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Code : G.MO-017
Date de cration : 26/08/2009
Date de rvision : 16/01/2013
Version :2
Plateforme GenoSol
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Version
Date
Modificateur
0
1
26/08/2009
01/01/2010
N. Chemidlin
M. Lelievre
24/10/2012
M. Lelievre
16/01/2013
C. Bard
Descriptif
Cration du document
Ajout squences des amorces
MAJ complete : mise en page, en tte, changement
appareil et harmonisation du texte
Prcision du lieu de manipulation (hotte ou paillasse tout
au long du document)
3- Ajout prcisions sur SybrGreen
6- Ajout prcisions sur la non conservation de la gamme
MODE OPERATOIRE
PCR quantitative 18S fongique
Code : G.MO-017
Date de cration : 26/08/2009
Date de rvision : 16/01/2013
Version :2
Plateforme GenoSol
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1- Mots cls
PCR quantitative, champignons, ADNr 18S, FR1, FF390
2- Objectif / principe
Lobjectif de ce mode opratoire est de dnombrer le nombre de copies dADN ribosomal
18S de champignon au sein dun chantillon dADN. Ce dnombrement est ralis par PCR
en temps rel en utilisant un couple damorces spcifique des champignons : FR1 / FF390
(Vainio et al., 2000), pralablement valid pour sa spcificit.
3- Consignes de scurit
La PCR en temps rel utilise des molcules cancrignes (SYBRGreen) pour mesurer la
quantit dADN. Il est donc impratif de toujours travailler avec des gants et de manipuler le
SYBRGreen sous la hotte.
4- Dure de lexprience :
3h30 : 1h de prparation de la plaque PCR et 2h30 de PCR en temps rel
5- Matriel et produits ncessaires
Matriel :
Appareil de PCR en temps rel (StepOne Plus)
Logiciel
Pipettes (spcifiques aux produits manipuls)
Consommables
stock plateforme_conservatoire GenoSol
Plaque 96 puits/barettes/tubes 0.2ml de qualit optique (Applied Biosystems)
Film optique/bouchons optiques (Applied biosystems)
stock commun
microtubes 2ml/1,5ml
pointes filtres
pointes normales
plaque ABgene 96 puits + bouchon (strip*8 puits)
Produits de biologie molculaire (stock plateforme_conservatoire)
Master Mix SYBRGreen
T4 Apligen
Eau 5 PRIME
Gamme qPCR 18S (aliquot tube mre 0.5E9 copies/l)
Etalon interne Gx (aliquot)
Amorces FR1/FF390 10M purif RP-CARTRIDGE (stock aliquots grs par T. Regnier)
Rdig par : N. Chemidlin
Fonction : Post Doctorant
MODE OPERATOIRE
PCR quantitative 18S fongique
Code : G.MO-017
Date de cration : 26/08/2009
Date de rvision : 16/01/2013
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6- Mthode :
Diluer les chantillons 1ng/l avec une prise dessai minimum de 0.5-1l selon la pipette
utilise dans de leau UP (5 PRIME). Les chantillons peuvent tre directement dilus en
plaque 96 puits selon le mme plan de plaque que le plan dexprimentation. La plaque 96
puits + bouchons doit tre strilise aux UV pendant 15 minutes.
Si la dilution est ralise plus de 24h lavance, conserver la plaque -20C jusqu son
utilisation.
Striliser la hotte PCR aux UV pendant 10 minutes en ayant pris soin de placer la plaque
96 puits en dessous sur son portoir spcifique, une paire de gants, leau UP, le rservoir,
le tube de mix.
Mettre les aliquots damorces dgeler, le master Mix SybrGreen (Applied). Prparer la T4
dans un bloc froid ou au conglateur.
Pendant ce temps,
o Centrifuger la plaque dADN : short jusqu 1000-2000g
o Prparer la gamme partir du tube mre : 6 points de gamme de 108 copies/l
103 copies/l, avec au moins 2l de prise dessais (soit 2l de sol mre + 18l
deau UP). La gamme est utilisable une seule fois car elle ne se conserve pas.
o Prparer ltalon interne (utiliser le mme pour un projet) 1ng/l
Une fois les UV teints, prparer le mix PCR selon le tableau ci-aprs avec des cnes
filtre. Une trame danalyse de mix est disponible dans la documentation qualit. TOUT LE
CONSOMMABLE SOUILLE AU SYBRGREEN DOIT ETRE EVACUE
SPECIFIQUEMENT ET EN SECURIBAC !!
Composition du Mix
marque
Concentration
initiale
quantit
finale
Pour 1 Tube
(L)
Life
Technologies
Eurogentec
2x
1x
10
10M
1.25M
2.5
Eurogentec
10M
1.25M
2.5
H2O
5PRIME
2.00
T4 apligene
MP Bio
500g/ml
0.500g
MODE OPERATOIRE
PCR quantitative 18S fongique
Code : G.MO-017
Date de cration : 26/08/2009
Date de rvision : 16/01/2013
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(sous la hotte) :Distribuer le mix (18l par puits) dans la plaque 96 puits laide de la
pipette distributrice ou dune pipette multicanaux + rservoir.
Recouvrir la plaque contenant le mix qPCR et lADN avec un film optique Applied et
bien maroufler le film plastique, particulirement entre les puits, afin quil ny ait pas
dvaporation au cours de la raction ni de contamination entre les puits.
La taq tant une hot start, il est possible de prparer lexprimentation lavance et de stocker
la plaque quelques heures 4C !
Placer la plaque dans le bon sens dans lappareil PCR en temps rel et lancer la
mthode.
- Dnaturation initiale : 95C_10minutes
- Dnaturation : 95C_15 secondes
x 35 cycles
MODE OPERATOIRE
PCR quantitative 18S fongique
Code : G.MO-017
Date de cration : 26/08/2009
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SybrGreen
Numro CAS
Formule chimique
163795-75-3
Toxicit
Nouveaux pictogrammes
Protection
Blouse, gants
MODE OPERATOIRE
PCR quantitative 18S fongique
Code : G.MO-017
Date de cration : 26/08/2009
Date de rvision : 16/01/2013
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9- Rfrence(s) bibliographique(s)
Vainio, E. J. and J. Hantula (2000). "Direct analysis of wood-inhabiting fungi using
denaturing gradient gel electrophoresis of amplified ribosomal DNA." Mycological Research
104(8): 927-936.
N Chemidlin Prevost Bour, C Mougel, S Dequiedt, M Lelievre, R Christen, L Ranjard*.
2011. Optimization and validation of real time PCR of fungal communities in soils. Plos One
6, e2466.