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PUC18
KanR
6Kb
➢ Préparation du vecteur de clonage (le plasmide PUC18).
➢ Transformation des bactéries.
1) Préparation de la région codante du géne 30CO2
5’ 3’
Brin sens = non transcrit Région codante
• 2 Amorces spécifiques .
• Calcule du T° d’hybridation.
PCR
Electrophorése
sur gel d’agarose
1) Préparation de la région codante du géne 30C02
amorce R\ Tm=50°C
3’AA AACCAGGTTC TTTTACT AGATCT 5’
5’atgaggaaac ttccattctt………ggaagcggtt ttggtggaag aaaatga 3’
3’tacacctttg aaggtaagaa………ccttcgccaa aaccaccttc ttttact 5’
5’ AAGCTT ATGAGGAAAC TTCCATTCT 3’
amorce F/ Tm =52°
HindIII XbaI
5’ A A G C T T 3’ Tm= 52°C 5’ T C T A G A 3’
3’ T T C G A A 5’ 3’ A G A T C T 5’
1) Préparation de la région codante du gène 30C02
Récupération du Extraction de
gène dans un tube CDS sur le gel
Par un razoir
2) Préparation du promoteur 35S
PUC18
KanR
6Kb
3) Préparation du plasmide de clonage
Résultats: sur gel
d’agarose
Un plasmide
6KB lèniaire purifié
PUC18
KanR
6Kb
Digestion par Extraction
HindIII et XbaI sur le gel
5’ A A G C T T 3’ 5’ T C T A G A 3’
3’ T T C G A A 5’ 3’ A G A T C T 5’
Making the 35S : 30C02
Tube 1: Tube 2:
30C02 PUC18 et le
promoteur35S
Digestion par
HindIII et XbaI
Making the 35S : 30C02
Purifié HindIII XbaI
5’ A G C T T T 3’
35S PUC18
3’ A A G A T C 5’
- CDS 30C02
- Plasmide PUC18
- Ligase
Transformation des
Bactéries
4) Transformation des bactéries
4) Étalement des
bactéries sur une
boite de pètri
pour la sélection
Colonie de
bactéries
5’ A G C T T CDS 30C02 T 3’
3’ A A G A T C 5’
F1
• Vérification de la présence du promoteur 35S : par les amorces F2 et R2
• Vérification de la présence de CDS 30c02 : par les amorces F1 et R1
• Vérification de la présence de 35S : 30c02 : par les amorces F2 et R1
➢ Résultat sur le gel :
1387bp
1KB
387bp
Thank You