BCM 6016 - Méthodes de pointe en purification de protéines

Purification de la protéine Cas9

BCM 6016
Méthodes de pointe en
purification de protéines

Expérience
Purification de la
protéine Cas9
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Table des matières

BCM 6016 - MÉTHODES DE POINTE EN PURIFICATION DE PROTÉINES ............................ 1
PURIFICATION DE LA PROTÉINE CAS9 ............................................................................................. 1
Préambule ............................................................................................................................................ 3
1. Préparation des tampons............................................................................................................ 4
2. Préparation de l'extrait cellulaire................................................................................................. 5
3. Chromatographie d’affinité ......................................................................................................... 7
4. Chromatographie échangeuse d’ions ....................................................................................... 10
5. Dessalage de l’échantillon......................................................................................................... 13
6. Préparation du gel SDS-PAGE.................................................................................................... 15
7. Concentration de l’échantillon .................................................................................................. 17
8. Calibration de la colonne de filtration sur gel et analyse de la protéine purifiée ....................... 18
9. Migration sur gel SDS-PAGE ...................................................................................................... 21
10. Essai fonctionnel de la protéine Cas9 purifiée ........................................................................... 24
Annexe 1: Schéma annoté du système de FPLC ÄKTA Pure ............................................................... 27
Annexe 2: Schéma illustrant les différentes positions de la valve d’injection. ..................................... 28
Annexe 3: Information concernant l’échelle de poids moléculaire Precision Plus de Bio-Rad. ........... 29
Annexe 4: Information concernant l’échelle de poids moléculaire 2-log DNA Ladder de NEB. ........... 30
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Préambule
La méthode d’édition de génome CRISPR/Cas9 est de plus en plus utilisée. Cette technique
de pointe permet d’éditer spécifiquement le génome d’un organisme vivant, que cela soit une
cellule ou un zygote (et donc un animal). À l’aide de la protéine Cas9, liée à un ARN guide, on peut
cibler une région très spécifique du génome et générer, par la protéine Cas9, un bris d’ADN double-
brin sur cette région. La technique peut s’effectuer de deux façons différentes :
- Transfection d’un plasmide portant le gène pour l’expression de la protéine Cas9 et de
l’ARN guide. Celle-ci a l’avantage d’être peu coûteuse puisqu’un plasmide est facilement
renouvelable. De plus, elle est facile à mettre en œuvre. Les principaux désavantages dans
cette manipulation sont sa faible efficacité d’édition et l’expression constante de Cas9
dans l’organisme, ce qui favorise le phénomène de off-target, soit le clivage de l’ADN
génomique à des sites non désirés. De plus, la présence d’ADN plasmidique peut favoriser
l’insertion non désirée de celui-ci à des sites de coupures (insertion mutagène).
- Transfection du complexe préformé de la protéine Cas9 et de l’ARN guide. Cette technique
a le principal avantage d’être très efficace et d’éviter toute insertion mutagène puisqu’il
n’y a pas d’ADN plasmidique. De plus, la courte durée de vie intracellulaire du complexe
Cas9/ARN-guide et son absence de renouvellement dans les cellules permet de diminuer
drastiquement les risques de off-target. Le principal désavantage de cette technique est
qu’elle est plus coûteuse et plus complexe à mettre en œuvre. En effet, la protéine doit être
purifiée au préalable ou achetée commercialement (~60$/100pmole). Chaque expérience
d’édition de génome nécessite une plutôt grande quantité de protéine (130 pmole soit 21
µg).

Dans le cadre de ce cours d’apprentissage à la purification de protéines, nous allons

procéder à la purification de la protéine Cas9. La protéine est exprimée dans une souche
bactérienne BL21 (permettant ainsi l’expression d’une grande quantité de protéines sous le
contrôle d’un promoteur T7). De plus, la protéine possède un certain nombre de codons rares et
doit donc être exprimée dans une souche particulière : Rosetta. Cette souche possède un plasmide
qui permet l’expression d’ARN de transfert pour ces codons rares.

Deux grands principes sous-tendent chaque purification : la pureté et le rendement.

Dans le cas de la protéine Cas9, comme nous l’avons dit précédemment chaque expérience
d’édition nécessite une grande quantité de protéine. Ainsi, la purification devrait permettre d’avoir
un rendement suffisamment grand (de l’ordre de plusieurs mg). Si on ne purifie que quelques µg,
cela ne sera pas une technique envisageable. De plus, puisque la protéine Cas9 est injectée
ensuite dans une cellule ou dans un zygote, elle se doit d’être extrêmement pure.
Celle-ci possède une queue histidine. La première étape consistera à la purifier sur une
colonne d’affinité au nickel. Par la suite, une résine échangeuse d’ions permettra d’enlever les
impuretés restantes en plus d’éliminer l’ADN qui pourrait avoir suivi lors de la purification. Par la
suite, une filtration sur gel permettra de vérifier la pureté de la protéine et de s’assurer de son
intégrité en mesurant sa masse moléculaire. Finalement, la fonctionnalité de la protéine sera
validée en effectuant un essai de clivage in vitro. À chaque étape, vous devrez conserver un aliquot
(fraction) afin d’effectuer le suivi de la purification.
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1. Préparation des tampons

Théorie :
La première étape de toute manipulation consiste à préparer les tampons nécessaires à
l’expérience. De ce fait, nous allons ici vous faire préparer les tampons.

Pratique :
Matériel nécessaire :
• Bouteilles de 1 L
• Béchers et cylindres
• Plaque agitatrice
• Balances
• Barreaux magnétiques
• pH-mètre

Solutions nécessaires :
• KCl en poudre (MW : 74.55 g/mol)
• Tris 1 M pH 8.0
• HEPES en poudre (MW : 238.3012 g/mol)
• HCl et NaOH
• Imidazole en poudre (MW : 68.01 g/mol)
• Glycérol 100%
• DTT 1 M
• Eau ultrapure

1. Préparez 500 mL de chacun des tampons suivants :

• Tampon A (20 mM Tris pH8.0, 250 mM KCl, 20 mM Imidazole, 10% Glycérol, 0.5 mM
DTT)
• Tampon B (20 mM Tris pH8.0, 800 mM KCl, 20 mM Imidazole, 10% Glycérol, 0.5 mM
DTT)
• Tampon C (20 mM HEPES pH8.0, 500 mM KCl, 250 mM Imidazole, 10% Glycérol)
• Tampon D 2X sans glycérol (40 mM HEPES pH7.5, 1000 mM KCl)

2. Assurez-vous que les poudres sont dissoutes et que les solutions sont homogènes.
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2. Préparation de l'extrait cellulaire

Théorie :
La première étape d’une purification de protéines exprimées dans le cytoplasme de
cellules est la rupture des membranes cellulaires et la libération du contenu cytoplasmique. Cette
étape se nomme l’extraction.
Diverses méthodes existent pour cela telles que le broyage manuel avec un abrasif
(alumine), l’utilisation de la pression (French Press), la sonication ou encore des méthodes
enzymatiques (digestion de la paroi bactérienne par le lysozyme).
Le choix de la méthode dépend de diverses conditions comme le type de cellules
employées (bactériennes, animales ou végétales), les équipements disponibles ou encore la
quantité d’échantillon utilisée.
La sonication est un processus par lequel un courant électrique permet de générer des
ultrasons via une sonde, permettant ainsi la rupture des membranes cellulaires. Les avantages de
cette méthode sont, entre autres, la rapidité de mise en œuvre (y compris pour de grands volumes
d’échantillon), l’efficacité et la destruction de l’ADN génomique et des membranes. Toutefois, elle
génère une quantité importante de chaleur. Pour cette raison, il est important de laisser des temps
de repos afin de permettre à l’échantillon de refroidir entre les cycles de sonication et également
d’optimiser la durée totale de la sonication.
La sonication se décrit selon l’amplitude (énergie appliquée à l’échantillon en %), la durée
des impulsions ON (temps de sonication effectif), la durée des pulses OFF (temps de repos) et le
nombre total de pulses ON.
Ci-dessous (Figure 1), vous trouverez la quantité de protéine Cas9 active libérée par les
cellules dans l’échantillon en fonction du nombre de pulses ON. Comme on peut le constater
(courbe pleine), à mesure que le nombre de pulses ON augmente, de plus en plus de Cas9 est
libérée des cellules, atteignant un plateau, indiquant la lyse complète des cellules. Si la sonication
continue (courbe tirets), l’activité disponible de Cas9 diminue, illustrant la désactivation de la
protéine par la chaleur générée lors du processus.

120

100
Cas9 active disponible (%)

80

60

40

20

0
Nombre de Pulse ON

Figure 1: Quantité de Cas9 active libérée par les cellules dans l'échantillon en fonction du nombre de pulses ON
appliquée à l'échantillon. La quantité de Cas9 active libérée est exprimée en pourcentage du total libéré lors de
l’expérience.
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Pratique :
Matériel nécessaire :
• Culot de bactéries BL21 (DE3) Rosetta surexprimant la protéine Cas9
• Sonicateur
• Support de refroidissement pour tubes de 15 mL (entreposé préalablement à -20°C)
• Centrifugeuse Sorvall Legend X1R

Solutions nécessaires :
• Tampon A (20 mM Sodium Phosphate pH7; 500 mM NaCl; 20 mM Imidazole)
• ¼ pastille de Complete Protease Inhibitor sans EDTA

3. Resuspendez le culot de bactéries en vortexant dans 10 mL de tampon A dans un tube de

50 mL puis transférez le contenu dans un tube de 15 mL. Ajoutez également le ¼ de
pastille de Protease Inhibitor lors de la resuspension du culot.

4. Déposez le tube dans un support de refroidissement lui-même entouré de glace sèche et

soniquez l’échantillon selon le programme suivant en insérant la sonde du sonicateur
d’environ 5 à 6 cm dans l’échantillon :
Amplitude : 100%
Durée pulse ON : 10 s
Durée pulse OFF : 45 s
Nombre de pulses ON : 12

5. Centrifugez à 4696 g dans une centrifugeuse Sorvall Legend X1R (en équilibrant les tubes
deux à deux avec un tube d’eau) durant 5 minutes à 4°C.

6. Recueillez le surnageant dans un cylindre gradué et notez son volume. Prélevez un aliquot
de 100 µL que vous conserverez au réfrigérateur. C’est votre aliquot Lysat.
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3. Chromatographie d’affinité
Théorie :
La chromatographie d’affinité est une technique de purification permettant d’offrir un
grand taux de purification le plus rapidement possible. En effet, la protéine d’intérêt est capturée
par son interaction très spécifique avec un ligand.
Pour certaines protéines, un ligand fixant naturellement la protéine peut être utilisé telle
que la protéine G ou la protéine A qui sont capables de fixer spécifiquement les chaînes communes
des anticorps et peuvent donc être utilisée pour les purifier.
Pour d’autres, on peut fixer de manière covalente un ligand sur une résine afin de capturer
la protéine d’intérêt ayant une affinité pour ce ligand.
Toutefois, la plupart des protéines n’ont pas de ligand naturel, ou un ligand qui ne peut
être fixé sur une résine. Dans ce cas, une colonne d’affinité peut être utilisée, à condition d’ajouter
une étiquette (« tag ») à la protéine d’intérêt.
Différentes étiquettes offrant divers avantages sont utilisées pour la purification. Le
Tableau I présente différentes étiquettes couramment utilisées en purification de protéines.

Dans notre cas, la protéine Cas9 surexprimée possède un tag Histidine à son extrémité C-
terminale. Elle sera donc purifiée sur une colonne d’affinité au Nickel.

Tableau I : Étiquettes couramment utilisées

Nom Taille Affinité pour Avantages
Petit
His-Tag 6 acides aminés Métaux divalents
Purification aisée
Augmente la solubilité
GST 26 kDa Glutathion Grand rendement
Doit être enlevé
Petit
FLAG™ 8 acides aminés Anticorps anti-FLAG
Grande pureté

MBP (Maltose Binding Augmente la solubilité

40 kDa Maltose
Protein) Doit être enlevé

Note : Vous trouverez en Annexe 1 page 27 un schéma annoté du modèle de système AKTA
disponible sur lequel vous travaillerez ainsi que des schémas des différentes positions de la valve
d’injection en Annexe 2 page 28.

Pratique :
Matériel nécessaire :
• Système ÄKTA
• Colonne HisTrap FF 5 mL (GE Healthcare)

Solutions nécessaires :
• Tampon A (20 mM Tris pH8.0, 250 mM KCl, 20 mM Imidazole, 10% Glycérol, 0.5 mM DTT)
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• Tampon B (20 mM Tris pH8.0, 800 mM KCl, 20 mM Imidazole, 10% Glycérol, 0.5 mM DTT)
• Tampon C (20 mM HEPES pH8.0, 500 mM KCl, 250 mM Imidazole, 10% Glycérol)
• Bécher d’eau ultrapure

7. Installez la colonne HisTrap FF sur le système ÄKTA ainsi qu’une boucle d’injection de 10
mL.

8. Insérez le tuyau A1 dans le Tampon A, A2 dans le Tampon B, B1 dans le Tampon C et

finalement B2 dans l’eau.

9. Amorcez et dégazez les pompes en aspirant avec une seringue 50 mL.

→N’oubliez pas de dégazer A1 et A2, B1 et B2.

10. Faites passer 5 CV d’eau (B2) puis 5 CV de tampon A (A1) à un débit de 10 mL/min en mode
« Inject ».
→Mettre l’alarme de pression à 0.5 MPa.

11. Faites passer 5 CV de tampon C (B1) puis 10 CV de tampon A (A1) à un débit de 10 mL/min
en mode « Manual Load ».
→Les deux points précédents permettent d’équilibrer la colonne avant usage
en rinçant l’éthanol contenu dans la colonne puis en éluant les impuretés
avec le tampon d’élution et, finalement, de l’équilibrer avant de procéder.

12. Stoppez le programme et insérez 50 tubes dans le collecteur de fractions.

13. Démarrez un nouveau programme en mettant l’alarme de pression à 0.5 MPa.

14. Faites passer 1 à 2 CV de tampon A (A1) à un débit de 5 mL/min.

15. À l’aide d’un embout de seringue, prélevez votre échantillon puis insérez la seringue dans
la valve d’injection. Chargez la boucle d’injection de 10 mL avec votre échantillon en
prenant garde à ne pas insérer de bulles d’air. Après avoir vidé la seringue, laissez celle-ci
en place.

16. Dans la même commande, commencez la collecte de fractions de 3 mL, passez la valve
d’injection en mode « Inject », faites un blanc pour l’UV (fonction « Autozero UV ») et
changez le débit à 1 mL/min.

17. Faites vérifier vos commandes à votre démonstrateur avant de les exécuter.

18. Laissez se faire l’injection jusqu’à ce que le niveau de l’absorbance à 280 nm retrouve un
niveau de base (<50mAU).
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19. Remettez la valve d’injection en mode « Manual load » puis augmentez le débit à 5
mL/min. Dans le cas où l’absorbance à 280 nm varie, attendez qu’elle se stabilise de
nouveau avant de passer à l’étape suivante.

20. Procédez à un lavage en faisant passer 10 CV de tampon B (A2).

21. Procédez à une élution avec le Tampon C (B1).

22. Mettez fin au programme puis basculez vers le module d’évaluation. Avec l’aide du
démonstrateur, retrouvez votre chromatogramme puis enregistrez-le.

23. Pour chaque pic obtenu, rassemblez, dans un tube 15 ou 50 mL, les fractions qui le
constituent, notez le volume obtenu puis prélevez un aliquot de 100 µL du pic. Vous aurez
donc 3 aliquots : FT-His, Wash-His et Elut-His. Le volume d’élution choisi devrait être
inférieur à 11 mL.
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4. Chromatographie échangeuse d’ions

Théorie :
La chromatographie échangeuse d’ions est une technique de purification qui permet la
séparation des protéines selon leur charge. En effet, cette technique utilise une phase immobile
sur laquelle sont fixés des groupes chargés positivement (échangeuse d’anions) ou négativement
(échangeuse de cations).
La protéine d’intérêt, pour fixer ce groupe, doit posséder une charge nette positive ou
négative. Pour cela, le pH du milieu dans lequel se fait cette chromatographie doit être
suffisamment éloigné du point isoélectrique (noté pI qui est le pH où la charge nette de la protéine
est nulle).
Vous trouverez, à la Figure 2, la charge nette de la protéine Cas9 en fonction du pH du
milieu. Celle-ci possède une charge positive si le pH est inférieur à son pI (9) et une charge négative
si le pH est supérieur à son pI.
Les protéines sont plus ou moins sensibles à des pHs qui s’éloignent du pH neutre. Dans le
cas de Cas9, nous devons rester à des valeurs de pH comprises entre 7 et 8. On peut voir que, à
ces valeurs, la protéine est globalement positive. Si nous utilisons une résine échangeuse de
cations, la protéine se fixera donc à la colonne. À l’inverse, si nous utilisons une résine échangeuse
d’anions, la protéine Cas9 ne s’y fixera pas.
Nous allons donc utiliser une résine échangeuse d’anions. Celle-ci nous permettra de
purifier la protéine des contaminants qui se fixeront, eux, à la résine. De plus, la protéine Cas9 fixe
de manière non spécifique l’ADN puisqu’elle possède une affinité pour les sites PAMs. La résine
peut également fixer l’ADN ne manière forte. Cela nous permettra donc d’éliminer toute trace
d’ADN lors de la purification de Cas9. Cette purification sera donc une purification d’exclusion
puisque les contaminants fixeront la colonne mais pas notre protéine à purifier.

200
Charge nette de la protéine Cas9

150

100

50

0
0 2 4 6 8 10 12
-50

-100
pH de la solution

Figure 2: Charge nette de la protéine Cas9 en fonction du pH.

Pratique :
Matériel nécessaire :
• Système ÄKTA
• Colonne HiTrap Capto Q 1 mL (GE Healthcare)
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Solutions nécessaires :
• 1 M KCl
• Tampon C (20 mM HEPES pH8.0, 500 mM KCl, 250 mM Imidazole, 10% Glycérol)
• Bécher d’eau ultrapure

24. Installez la colonne sur le système ÄKTA.

25. Insérez le tuyau A1 dans le Tampon C, A2 dans l’eau et B1 dans le 1 M KCl.

26. Amorcez et dégazez les pompes en aspirant avec une seringue 50 mL.
→N’oubliez pas de dégazer A1 et A2 et B1.

27. Faites passer 5 CV d’eau puis 5 CV de 1 M KCl à un débit de 2 mL/min en mode « Manual
Load ».
→Mettre l’alarme de pression à 0.3 MPa.

28. Faites passer 10 CV de tampon C à un débit de 2 mL/min en mode « Inject ».

→Les deux points précédents permettent d’équilibrer la colonne avant usage
en rinçant l’éthanol contenu dans la colonne puis en éluant les impuretés
avec le KCl et, finalement, de l’équilibrer avant de procéder à la purification.

29. Stoppez le programme et insérez 20 tubes dans le collecteur de fractions.

30. Démarrez un nouveau programme en mettant l’alarme de pression à 0.3 MPa.

31. Faites passer 1 à 2 CV de tampon C à un débit de 2 mL/min.

32. À l’aide d’un embout de seringue, prélevez votre échantillon puis insérez la seringue dans
la valve d’injection. Chargez la boucle d’injection de 10 mL avec votre échantillon en
prenant garde à ne pas insérer de bulles d’air. Après avoir vidé la seringue, laissez celle-ci
en place.

33. Dans la même commande, commencez la collecte de fractions de 5 mL, passez la valve
d’injection en mode « Inject », faites un blanc pour l’UV (fonction « Autozero UV »).

34. Faites vérifier vos commandes à votre démonstrateur avant de les exécuter.

35. Laissez se faire l’injection jusqu’à ce que le niveau de l’absorbance à 280 nm retrouve un
niveau de base (<50mAU).

36. Remettez la valve d’injection en mode « Manual load ».

37. Procédez à une élution avec 1 M KCl.

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38. Mettez fin au programme puis basculez vers le module d’évaluation. Avec l’aide du
démonstrateur, retrouvez votre chromatogramme puis enregistrez-le.

39. Rassemblez toutes les fractions du Flow-Through ainsi que toutes les fractions de l’Élution,
notez les volumes et conservez un aliquot de 100 µL de chacun. Identifiez-les FT-IEX et
Elut-IEX respectivement. Pour le Flow-Through, limitez les fractions récoltées à 10 mL.
 13

5. Dessalage de l’échantillon
Théorie :
Les colonnes de dessalage sont utilisées pour changer rapidement le tampon d’un
échantillon. Dans ce cas-ci, le dessalage nous permettra de mettre la protéine dans les conditions
idéales pour son activité et sa conservation. Suite à l’élution de la colonne HisTrap, la protéine est
dans un tampon contenant 250 mM d’imidazole. La présence d’imidazole n’est pas souhaitable et
peut gêner l’activité de Cas9. De plus, si la protéine est injectée dans les cellules, il faut s’assurer
que le tampon ne contient pas de molécules nocives pour les cellules.
La colonne de dessalage fonctionne comme une colonne de filtration sur gel. Son cutoff
est toutefois très petit. Pour la Sephadex G-25 que nous utiliserons, le cutoff est de 5000 Da. Tout
ce qui est d’une taille supérieure à 5 kDa (soit la majorité des protéines), sera directement exclu de
la colonne et celle-ci freinera uniquement tout ce qui est inférieur à 5 kDa (soit la majorité des sels).
La protéine sera donc éluée dans le nouveau tampon désiré.

Pratique :
Matériel nécessaire :
• Système ÄKTA
• Colonne HiPrep 26/10 Desalting 53 mL (GE Healthcare)

Solutions nécessaires :
• Tampon D 2X sans glycérol (40 mM HEPES pH7.5, 1000 mM KCl)
• Bécher d’eau ultrapure

40. Installez la colonne HiPrep 26/10 Desalting sur le système ÄKTA.

41. Insérez le tuyau A1 dans le Tampon D et A2 dans l’eau.

42. Amorcez et dégazez la pompe A en aspirant avec une seringue de 50 mL.

→N’oubliez pas de dégazer A1 et A2.

43. Faites passer 2 CV d’eau puis 3 CV de Tampon D à un débit de 15 mL/min en mode « Inject
».
→Mettre l’alarme de pression à 0.5 MPa.

44. Stoppez le programme et insérez 50 tubes dans le collecteur de fractions.

45. Démarrez un nouveau programme en mettant l’alarme de pression à 0.5 MPa.

46. Faites passer 5 à 10 mL de tampon D à un débit de 10 mL/min.

47. À l’aide d’un embout de seringue, prélevez votre échantillon puis insérez la seringue dans
la valve d’injection. Chargez la boucle d’injection de 10 mL avec votre échantillon en
prenant garde à ne pas insérer de bulles d’air. Après avoir vidé la seringue, laissez celle-ci
en place.
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48. Dans la même commande, commencez la collecte de fractions de 5 mL, passez la valve
d’injection en mode « Inject », faites un blanc pour l’UV (fonction « Autozero UV »).

49. Faites vérifier vos commandes à votre démonstrateur avant de les exécuter.

50. Laissez se faire l’injection jusqu’à ce que l’échantillon et le sel soient entièrement élués.

51. Mettez fin au programme puis basculez vers le module d’évaluation. Avec l’aide du
démonstrateur, retrouvez votre chromatogramme puis enregistrez-le.

52. Rassemblez les fractions comprenant l’échantillon de protéines sans le sel, notez le volume
et conservez deux aliquots de 50 µL (Cas9 pure).
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6. Préparation du gel SDS-PAGE

Théorie :
Un des moyens les plus communs pour analyser un mélange de protéines consiste à les
séparer par électrophorèse sur gel de polyacrylamide après leur dénaturation par le
dodécylsulfate de sodium (SDS).
La résolution d’un gel SDS-PAGE, soit la capacité à séparer les bandes de protéines entre elles,
dépend directement du pourcentage d’acrylamide choisi dans le gel de séparation. Le
Tableau II présente la plage de séparation des protéines en fonction de la concentration en
acrylamide.

Tableau II : Plages de séparation des protéines pour différentes concentrations en polyacrylamide pour un
SDS-PAGE.
Concentration en polyacrylamide Plage de séparation
5% 75kDa - 300kDa
7,50% 50kDa - 200kDa
10% 35kDa - 150kDa
12% 15kDa - 100kDa
15% 10kDa - 50kDa
18% 5kDa - 40kDa

Pratique :
Matériel nécessaire :
• Kit de montage pour gel SDS-PAGE

Solutions nécessaires :
• Tampon inférieur 4X
ATTENTION
• Tampon supérieur 4X L'acrylamide est un produit neurotoxique.
• Acrylamide 30% et TEMED Lors de la manipulation des solutions
• APS 10% frais contenant de l'acrylamide, vous devez
• Isopropanol porter des gants.

53. Montez les plaques de verre afin de couler 1 gel comme représentés sur la Figure 3.

Figure 3: Montage des plaques de verre pour la préparation du gel SDS-PAGE.

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54. Pour faire 1 gel de séparation à 7.5% de 1.5mm d’épaisseur, mélangez dans l’ordre :
• 2.5 mL Tampon Inférieur 4X (+SDS)
• 2.5 mL Acrylamide 30%
• 5 mL Eau distillée
À ajouter seulement
• 8 μl TEMED
immédiatement avant
• 100 μl APS 10% de couler le gel

55. Dès que l’APS est ajouté, vortexez et versez la solution entre les plaques de verre.
Remplissez jusqu'à environ 1 cm sous la position qu'occupera le peigne.

56. Ajoutez ensuite délicatement une couche (1-2 mm) d’isopropanol au-dessus de la solution
d'acrylamide.

57. Laissez polymériser le gel inférieur à température ambiante pendant 30 minutes à 1 heure.

58. Enlevez la couche d'isopropanol sur le gel de séparation en renversant les plaques et rincez
à l'eau distillée (2 fois).

59. Pour faire 1 gel de concentration à 3%, mélangez dans l'ordre :

• 2.5 mL Tampon Supérieur 4X (+SDS)
• 5.5 mL Eau distillée
• 1 mL acrylamide 30%
À ajouter seulement
• 10 μL TEMED
immédiatement avant
• 100 μL APS 10% de couler le gel

60. À l'aide d'une P1000, coulez le gel de concentration au-dessus du gel de séparation.
Insérez immédiatement le peigne (moule pour les puits) entre les plaques. Éviter
l’emprisonnement de bulles en dessous des dents du peigne. Le peigne permet la
formation de 10 puits.

61. Laissez polymériser à température pièce durant 20 à 40 minutes.

62. Conservez le gel au réfrigérateur en prenant soin de l’emballer avec un essuie-tout humide
et une pellicule de plastique transparente jusqu’au lendemain.
 17

7. Concentration de l’échantillon
Théorie :
Comme mentionné dans le préambule, la quantité de protéine Cas9 nécessaire lors de
chaque expérience d’édition de génome nécessite une grande quantité de protéine. De plus, la
protéine est transfectée directement dans les cellules que l’on souhaite modifiées. Ainsi, il est
nécessaire d’obtenir une grande concentration.
La concentration de la protéine peut se faire à l’aide d’un Amicon qui est un tube contenant
un filtre ne laissant passer que les molécules en dessous d’un certain poids moléculaire
(« Molecular Weight Cut Off » ou MWCO) et retenant les autres en les concentrant. Ici, notre
protéine ayant un poids moléculaire de 161 kDa, nous utiliserons un Amicon ayant un MWCO de
50 kDa, c’est-à-dire retenant les protéines ayant un poids moléculaire supérieur à 50 kDa.
Pratique :
Matériel nécessaire :
• Amicon Ultra 100K
• Centrifugeuse de table Sorvall Legend X1R

63. Remplissez le réservoir de l’Amicon avec un maximum de 5 mL de la protéine Cas9 purifiée

rassemblé à l’étape 52.

64. Centrifugez à 4696 g dans la centrifugeuse de table Sorvall Legend X1R durant 5 min à
20°C. Équilibrez avec un tube de 15 mL rempli d’eau.

65. Après 5 min, videz le filtrat et observez le niveau du liquide dans le réservoir.

66. Centrifugez à 4696g dans la Sorvall Legend X1R à raison de 5 min jusqu’à ce que le volume
d’échantillon dans le réservoir soit inférieur à 600 µL.

67. Périodiquement, mélangez la protéine concentrée avec un pipetman p1000. Mesurez la

concentration de la protéine à l’aide d’un Nanodrop.

68. Concentrez la protéine jusqu’à obtenir 10 mg/mL.

69. Récoltez l’échantillon dans le réservoir de l’Amicon et le transférer dans cryovial de 2 mL

identifié (numéro d’équipe, nom de l’échantillon, date et concentration de la protéine).
Avec le pipetman, mesurez le volume obtenu et ajoutez un volume égal de Glycérol 40%.

70. Mesurez à nouveau la concentration au Nanodrop avec un blanc contenant maintenant

du glycérol. La concentration devrait être d’environ 5 mg/mL.

71. Conservez également un aliquot de 10 µL pour analyse sur gel (Cas9 pure conc.). La
protéine Cas9 purifiée sera conservée à -80°C pour des expériences futures.
 18

8. Calibration de la colonne de filtration sur gel et analyse de la protéine

purifiée
Théorie :
La filtration sur gel est une technique de chromatographie basée sur la séparation des
protéines selon leur poids moléculaire mais également leur forme. Celle-ci peut être utilisée de
manière préparative ou analytique.
Dans le cas d’une filtration sur gel préparative, elle est régulièrement utilisée en fin de
purification comme étape de polissage de la purification. Cette étape permet de finaliser une
purification en en enlevant toute trace de contaminants et en ajustant le pH ou les sels requis pour
conserver la protéine purifiée.
Dans le cas d’une filtration sur gel analytique, elle est utilisée pour vérifier le niveau de pureté
de l’échantillon et/ou déterminer le poids moléculaire de l’échantillon purifié. Dans ce cas, la
colonne est calibrée à l’aide de protéines pures de poids moléculaire connus. Le volume d’élution
de chaque protéine est ensuite noté afin de construire une courbe d’étalonnage du volume
d’élution observé en fonction du poids moléculaire. Par la suite, l’échantillon est injecté puis, grâce
au volume d’élution observé, le poids moléculaire est calculé. Cette technique présente de
nombreux avantages par rapport à un gel SDS-PAGE. En effet, la détermination du poids
moléculaire peut être fait dans des conditions natives et en présence ou absence d’un ou plusieurs
additifs (e.g. ions, métaux, détergents, …). Pour ces raisons, la filtration sur gel peut permettre de
déterminer si la protéine forme des polymères et les conditions de la formation.
Afin d’observer une bonne résolution, le choix de la colonne est essentiel. Celles-ci ont une
plage de fractionnement spécifique dépendamment de la taille des billes constituants la résine.
De plus, la hauteur de la colonne est un facteur important pour permettre une bonne résolution.
À la suite de la calibration, le volume d’élution des pics est noté afin de mesurer le volume mort
de la colonne (Vo), correspondant au pic d’élution du Bleu Dextran, ainsi que le Kav de chaque pic
donné par la formule : Kav = (Ve-Vo)/(Vc-Vo) avec Vc, volume total de la colonne, Vo le volume mort
et Ve le volume d’élution du pic.
Le volume total (Vc) est inscrit sur la colonne utilisée ou déterminé à l’aide d’une molécule très
petite. Ici nous utiliserons la vitamine B12.

Pratique :
Matériel et solutions nécessaires :
• Superose 6 3.2/300 GL (GE Healthcare)
• Tampon D 2X sans glycérol (40 mM HEPES pH7.5, 1000 mM KCl)
• Bio-Rad Protein Standards (Thyroglobulin (670 kDa) ; γ-globulin (158 kDa) ; Ovalbumin (44
kDa) ; Myoglobin (17 kDa) ; Vitamin B12 (Vc))
• Blue Dextran 20 mg/mL (Vo)

72. Dans un tube mélangez 25 µL des standards de protéine Bio-Rad et 6,2 µL de Bleu Dextran.

73. Insérez le tuyau A1 dans le Tampon D et A2 dans l’eau.

74. Amorcez et dégazez les tuyaux A1 et A2.

75. Installez la colonne Superose 6 sur le système AKTA ainsi qu’une boucle d’injection de 10
 19

µL.

76. Faites passer 1 mL d’eau (A2) puis environ 3 mL de Tampon D à un débit de 0.1 mL/min.
→Mettre l’alarme de pression à 2.4 MPa.

77. Pendant ce temps, rincez manuellement la boucle d’injection à l’aide de 2 mL du Tampon

D.

78. Stoppez le programme.

79. Démarrez un nouveau programme en mettant l’alarme de pression à 2.4 MPa.

80. Faites passer 200 à 500 µL de Tampon D à un débit de 0.1 mL/min.

81. À l’aide d’un embout spécial, prélevez le mélange de calibration préparé à l’étape 72 puis
insérez la seringue, avec l’embout, dans la valve d’injection. Chargez la boucle d’injection
de 10 µL avec votre échantillon en prenant garde à ne pas insérer de bulles d’air. Après
avoir vidé la seringue, laissez celle-ci en place.

82. Dans la même commande, passez la valve d’injection en mode « Inject » et faites un blanc
pour l’UV (fonction « Autozero UV »).

83. Faites vérifier vos commandes à votre démonstrateur avant de les exécuter.

84. Laissez se faire l’injection jusqu’à la fin de la migration (2.4 à 3 mL après l’injection).

85. Passez la boucle en mode « Manual Load ».

86. Remplacez la boucle de 10 µL par une boucle de 20 µL puis rincez manuellement la boucle
d’injection avec 2 mL de Tampon D.

87. À l’aide d’un embout spécial, prélevez 50 µL de l’un des deux aliquots de Cas9 conservés à
l’étape 52 puis insérez la seringue dans la valve d’injection. Chargez la boucle d’injection
avec votre échantillon en prenant garde à ne pas insérer de bulles d’air. Après avoir vidé
la seringue, laissez celle-ci en place.

88. Dans la même commande, passez la valve d’injection en mode « Inject » et faites un blanc
pour l’UV (fonction « Autozero UV »).

89. Faites vérifier vos commandes à votre démonstrateur avant de les exécuter.

90. Laissez se faire l’injection jusqu’à la fin de la migration (2.4 à 3 mL après l’injection).

91. Mettez fin au programme puis basculez vers le module d’évaluation. Avec l’aide du
démonstrateur, retrouvez votre chromatogramme puis enregistrez-le.
 20

92. Notez les volumes d’élution observés pour les protéines de calibration ainsi que pour le pic
de la protéine Cas9.

93. Tracez la droite de calibration de Kav en fonction de log(PM). Vous pourrez ainsi vérifiez la
qualité de l’échantillon de Cas9 purifié en vérifiant sa masse moléculaire ainsi que la
présence de contaminants (présence d’autres pics).
 21

9. Migration sur gel SDS-PAGE

Théorie :
Dans le but d’utiliser le gel pour évaluer la pureté et le rendement de la purification, nous
utiliserons le principe du volume relatif constant.
Deux méthodes de calculs existent pour charger un gel de protéine. La première est la
méthode de la quantité constante de protéines (Figure 4A). Celle-ci consiste à charger une quantité
constante (en µg) toutes les fractions suite à leur quantification. Toutefois, en supposant que la
première fraction est composée à 10% seulement de la protéine d’intérêt et la dernière à 90%,
nous observerons alors une augmentation de la taille représentant la protéine d’intérêt (Figure
4A).
La seconde méthode est celle du volume relatif constant (Figure 4B). Cette méthode consiste
à charger un pourcentage du volume total de la fraction concernée. Supposons que nous ayons
1 mg de protéine à purifier. La première fraction contiendra donc 1 mg de la protéine d’intérêt et
9 mg de contaminants dans 10 mL. La dernière, dans le cas d’un rendement de 100% et d’une
bonne purification, contiendra le même 1 mg dans 1mL et l’absence de contaminants. En
chargeant 0.1% du volume, nous chargerons 10 µL de la fraction I et 1 µL de la fraction III. Nous
chargerons donc 0.5 µg de notre protéine d’intérêt ainsi que 4.5 µg de contaminants avec la
fraction I et 0.5 µg de notre protéine dans la fraction III et 0 µg de contaminants. Nous observerons
alors la disparition des contaminants tandis que la bande représentant la protéine d’intérêt
diminuera seulement en fonction du rendement (Figure 4B).
La seconde méthode présente l’avantage, par rapport à la première, de refléter visuellement
le rendement et la purification de la protéine au cours de la manipulation. Cette méthode permet
de constater les pertes d’une fraction à l’autre.

Figure 4 : Gels SDS-PAGE représentant la visualisation de la purification d’une protéine en utilisant la méthode
de la quantité constante (A) ou la méthode du volume relatif constant (B). Les échantillons I, II et III correspondent
à des échantillons à mesure de la purification d’une protéine.
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Pratique :
Matériel nécessaire :
• Générateur de courant
• Appareil pour électrophorèse
• Plaque chauffante à 100°C

Solutions nécessaires :
• Laemmli 3X
• Tampon d’électrophorèse
• Marqueur de poids moléculaire Precision Plus de Bio-Rad (voir Annexe 3)
• Solution de coloration (10% acide acétique, 40% méthanol, 0.1% Coomassie Brillant Blue
R-250)
• Solution de décoloration (10% acide acétique, 40% méthanol)

94. En vous servant des volumes mesurés pour chacune des Fractions, remplissez le Tableau
III. Le volume à charger sur gel correspond à 0.15% du volume initial dans lequel la
Fraction a été prélevée.
→Si 0.15% vous donne plus de 20 µL, vous vous limiterez alors à 20 µL d’échantillon, tout en
gardant en tête cet aspect lors de l’analyse du rendement par la suite.

Tableau III : Tableau récapitulatif pour le chargement du gel SDS-PAGE

Volume lors du Volume à Volume de

Volume H2O Volume final
Fraction prélèvement charger sur gel Laemmli 3X
(µL) (µL)
(mL) (0.15%) (µL) (µL)

Lysat 10 30

FT-His 10 30

Wash-His 10 30

Elut-His 10 30

FT-IEX 10 30

Elut-IEX 10 30

Cas9 pure 10 30

Cas9 pure 10 30
conc.
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95. Préparez les tubes en mélangeant le volume de Fraction avec le Laemmli 3X et l’eau au
besoin afin d’obtenir des volumes finaux de 30 µL à charger sur un gel.

96. Chauffez les échantillons à 100°C pendant 2 minutes. Laissez ensuite refroidir et effectuez
une centrifugation rapide avant de procédez au chargement.

97. Procédez au montage du gel dans l’appareil et remplissez le réservoir avec du tampon
d’électrophorèse. Enlevez le peigne du gel.

98. Chargez 20 µL de chaque échantillon par puit et ajoutez 5 µL du marqueur de poids

moléculaire Precision Plus dans le premier puit.

99. Branchez l’appareil à un générateur de courant et faites migrer le gel à 150 Volts pour
environ 30 minutes ou jusqu’à ce que le front de migration arrive en bas du gel.

100. Récupérez délicatement le gel et enlevez le gel de concentration. Transférez le gel dans
une boîte et submergez-le de solution de coloration.

101. Laissez le gel incuber 30 minutes sous agitation dans la solution de coloration puis le rincez
avec de l’eau distillé et le submergez de solution de décoloration. Votre démonstrateur
transférera dans l’eau distillée après 3 heures de décoloration puis le prendra en photo.
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10.Essai fonctionnel de la protéine Cas9 purifiée

Théorie :
Il est primordial, suite à la purification, de s’assurer que la protéine est toujours
fonctionnelle. En effet, il peut y avoir de multiples raisons qui empêche la fonction de la protéine.
Celle-ci peut nécessiter des modifications post-traductionnelles obligatoires pour la fonction. Pour
cette raison, son expression dans des bactéries empêchera sa bonne fonction. De plus, la protéine
a passé un certain temps à température pièce et, si elle est sensible à la température, cela peut
entraîner sa dégradation ou sa dénaturation. La purification peut alors être faite à 4°C mais cela
nécessite un FPLC qui est constamment gardé dans une chambre froide afin d’éviter la formation
de condensation sur l’électronique. Finalement, certains tampons peuvent entraîner la
dénaturation ou l’inactivation de la protéine. Par exemple, certains métaux peuvent se fixer de
façon irréversible à la protéine et entraîner son inactivation. L’essai fonctionnel permet également
de s’assurer que la protéine purifiée est bien celle que l’on désire. Cet essai est donc toujours la
dernière étape d’une purification en vue de l’utilisation in vitro ou in vivo de la protéine.
Dans le cas de Cas9, la protéine est capable de cliver spécifiquement un ADN double-
brin contenant une séquence complémentaire à un ARN guide déterminé par l’utilisateur (Figure
4).

Figure 5: Clivage de l’ADN génomique par la protéine Cas9. La protéine Cas9 se lie à un ARN guide. Celui se lie à
l’ADN génomique en amont d’une séquence spécifique de 3 nucléotides appelée PAM. Si l’ARN est parfaitement
complémentaire à l’ADN, l’ADN génomique sera clivé sur les deux brins.

Afin de tester si Cas9 est capable de cliver de l’ADN double-brin à un endroit déterminé,
nous effectuerons une digestion in vitro d’une séquence d’ADN. L’ARN guide utilisé ici permettra
la reconnaissance d’une séquence spécifique sur le gène de l’histone H2B. Une portion de l’ADN
génomique contenant ce gène est donc amplifiée par PCR afin d’obtenir un ADN de 1550 paires
de bases. Les amorces utilisées sont placées de façon à ce que le site de reconnaissance de l’ARN
guide soit placé de façon asymétrique sur le produit de PCR. Si la protéine Cas9 purifiée est active,
la coupure du produit de PCR génèrera deux fragments de 1050 et 500 paires de bases (Figure 6).
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Figure 6: Clivage in vitro de l’ADN du gène H2B. La portion d’ADN génomique contenant le gène H2B est amplifiée
à l’aide d’amorces (flèches bleues), générant un fragment de 1550 pb. Le site de clivage est situé au 2/3 de ce
fragment. La coupure par Cas9 génère deux fragments de 1050 et 500 pb.

Comme Cas9 s’associe à l’ARN guide dans un ratio 1:1, nous mettrons la même quantité
de Cas9 et d’ARN guide dans l’essai. Toutefois, la coupure est moins efficace puisque l’enzyme
Cas9 est une enzyme du type single turnover enzyme, ce qui signifie que chaque protéine ne peut
couper qu’une fois l’ADN. Par la suite, elle reste fixée à la coupure et n’en génère pas d’autres. Pour
cette raison, il est nécessaire de garder le complexe Cas9:ARN guide en excès et d’avoir donc un
ratio Cas9 : ARN guide : ADN à cliver aux proportions 10:10:1 respectivement.

Pratique :
Matériel nécessaire :
• Générateur de courant
• Appareil et matériel pour gel d’agarose
• Plaque chauffante à 37°C
• Plaque chauffante à 80°C

Solutions nécessaires :
• Eau RNAse-Free
• Tampon Clivage Cas9 5X
• Votre protéine Cas9 purifiée à votre concentration (10 mg/mL = 62 µM)
• ARN guide H2B à 500 nM
• PCR H2B à cliver à 50 ng/µL (50 nM)
• Agar
• Bromure d’éthidium 1 mg/mL
• TAE 1X
• Orange-Dye 10X
• 2-log DNA Ladder (voir Annexe 4)

102. Coulez un gel d’agarose 1.5 % de 6 puits avec 40 mL de TAE 1X et 0.5 µg/mL de bromure
d’éthidium final.

103. Effectuez une dilution à 500 nM de la protéine Cas9 dans du Tampon de clivage 1X.
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104. Dans quatres tube de 1.5 mL, ajoutez les éléments selon le tableau ci-dessous :

ADN seul Cas9 : ADN ARN : ADN Cas9 : ARN : ADN

Eau 6 µL 4 µL 4 µL 2 µL
Tampon clivage 5X 2 µL 2 µL 2 µL 2 µL
ARN guide 500 nM - - 2 µL 2 µL
Cas9 500 nM - 2 µL - 2 µL
- Incubez 10 min à température pièce
ADN à cliver 50 nM 2 µL 2 µL 2 µL 2 µL

105. Incubez à 37°C pour 1h.

106. Incubez à 80°C pour 2 minutes.

107. Ajoutez 1 µL de Orange-Dye 10X dans chacune des réactions.

108. Une fois le gel polymérisé, transférez celui-ci dans le TAE 1X dans le bac à électrophorèse.

109. Chargez la totalité de chaque tube en prenant soin, dans le premier puits, de charger 15
µL de 2-log DNA Ladder.

110. Faites migrer 20 minutes à 100 V.

111. Observez le gel au ChemiDoc et prenez une photo.

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Annexe 1: Schéma annoté du système de FPLC ÄKTA Pure

 28

Annexe 2: Schéma illustrant les différentes positions de la valve d’injection.

 29

Annexe 3: Information concernant l’échelle de poids moléculaire Precision Plus

de Bio-Rad.
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Annexe 4: Information concernant l’échelle de poids moléculaire 2-log DNA

Ladder de NEB.