Cours BM Master Génétique Des Populations

Université Cheikh Anta Diop - Master de Génétique des Populations
MASTER de Génétique des Populations
Apports de la Biologie Moléculaire

pour la Détection du
Polymorphisme de l’ADN
Philippe Gauthier – IRD

UR022 Centre de Biologie et de Gestion des Populations
 Qu’est ce que l’ADN (structure et fonction) ?

 Qu’est ce que le polymorphisme de l’ADN ?
 Comment mettre en évidence le polymorphisme
de l’ADN ?
 Quelles utilisations peut on faire de la
connaissance du polymorphisme de l’ADN ?
La naissance de la biologie moléculaire (1)

Les lois de l’hérédité (Mendel, 1866)
• Modèle d’étude : le pois (Pisum sativum)
• Observation : existence de fruits jaunes ou verts, lisses ou ridés,
graines jaunes ou vertes, rondes ou irrégulières…
• Tests de croisement (auto ou allo-fécondation) et étude de la
distribution des ces caractères dans la descendance
 établissement des premières lois de l’hérédité
La théorie chromosomique de l’hérédité (Morgan, 1910)
• Modèle d’étude : la mouche du vinaigre (Drosophila melanogaster)
• Observation : existence de mutants aux yeux blancs chez les mâles
 mise en évidence d’une hérédité liée au sexe
• Travaux sur autres mutations
 première carte génétique, chromosomes = support de
l’hérédité
La naissance de la biologie moléculaire (2)

Le codage des protéines par les gènes (Garrod, 1902)
• Modèle d’étude : maladie métabolique humaine impliquant une
déficience enzymatique
• Observation : transmission de cette maladie à la descendance selon
les lois mendéliennes
 existence d’une relation entre gènes et enzymes
(protéines)
L’ADN, support biochimique de l’information génétique
• Griffith (1928) mène des expériences sur le pneumocoque
 mise en évidence d’un « facteur transformant »…
• Levene (1929) décrit de la composition de l’ADN
 bases azotées (A,T,C et G) + sucre + phosphate
• Avery (1944) purifie le « facteur transformant »
 ADN = support de l’information génétique
• Chargaff (1950) montre que l’ADN A/T et C/G = 1
 complémentarité des bases
La structure de l’ADN (Watson & Crick, 1953)
• Rassemblent toutes les données connues sur l’ADN

de l’ADN ?
La structure des acides nucléiques (1)

Les nucléotides
Constituants :
• Bases : purines A et G – pyrimidine C, T et U
• Ose (sucre) : ribose et désoxyribose
• Acide phosphorique

Les nucléotides
Nomenclature :
• Purines (A, G) : « ine », « ylique »
• Pyrimidines (C, T, U) : « idine, « idylique »
• Nucléotides de l’ADN : désoxyribonucléotides (dNTPs)
• Nulcéotides des ARN : ribonucléotides

Caractéristiques générales
Liaison entre les nucléotides : liaison phosphodiester
Sens de lecture d’une chaîne de nucléotides : 5’ → 3’


L’ADN
Caractéristiques :
• Bases : A, T, C, et G
• Ose : désoxyribose
• Double chaîne : antiparallèle, complémentaire, hélicoïdale
5’ 3’
3’ 5’

L’ADN
Propriétés physico-chimiques :
• Dénaturation
• Absorption dans les UV
• Enroulement et compaction

Les ARN
Caractéristiques :
• Bases : A, U, C, et G
• Ose : ribose
• Simple chaîne
Les principaux types d’ARN

• ARNr (ribosomique)
• ARNt (de transfert)
• ARNm (messager)
La réplication de l’ADN
ADN
La réplication de l’ADN (1)
Le cycle cellulaire :
• Interphase
• Mitose (division cellulaire)
La mitose :
• Prophase
• Métaphase
• Anaphase
• Télophase
Les différentes étapes de la réplication :
1/ Déroulement de la de
 Le sens double hélice et est
la réplication séparations des brins d’ADN par
bidirectionnelle
la topoisomérase et l’hélicase
à partir des au réplication.
origines de niveau des origines de réplication.

3’
5’
5’ 3’
3’ 5’
3’
5’
2/ Stabilisation de l’ADN sous forme simple brin par les protéines

 La SSB
synthèse des nouveaux brins d’ADN s’effectue de 5’ vers 3’
et de3/manière
Synthèse d’amorces ARN
antiparallèle par la primase
et complémentaire.
4/ Synthèse du brin complémentaire par l’ADN polymérase

3’
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
3’ 5’ 3’
5’

3’
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
3’ 5’ 3’ 5’ 3’
5’
La réplication est:

- continue sur l’un des brins  brin avancé
- discontinue sur l’autre brin  brin retardé (fragments
d’Okazaki)


5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
5/ Destruction des amorces ARN par la RNase H

 La réplication
6/ Réparation de l’ADN
des lacunes est semi-conservative.
par l’ADN polymérase
7/ Ligation des fragments d’ADN synthétisés par la ligase
En résumé, la réplication s’effectue de manière :

• Bidirectionnelle à partir des origines de réplication
• Complémentaire avec possibilité de réparer les erreurs
d’appariement (activité exonucléase 3’ → 5’ de la polymérase)
• 5’ → 3’
• Antiparallèle
• Continue sur le brin avancé et discontinue sur le brin retardé
• Semi-conservative
Éléments nécessaires :
• ADN matrice
• Amorces ARN
• Désoxyribonucléotides : dATP, dTTP, dCTP et dGTP
• Nombreuses protéines (ADN polymérase, Primase etc.)
La Transcription de l’ADN
ADN ARNm
La Transcription de l’ADN (2)
L’unité de transcription :
Les différentes étapes de la transcription :
1/ Initiation
2/ Elongation
3/ Terminaison
 pré-ARNm
La maturation :
1/ Addition de la coiffe en 5’ et de la queue polyA en 3’
2/ Élimination des introns (épissage alternatif)
 ARNm
En résumé, la transcription s’effectue de manière :

• Complémentaire
• 5’ → 3’
• Anti-parallèle
• ADN matrice
• Ribonucléotides : ATP, UTP, CTP et GTP
• ARN polymérase
La Traduction de l’ARNm
ADN ARNm Protéines

La Traduction de l’ARNm (1)
Les différentes étapes de la traduction :
1/ Initiation
2/ Elongation
3/ Terminaison
Le polysome :
Le code génétique
• Code de 3 lettres, dégénéré
Le code génétique
• Universel
• Cadre de lecture
Si on considère par exemple la séquence suivante d'un ARNm :
ACG ACG ACG ACG ACG ACG ACG ACG ...
Les trois cadres de lecture possibles (en rouge) sont :
ACG ACG ACG ACG ACG ACG ACG ACG ...
A CGA CGA CGA CGA CGA CGA
CGA CGA ...
AC GAC GAC GAC GAC GAC GAC
GAC GAC ...
En résumé, la traduction peut se définir par :

• Une lecture des ARNm dans le sens 5’ → 3’ simultanément par
plusieurs ribosomes (polysome)
• Une synthèse des protéines par assemble d’acides aminés
• Un code génétique de 3 lettres, universel et dégénéré
• ARNm
• Ribosomes
• ARNt
• Acides aminés
• Enzyme aminoacyl-ARNt synthase
En conclusion…
• Structure de l’ADN :
alphabet de 4 lettres (nucléotides) qui constituent un langage
de 64 mots de 3 lettres (codons) pour écrire les phrases du
monde vivant (gènes).
• Fonction de l’ADN :
support de l’information génétique
ADN ARNm Protéines


de l’ADN ?
Le polymorphisme de l’ADN (1)
Remaniements chromosomiques
• Insertion
• Délétion
• Translocation
• Inversion
• Fusion
Mutations ponctuelles
• Substitutions : transitions et transversions
• Délétions
• insertions
Séquences répétées en tandem
Mécanismes générant du polymorphisme

• Erreurs de réparation
• Recombinaisons inégales
• Conversion génique
• Insertions de séquences mobiles
• Glissement intra-chromatidien
En conclusion…
• L’ADN peut présenter, à un endroit donné (locus), des
variations nucléotidiques (polymorphisme) définissant
différentes formes de séquences (allèles).
 étude des variations nucléotidiques en inter-spécifique
(phylogénie) ou en intra-spécifiques (génétique des
populations).
• Nécessité de pouvoir détecter et caractériser le polymorphisme
de l’ADN :
 outils et techniques de biologie moléculaire.

de l’ADN ?
Outils : les enzymes
Enzymes de restriction
• Endonucléases
• Site de restriction (palindrome)
• Coupure à bouts francs ou cohésifs
Enzyme de digestion autres que les enzymes de
restriction
• Exonucléases
• Endonucléases
Polymérases
• ADN
• ARN
Ligases
Outils : les amorces et les sondes
Séquences d’ADN définit à l’aide de logiciels

Complémentaires et spécifiques de certaines régions
d’ADN
Utilisation :
• Amorces marquées ou non : PCR
• Sondes marquées : identification de séquences d’ADN,
localisation de séquences d’ADN sur les chromosomes
Outils : les vecteurs et les cellules hôtes
Vecteur
• ADN circulaire
• Autoréplication dans les cellules hôtes
• Insertion d’ADN exogène
• Gènes de sélection
Cellules hôtes
• Microorganismes
• Compétentes
Techniques : extraction-purification d’ADN (1)
Principe :
• Extraction (digestion des tissus et lyse des cellules)
• Purification (séparation de l’ADN des autres constituants
cellulaires)
• Plusieurs techniques basées sur des principes différents :
 Phénol/chloroforme
 Kit Qiagen
 Kit Puregene
Application :
• Etape obligatoire de départ pour toutes les autres techniques !
Techniques : extraction-purification d’ADN (2)
Comparatif de différentes méthodes de purification

1 : la meilleure, 3 : la moins bonne
Techniques : PCR (1)
Principe :
• Mécanisme de la réplication de l’ADN
• Polymérase thermostable
• Amplification d’une région donnée d’ADN par répétition de
cycles de réplication (amplification exponentielle)
Les différentes étapes d’un cycle d’amplification

nucléotides
amorces
polymérase
1- Dénaturation de l’ADN double brin

2- Hybridation des amorces sur les brins d’ADN
3- Elongation des brins complémentaire
Application :
• Obtention d’ADN en grande quantité
• Etape nécessaire pour la réalisation de toutes les techniques de
détection du polymorphisme
• Identification d’espèces jumelles (amorces espèces spécifiques)
Techniques : migration électrophorétique
Principe :
• Séparation des fragments d’ADN en fonction de leur taille
• Coloration et visualisation des fragments
Application :
• Détermination de la taille des fragments d’ADN
• Évaluation de la quantité d’ADN
• Évaluation de la qualité d’ADN (dégradation, spécificité de
l’amplification par PCR)
Contrôle de la Contrôle de la
qualité et de la qualité et de la
quantité d’ADN quantité d’ADN
extrait amplifié par PCR
Techniques : PCR-RFLP (1)
Principe :
• Amplification par PCR
• Digestion du produit PCR par une enzyme de restriction
• Migration sur gel d’agarose (séparation fonction taille)
• Coloration et visualisation des bandes
Application :
• Polymorphisme de longueur (restriction)
• Régions connues
• Génotypage (identification d’allèles)
• Identification d’espèces jumelles
• Marqueur co-dominant (visualisation simultanée des différents
allèles)
Techniques : PCR-RFLP (2)
Identification d’allèles Identification d’espèces jumelles

Techniques : séquençage (1)
Principe :
• Amplification par PCR :
 ADN matrice = fragment amplifié par PCR
 Une seule amorce par réaction
 Nucléotides = dNTP + ddNTP fluorescents
• Migration sur gel d’acrylamide (séparation fonction taille)
• Visualisation à l’aide d’un laser
Application :
• Détermination de la séquence nucléotidique (détection de
mutations ponctuelles, délétions, insertions)
• Marqueur co-dominant
Techniques : séquençage (2)

Techniques : génotypage microsatellites (1)
Principe :
Amorces fluorescente
• Migration sur gel d’acrylamide (séparation fonction taille)
• Visualisation des fragments amplifiés
Application :
• Polymorphisme de longueur (nombre de répétition – glissement
intra-chramatidien)
• Identification d’allèles
Techniques : génotypage microsatellites (2)

Techniques : génotypage AFLP (1)
Principe :
• Digestion de l’ADN génomique
par deux enzymes de
restriction
• Ligation d’adaptateurs
• Amplifications par PCR
 Amorce fluorescente
 Nucléotides d’ancrage
• Migration sur gel d’acrylamide
(séparation fonction taille)
• Visualisation des fragments
amplifiés
Techniques : génotypage AFLP (2)
Application :
• Polymorphisme de longueur (restriction)
• Identification de nouveaux marqueurs
• Génome total, régions inconnues
• Marqueur dominant
Technique : génotypage SSCP (1)
Principe :
 une des amorces est fluorescente
• Migration sur gel d’acrylamide non-dénaturant (séparation
fonction conformation)
• Visualisation des fragments amplifiés
Application :
• Polymorphisme de conformation (la conformation 3D de
l’ADN dépend de sa composition en bases)
• Détection de changement de conformation (mutations
ponctuelles?, délétions? insertions ?)
Techniques : génotypage SSCP (2)

Techniques : clonage (1)
Principe :
• Création d’une banque de fragments d’ADN
• Recherche des fragments d’intérêt
Application :
• Isolement de fragments (marqueurs AFLP et SSCP,
recherche de marqueurs microsatellites etc.)
• Amplification de fragments
Création d’une banque

d’ADN génomique :
• Digestion du vecteur
• Digestion de l’ADN
génomique
• Ligation des fragments
dans les vecteurs
• Transformation des 2
1
bactéries
• Isolement des différents
clones cellulaires
• Sélection des clones 3 4
ayant incorporés un
fragment d’ADN 5
génomique
Recherche des
fragments d’intérêt :
• Transfert sur membrane 1
• Éclatement des
bactéries
2
• Fixation de l’ADN
• Hybridation d’une sonde
marquée
• Révélation 3
• Récupération des
bactéries et mise en 4
culture
• Séquençage
5
En conclusion…
• De nombreuses techniques permettent de détecter et de
caractériser le polymorphisme de l’ADN.
• Ces techniques sont sans cesse en évolution… mais elles sont
toujours basées sur un nombre limité d’outils (enzymes,
amorces/sondes te vecteur/cellules hôtes) et sur quelques
techniques de base (extraction, PCR et migration
électrophorétique.

de l’ADN ?
Travaux Pratiques
Sujet :
• Rongeurs du genre Mastomys comprenant 3 espèces jumelles
au Sénégal : M. natalensis, M. erythroleucus et M. huberti.
• Variation de la séquence nucléotidique du gène Cytochrome b,
au niveau de sites de coupure reconnus par l’enzyme de
restriction BsmAI
Travaux Pratiques
Techniques mises en œuvre :

• Extraction d’ADN à partir de tissus (oreille, doigt, queue)
• Migration électrophorétique (contrôle de l’extraction)
• PCR-RFLP :
 Amplification par PCR du gène du Cytochrome b
 Migration électrophorétique (contrôle de la PCR)
 Digestion du produit PCR par l'enzyme de restriction
BsmAI
 Migration électrophorétique (profil de restriction)
 Comparaison aux profils de référence et détermination de
l’éspèce

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 Qu’est ce que l’ADN (structure et fonction) ?

La naissance de la biologie moléculaire (1)

La naissance de la biologie moléculaire (2)

 Qu’est ce que l’ADN (structure et fonction) ?

La structure des acides nucléiques (1)

La structure des acides nucléiques (2)

La structure des acides nucléiques (3)

Sens de lecture d’une chaîne de nucléotides : 5’ → 3’

La structure des acides nucléiques (4)

La structure des acides nucléiques (5)

La structure des acides nucléiques (6)

Les principaux types d’ARN

La réplication de l’ADN (1)

La réplication de l’ADN (2)

Les différentes étapes de la réplication :

La réplication de l’ADN (2)

Les différentes étapes de la réplication :

2/ Stabilisation de l’ADN sous forme simple brin par les protéines

La réplication de l’ADN (2)

Les différentes étapes de la réplication :

La réplication de l’ADN (2)

Les différentes étapes de la réplication :

La réplication est:

La réplication de l’ADN (2)

Les différentes étapes de la réplication :

La réplication de l’ADN (2)

Les différentes étapes de la réplication :

5/ Destruction des amorces ARN par la RNase H

La réplication de l’ADN (3)

En résumé, la réplication s’effectue de manière :

La Transcription de l’ADN (2)

La Transcription de l’ADN (3)

Les différentes étapes de la transcription :

La Transcription de l’ADN (4)

La Transcription de l’ADN (5)

En résumé, la transcription s’effectue de manière :

ADN ARNm Protéines

La Traduction de l’ARNm (1)

Les différentes étapes de la traduction :

La Traduction de l’ARNm (2)

La Traduction de l’ARNm (3)

La Traduction de l’ARNm (3)

La Traduction de l’ARNm (4)

En résumé, la traduction peut se définir par :

ADN ARNm Protéines

 Qu’est ce que l’ADN (structure et fonction) ?

Le polymorphisme de l’ADN (1)

Le polymorphisme de l’ADN (2)

Le polymorphisme de l’ADN (2)

Mécanismes générant du polymorphisme

 Qu’est ce que l’ADN (structure et fonction) ?

Outils : les enzymes

Outils : les amorces et les sondes

Séquences d’ADN définit à l’aide de logiciels

Outils : les vecteurs et les cellules hôtes

Techniques : extraction-purification d’ADN (1)

Techniques : extraction-purification d’ADN (2)

Comparatif de différentes méthodes de purification

Techniques : PCR (1)

Techniques : PCR (2)