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MODE OPERATOIRE

PCR quantitative 18S fongique

Code : G.MO-017
Date de cration : 26/08/2009
Date de rvision : 16/01/2013
Version :2

Plateforme GenoSol

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PCR quantitative 18S fongique

Version

Date

Modificateur

0
1

26/08/2009
01/01/2010

N. Chemidlin
M. Lelievre

24/10/2012

M. Lelievre

16/01/2013

C. Bard

Rdig par : N. Chemidlin


Fonction : Post Doctorant

Descriptif
Cration du document
Ajout squences des amorces
MAJ complete : mise en page, en tte, changement
appareil et harmonisation du texte
Prcision du lieu de manipulation (hotte ou paillasse tout
au long du document)
3- Ajout prcisions sur SybrGreen
6- Ajout prcisions sur la non conservation de la gamme

Vrifi par : M. Lelievre


Fonction : AI

Approuv par : L. Ranjard


Fonction : CR

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PCR quantitative 18S fongique

Code : G.MO-017
Date de cration : 26/08/2009
Date de rvision : 16/01/2013
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Plateforme GenoSol

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1- Mots cls
PCR quantitative, champignons, ADNr 18S, FR1, FF390
2- Objectif / principe
Lobjectif de ce mode opratoire est de dnombrer le nombre de copies dADN ribosomal
18S de champignon au sein dun chantillon dADN. Ce dnombrement est ralis par PCR
en temps rel en utilisant un couple damorces spcifique des champignons : FR1 / FF390
(Vainio et al., 2000), pralablement valid pour sa spcificit.
3- Consignes de scurit
La PCR en temps rel utilise des molcules cancrignes (SYBRGreen) pour mesurer la
quantit dADN. Il est donc impratif de toujours travailler avec des gants et de manipuler le
SYBRGreen sous la hotte.
4- Dure de lexprience :
3h30 : 1h de prparation de la plaque PCR et 2h30 de PCR en temps rel
5- Matriel et produits ncessaires
Matriel :
Appareil de PCR en temps rel (StepOne Plus)
Logiciel
Pipettes (spcifiques aux produits manipuls)
Consommables
stock plateforme_conservatoire GenoSol
Plaque 96 puits/barettes/tubes 0.2ml de qualit optique (Applied Biosystems)
Film optique/bouchons optiques (Applied biosystems)
stock commun
microtubes 2ml/1,5ml
pointes filtres
pointes normales
plaque ABgene 96 puits + bouchon (strip*8 puits)
Produits de biologie molculaire (stock plateforme_conservatoire)
Master Mix SYBRGreen
T4 Apligen
Eau 5 PRIME
Gamme qPCR 18S (aliquot tube mre 0.5E9 copies/l)
Etalon interne Gx (aliquot)
Amorces FR1/FF390 10M purif RP-CARTRIDGE (stock aliquots grs par T. Regnier)
Rdig par : N. Chemidlin
Fonction : Post Doctorant

Vrifi par : M. Lelievre


Fonction : AI

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PCR quantitative 18S fongique

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Date de cration : 26/08/2009
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6- Mthode :

Rserver lappareil et un crneau

Prparer le plan dexprimentation laide de la trame de mix

Diluer les chantillons 1ng/l avec une prise dessai minimum de 0.5-1l selon la pipette
utilise dans de leau UP (5 PRIME). Les chantillons peuvent tre directement dilus en
plaque 96 puits selon le mme plan de plaque que le plan dexprimentation. La plaque 96
puits + bouchons doit tre strilise aux UV pendant 15 minutes.
Si la dilution est ralise plus de 24h lavance, conserver la plaque -20C jusqu son
utilisation.

Striliser la hotte PCR aux UV pendant 10 minutes en ayant pris soin de placer la plaque
96 puits en dessous sur son portoir spcifique, une paire de gants, leau UP, le rservoir,
le tube de mix.

Mettre les aliquots damorces dgeler, le master Mix SybrGreen (Applied). Prparer la T4
dans un bloc froid ou au conglateur.

Pendant ce temps,
o Centrifuger la plaque dADN : short jusqu 1000-2000g
o Prparer la gamme partir du tube mre : 6 points de gamme de 108 copies/l
103 copies/l, avec au moins 2l de prise dessais (soit 2l de sol mre + 18l
deau UP). La gamme est utilisable une seule fois car elle ne se conserve pas.
o Prparer ltalon interne (utiliser le mme pour un projet) 1ng/l

Une fois les UV teints, prparer le mix PCR selon le tableau ci-aprs avec des cnes
filtre. Une trame danalyse de mix est disponible dans la documentation qualit. TOUT LE
CONSOMMABLE SOUILLE AU SYBRGREEN DOIT ETRE EVACUE
SPECIFIQUEMENT ET EN SECURIBAC !!
Composition du Mix
marque

Concentration
initiale

quantit
finale

Pour 1 Tube
(L)

Life
Technologies
Eurogentec

2x

1x

10

10M

1.25M

2.5

Eurogentec

10M

1.25M

2.5

H2O

5PRIME

2.00

T4 apligene

MP Bio

500g/ml

0.500g

Master mix SybrGreen (6mM


MgCl2)
Primer 1 (FR1) (10M)
Primer 2 (FF390) (10M)

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Squences des primers :


FR1 : 5-AICCATTCAATCGGTAIT-3
FF390 : 5-CGATAACGAACGAGACCT-3
I : Inosine. Elle ne shybride aucune des bases azotes
Le I peut tre remplac par un N.
Le N reprsente un mlange quimolaire de chaque base alors que le I se lie aspcifiquement
chaque nuclotide. Il ny a aucun impact sur le programme thermique ou le rsultat.

(sous la hotte) :Distribuer le mix (18l par puits) dans la plaque 96 puits laide de la
pipette distributrice ou dune pipette multicanaux + rservoir.

Ajouter 2l dADN dilu ( 1ng/l) ou de gamme dans la plaque 96 puits. (jamais


dADN sous la hotte!) Si vous plongez la pipette directement dans le mix, la pointe est
souille au SybrGreen, et donc vacuer en consquence. Attention ouvrir les tubes
dlicatement pour viter toute contamination entre les tubes dADN dilus.

Recouvrir la plaque contenant le mix qPCR et lADN avec un film optique Applied et
bien maroufler le film plastique, particulirement entre les puits, afin quil ny ait pas
dvaporation au cours de la raction ni de contamination entre les puits.

Centrifuger la plaque : short jusqu 1000-2000g.

Homogniser la plaque sur lagitateur de plaque pendant 30 secondes

La taq tant une hot start, il est possible de prparer lexprimentation lavance et de stocker
la plaque quelques heures 4C !

Placer la plaque dans le bon sens dans lappareil PCR en temps rel et lancer la
mthode.
- Dnaturation initiale : 95C_10minutes
- Dnaturation : 95C_15 secondes
x 35 cycles

- Hybridation des amorces : 50C_30 secondes


- Elongation : 72C_1 minute (+ collecte donnes)
- Courbes de dissociation : 95C_ 15 sec ; 60C_15 sec ; (0.5C/seconde) ; 95C_15 sec
Valider la plaque laide de linstruction de validation des analyses qPCR. Les critres
ont t fixs par la plateforme :

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- Vrification qualitative dune amplification PCR : amplification de ltalon interne


- Valider la gamme de standards : linarit de la gamme et homognit entre rplicats
- La linarit de la droite de rgression doit tre trs bonne. Le coefficient de corrlation
(r) doit tre suprieur 0,990.
- Les chantillons doivent tre compris entre les bornes suprieure et infrieur de la
gamme. Il faut viter davoir faire des extrapolations.
- Lefficacit de PCR doit tre comprise entre 85% et 110%, ce qui correspond une
pente comprise entre -3,1 et -3,74.
- Les chantillons doivent se situs au moins 1 log du tmoin ngatif (NTC, c.f.
Amplification plot) et sortir des cycles compris dans lintervalle dfini par la gamme de
standards.
- Vrifier la "Melt Curve" : 1 pic
- Vrifier les erreurs signales par le logiciel : les flags
SI LA PLAQUE EST VALIDE, exporter les donnes qui seront alors analysables.
Les donnes exportes seront analyses selon la mthode de la super gamme (utiliser le
Ct moyen de tous les talons interne pour corriger les valeurs de Ct des points de gamme et
des chantillons et calculer le nombre de copies de gnes pour chaque chantillon avec une
nouvelle valeur de pente et dordonne lorigine)

7- Ractifs chimiques, lments de scurit


Produits

SybrGreen

Numro CAS

Formule chimique

163795-75-3

Toxicit
Nouveaux pictogrammes

Protection

Blouse, gants

8- Evacuation des dchets


Les dchets liquides sont rcuprs dans des flacons prvus cet effet puis vacuer en
soute sous forme de bidon ou dans un scuribac.
Les consommables sont limins dans des poubelles jaunes de laboratoire prvues cet
effet. Ces poubelles sont vacues une deux fois par semaine par une socit prive.
Les papiers et gants non contamins sont vacus dans les poubelles conventionnelles.
Les dchets contamins au SYBRGreen sont vacus dans un sac plac sous la hotte PCR
qui sera ensuite plac en scuribac.

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9- Rfrence(s) bibliographique(s)
Vainio, E. J. and J. Hantula (2000). "Direct analysis of wood-inhabiting fungi using
denaturing gradient gel electrophoresis of amplified ribosomal DNA." Mycological Research
104(8): 927-936.
N Chemidlin Prevost Bour, C Mougel, S Dequiedt, M Lelievre, R Christen, L Ranjard*.
2011. Optimization and validation of real time PCR of fungal communities in soils. Plos One
6, e2466.

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