggtt ttggtggaag aaaatga 3’
3’tacacctttg aaggtaagaa………ccttcgccaa aaccaccttc ttttact 5’
5’ AAGCTT ATGAGGAAAC TTCCATTCT 3’
amorce F/ Tm =52°

HindIII XbaI

5’ A A G C T T 3’ Tm= 52°C 5’ T C T A G A 3’
3’ T T C G A A 5’ 3’ A G A T C T 5’
1) Préparation de la région codante du gène 30C02

Résultats: sur gel d’agarose

✓ CDS du gène 30C02


387bp
✓ 2 amorces spécifiques que
j’ai synthétisé
✓ ADN polymérase(Taq)
PCR
✓ Tampon
✓ Mg2+
✓ dNTP: A,C,G,T

Récupération du Extraction de
gène dans un tube CDS sur le gel
Par un razoir
2) Préparation du promoteur 35S

Le promoteur 35S est préablemet insèrè


dans le plasmide qu’on veut de l’utliser
comme vecteur de clonage.

PUC18
KanR
6Kb
3) Préparation du plasmide de clonage
Résultats: sur gel
d’agarose

Un plasmide
6KB lèniaire purifié

PUC18
KanR
6Kb
Digestion par Extraction
HindIII et XbaI sur le gel

➢ Une seule bande


correspond au
HindIII XbaI plasmide linéaire

5’ A A G C T T 3’ 5’ T C T A G A 3’
3’ T T C G A A 5’ 3’ A G A T C T 5’
Making the 35S : 30C02

➢ Après gel extraction on obtient :

Tube 1: Tube 2:
30C02 PUC18 et le
promoteur35S

Extrémité sont Extrémité sont


franches(Produit cohésifes(Produit
de la PCR). de la digestion par
HindIII et XbaI).

Digestion par
HindIII et XbaI
Making the 35S : 30C02
Purifié HindIII XbaI
5’ A G C T T T 3’
35S PUC18
3’ A A G A T C 5’

Purifié HindIII XbaI


5’ A G C T T T 3’
CDS 30C02
3’ A A G A T C 5’

- CDS 30C02
- Plasmide PUC18
- Ligase

Transformation des
Bactéries
4) Transformation des bactéries

4) Étalement des
bactéries sur une
boite de pètri
pour la sélection

1) Mélange de 2) Choc thermiques à 3) Ajout de mulieu


plasmide PUC18 et des 42°C : Pénétration nutritif aux bactéries
bactéries de des plasmides dans d’E.coli(croissance 1h à
Escherichia.coli les bactéries 37°C

• Contient des bactéries


transformés contenant le
plasmide PUC18 et des
bactéries non transformés
4) Transformation des bactéries

Colonie de
bactéries

➢ Les bactéries qui son


transformés vont acquérir
une résistance vis-à-vis
Kanamycin.
➢ Alors que les bactéries
non transformés n’ont
aucune résistance à cet
Cultivation des bactéries antibiotique
dans un milieu gélosé et
un antibiotique Kanamycin
4) Transformation des bactéries
➢ Vérification de la construction par PCR (il y a d’autres
méthodes).
HindIII XbaI
R2
5’ A G C T T T 3’
35S PUC18
3’ A A G A T C 5’
F2
HindIII XbaI
R1

5’ A G C T T CDS 30C02 T 3’
3’ A A G A T C 5’

F1
• Vérification de la présence du promoteur 35S : par les amorces F2 et R2
• Vérification de la présence de CDS 30c02 : par les amorces F1 et R1
• Vérification de la présence de 35S : 30c02 : par les amorces F2 et R1
➢ Résultat sur le gel :

• Résultat de • Résultat de • Résultat de l’amPlification


l’amplification de 35S l’amplification de 30c02 de 35S:30c02
M PCR M PCR M PCR

1387bp
1KB

387bp
Thank You