UNIVERSITE PARIS XI

UNITE DE FORMATION ET DE RECHERCHE

" FACULTE DE PHARMACIE DE CHATENAY MALABRY "

ANNEE 2001-2002 N°163/95

THESE

Présentée

A L’UNITE DE FORMATION ET DE RECHERCHE

" FACULTE DE PHARMACIE DE CHATENAY MALABRY "
de L’UNIVERSITE DE PARIS XI

Pour l’obtention du diplôme d’Etat de

DOCTEUR EN PHARMACIE
Par
Mr Grégory LAMBERT

Titre de la thèse :

NANOCAPSULES DESTINEES A L’ADMINISTRATION

D’OLIGONUCLEOTIDES ANTISENS

Soutenue le 27 Mai 2002

JURY :

Président : Prof. E. FATTAL (Directeur de thèse)

Membre : Prof. C. MALVY
Membre : Melle A. BOCHOT
A Marine
A mes parents

2
 Table des Matières

INTRODUCTION .......................................................................................................... 5

MATERIELS ................................................................................................................ 13

METHODES ................................................................................................................. 14

METHODES UTILISEES POUR LA PREPARATION DES NANOCAPSULES ET DES

NANOPARTICULES .......................................................................................................... 14

PREPARATION DES NANOCAPSULES ET ENCAPSULATION DE L’ODN MODELE POUR LES

ETUDES PHYSICO-CHIMIQUES ........................................................................................... 14

PREPARATION DES NANOCAPSULES VIDES POUR LES ETUDES PHYSICO-CHIMIQUES ......... 15

PREPARATION DE NANOSPHERES ET ADSORPTION D’ODN MODELE POUR LES ETUDES
PHYSICO-CHIMIQUES ........................................................................................................ 15

PREPARATION DES NANOCAPSULES CHARGEES EN ODN ANTISENS ET EN ODN CONTROLE

POUR LES ETUDES BIOLOGIQUES ...................................................................................... 16

METHODES UTILISEES POUR LES ETUDES PHYSICO-CHIMIQUES .................................. 16

MARQUAGE RADIOACTIF DES OLIGONUCLEOTIDES .......................................................... 16
MESURES DE LA TAILLE ET DU POTENTIEL ZETA DES NANOCAPSULES ............................. 17
MICROSCOPIE ELECTRONIQUE APRES CRYOFRACTURE (FFEM)....................................... 17
CRYODESSICATION .......................................................................................................... 18
COLORATION NEGATIVE ET MICROSCOPIE ELECTRONIQUE A TRANSMISSION ................... 18
DETERMINATION DU TAUX D’ENCAPSULATION DES ODN DANS LES NANOCAPSULES ...... 18
ETUDE DE LA LOCALISATION DES ODNS DANS LE CŒUR AQUEUX DES NANOCAPSULES .. 19
LIBERATION DE CALCEINE PAR LES NANOCAPSULES ........................................................ 20
METHODES UTILISEES POUR LES ETUDES BIOLOGIQUES .............................................. 20
STABILITE DES ODNS PHOSPHODIESTERS EN PRESENCE DE SERUM ................................. 20
STABILITE ET LIBERATION DES ODNS PHOSPHOROTHIOATES EN PRESENCE DE SERUM .... 21
ADMINISTRATION DES OLIGONUCLEOTIDES AUX SOURIS NUDE........................................ 22

RESULTATS ................................................................................................................ 24

3
ETUDES PHYSICO-CHIMIQUES ....................................................................................... 24
TAILLE ET MORPHOLOGIE DES PARTICULES ..................................................................... 24
TAUX D’ENCAPSULATION ET POTENTIEL ZETA ................................................................ 26
EXPERIENCES DE DIFFUSION DE LA CALCEINE ................................................................. 27
LOCALISATION DES ODN DANS LES NANOCAPSULES PAR QUENCHING DE FLUORESCENCE
........................................................................................................................................ 28
ETUDES BIOLOGIQUES ................................................................................................... 33
LIBERATION DE L’ODN PHOSPHOROTHIOATE A PARTIR DE NANOCAPSULES INCUBEES
DANS LE SERUM ............................................................................................................... 33

STABILITE DE L’ODN ENCAPSULE DANS DES NANOCAPSULES PLACEES DANS DU SERUM

PUR .................................................................................................................................. 36

ADMINISTRATION A LA SOURIS ........................................................................................ 42

DISCUSSION................................................................................................................ 45

ETUDES PHYSICO-CHIMIQUES ....................................................................................... 45

STABILITE DU SYSTEME ................................................................................................... 45
LOCALISATION ET STABILITE DES OLIGONUCLEOTIDES .................................................... 49
LIBERATION DES OLIGONUCLEOTIDES DANS LE SERUM .................................................... 53
ETUDES BIOLOGIQUES ................................................................................................... 54
PROTECTION DES OLIGONUCLEOTIDES ............................................................................. 54
EFFET IN-VIVO DES NANOCAPSULES DE PIBCA CHARGEES EN OLIGONUCLEOTIDES
ANTISENS EWS-FLI1. ...................................................................................................... 55

CONCLUSION ............................................................................................................. 56

RESUME ....................................................................................................................... 59

REFERENCES ............................................................................................................. 62

4
 Introduction

Les oligonucléotides antisens (ODNs) sont des fragments

synthétiques d'ADN présentant des séquences de bases
complémentaires à un ARN messager. Grâce à leur capacité de
s’hybrider aux cibles ARN, les ODNs peuvent sélectivement
moduler l'expression de gènes [1] (Figure 1). Ce mécanisme est
appelé arrêt de traduction. Un autre mécanisme qui a été largement
décrit est la destruction d'hybrides antisens / ARNm par une
enzyme, la RNASE H [2]. L’inactivation de l’expression d’un gène
par des oligonucléotides peut aussi être également obtenue par la
formation d’une triple hélice entre l'ADN double-brin génomique et
l’oligonucleotide (Figure 1). Cette liaison spécifique est réalisée par
des liaisons hydrogènes entre la thymidine et les paires de bases
TA et entre la cytosine et les paires de bases CG [3]. Un autre
mécanisme d’inactivation de l’ARN est médié par les ribozymes. Les
extrémités 5' et 3' de ces ribonucleotides sont complémentaires à
l'ARN cible et contiennent une boucle en épingle à cheveux, qui
incite le clivage de l'ARN cible [4]. Cependant, les ribozymes
présentent les mêmes limites que les ARN antisens. Finalement, il a
été récemment décrit qu’il est possible de cliver une structure en
épingle à cheveux dans une cible ARNm par un ODN antisens fixé
aux deux côtés de l'épingle à cheveux en présence d’ions Cu2 + et
d’un agent de réduction [5].

5
 Arrêt de la traduction
Codon d’initiation ARNm

Formation de Antisense
Triple hélice Ribosome

ADN Cytoplasme Protéine

Rnase H
Noyau AUG ARNm

Antisense
Ribosome
Mécanisme Rnase H

Figure 1 : Principaux mécanismes de la stratégie antisens..

Les oligonucleotides sont donc des composés de phosphodiesters

naturels (Figure 2). Cependant, des problèmes cruciaux comme la
faible stabilité de ces oligonucleotides vis-à-vis des nucléases in
vitro et in vivo ainsi que leur faible pénétration intracellulaire ont
limité leur utilisation en thérapeutique [6, 7]. En conséquence, les
applications pratiques des oligonucleotides antisens ont exigé des
modifications chimiques ayant pour but de conserver leur capacité
hybridation tout en augmentant leur stabilité et leur pénétration
cellulaire.

Les modifications chimiques se sont principalement concentrées sur

le squelette phosphodiester et/ou sur le sucre (Figure 2). Le
remplacement de l'oxygène libre du squelette phosphodiester par un
groupement sulfure aboutit à un phosphorothioate (PS) présentant
une stabilité augmentée (Figure 2). Bien que le duplex formé avec
l'ARN cible ait une température de dissociation inférieure (Tm)
(c'est-à-dire une moins grande affinité) que dans le cas du composé

6
de phosphodiester, il reste un substrat pour RNASE H. Une autre
approche est le remplacement de l'oxygène libre du squelette
phosphodiester par un méthyle qui aboutit à une plus grande
hydrophobicité en raison de la perte de la charge négative.
Cependant dans ce cas, l'activation de la RNASE H est aussi
réduite. Alternativement, le remplacement de l'hydrogène présent en
position 2' sur le désoxyribose par un groupe hydroxyméthyle
convertit le sucre en ribose modifié. Les hybrides ARN/ARN formés
avec l'ARN cible sont plus stables. On peut aussi modifier le
squelette désoxyribose phosphate comme dans les PNA (peptide
nucleic acid) [8]. Ainsi, par ces modifications on peut synthétiser sur
mesure des ODNs antisens en équilibrant les caractéristiques
d'affinité d’hybridation, l’hydrophobicité et la capacité d’activation de
la RNASE H.

Figure 2: Différent types de modifications chimiques des

oligonucleotides

7
Bien que ces modifications chimiques aient permis une amélioration
de stabilité et de la pénétration dans les cellules, elles ont aussi
abouti à une variété d'activités non spécifiques. Ainsi, l’évaluation
d’un ODN antisens basée sur la mesure de l'activité
pharmacologique seule est insuffisante et peut induire en erreur.
L'effet aptamère est lié au fait que les oligonucleotides peuvent
former des structures tridimensionnelles [9]. Les oligonucléotides
aptamères sont capables de se lier à des récepteurs, des enzymes
et d'autres protéines et ainsi, affecter leur fonction de façon non
spécifique. Les oligonucléotides contenant des motifs de quatre G
répétés interagissent avec des protéines [10, 11]. De plus, les
oligonucléotides phosphorothiates sont connus pour se lier à un
grand nombre de protéines indépendamment de leur séquence [12].
Ils peuvent aussi affecter l’agrégation des plaquettes et les
systèmes du complément [13].

Ainsi, pour augmenter la stabilité des oligonucléotides, pour

améliorer leur pénétration dans les cellules et limiter l’effet aptamère
non spécifique, l'utilisation de transporteurs colloïdaux comme les
liposomes ou les nanoparticules peut être proposée. Des
transporteurs colloïdaux seraient capables de protéger les
oligonucléotides phosphodiesters naturels contre la dégradation et
puisqu'ils sont endocytés, ils pourraient aussi augmenter la
pénétration des oligonucléotides dans les cellules (Figure 3). Parmi
des transporteurs de principes actifs, des nanoparticules
biodégradable ou pas ont montré des potentialités intéressantes
pour l’administration d ‘oligonucléotides [14].

8
 A-Déstabilisation Endocytose
des endosomes
ARN

ODNs
ADN
Noyau
B-Diffusion hors
des endosomes

Cellule

Figure 3 : Mécanisme d’internalisation et mécanisme hypothétique

de libération intracellulaire d’oligonucléotides associés à des
nanoparticules biodégradables.

En raison de leur caractère à la fois hydrophile et poly anionique, les

ODNs interagissent mal avec les matériaux polymères qui sont
généralement hydrophobes et négativement chargés, c'est le cas
des polyalkylcyanoacrylates (PACA) et de l'acide polylactique (PLA).
Ainsi, l'association des ODNS avec des nanoparticules est difficile.
Dans la plupart des cas, les ODNs ont été associés à la surface de
nanosphères par des interactions électrostatiques; Chavany et al.
[15] a tiré profit de la formation de paires d'ions entre les groupes de
phosphate négativement chargés de la chaîne d’acides nucléiques
et un composé positivement chargé comme le bromure de
cétyltrimethylammonium (CTAB), pré-adsorbé sur des nanosphères
de PACA. Il a été montré que ce type d'association en surface est
rapidement réversible en présence des milieux biologiques riches en
protéines [16, 17]. De plus, lorsqu’ils interviennent dans des liaisons
électrostatiques, les ODNs adoptent une conformation qui les rend

9
peu susceptibles de reconnaître leur cible biologique [18]. Ainsi, afin
de conserver l’activité optimale des ODNs, le système de
transporteur idéal serait un système dans lequel les ODNs seraient
pris au piège dans le cœur interne de nanocapsules polymériques
afin de les masquer et de les protéger des interactions avec les
protéines. Jusqu'à présent, toutes les méthodologies décrites pour
la préparation de nanocapsules impliquent la préparation
d'émulsions, soit huile dans eau qui mènent à des nanocapsules
avec un cœur huileux suspendues dans l'eau [19-21], soit
d’émulsions eau dans huile qui mènent à des nanocapsules avec un
cœur aqueux suspendues dans l’huile [22]. Les nanocapsules à
contenu huileux ne sont pas adaptées à l’encapsulation d’ODNs
hydrosolubles et les nanocapsules à contenu aqueux, suspendues
dans une phase huileuse ne pas adaptées à une administration i.v..
C’est pour cela que, dans cette étude, nous avons développé un
nouveau processus de préparation de nanocapsules avec un cœur
aqueux contenant des ODNs, ces nanocapsules peuvent être re-
suspendues dans un milieu aqueux. Nous avons démontré que les
ODNs sont placés dans le cœur de ces nanocapsules, ce qui
explique pourquoi ce transporteur protège les ODNs plus
efficacement contre la dégradation enzymatique que les
nanosphères décrites précédemment [23, 24].

Les sarcomes d'Ewing et les tumeurs neuroectodermales primitives

(PNETs) sont des tumeurs malignes caractérisées sur un plan
histologique par des petites cellules rondes, uniformes, densément
empaquetées, avec des noyaux ronds sans nucléoles et un
cytoplasme indistinct. Le sarcome d'Ewing et les PNETs sont des

10
expressions biologiques de la même tumeur [25]. Le caryotype
d'Ewing, t (11; 22) (q24; q12), est retrouvé dans approximativement
90 % des syndromes d’Ewing et des PNETs [26]. Les études
cytogénétiques du sarcome d'Ewing et des PNETs ont identifié un
changement du locus EWS sur le chromosome 22, bande q12.
Caractéristiquement, le terminus amino du gène EWS est juxtaposé
avec le terminus carboxy fourni par le gène Fli-1, un membre de la
famille des facteurs de transcription Ets, localisé sur le chromosome
11 bande q24 [27]. La translocation aboutit à la fusion du gène EWS
avec le gène du facteur de transcription Fli-1, menant à une
transcription hybride et une protéine chimérique oncogène qui peut
être un activateur puissant de transcription d'ADN inopportun [28].
Des études récentes ont montré qu’une expression stable d'antisens
EWS Fli-1 obtenue par transfection d’un plasmide dans des cellules
de sarcome d'Ewing a abouti à la disparition partielle de la protéine
EWS Fli-1 et à la suppression de la croissance des cellules [29].
Cela a suggéré un rôle possible des produits de fusion dans la
tumorigénèse. La fréquence remarquable des transcriptions
hybrides annoncées par Delattre et al. [30] peut permettre
d’envisager une thérapie génétique spécifique pour des sarcomes
d’Ewing. Ce transcript de fusion incorrect pourrait être visé et inhibé
par des oligonucléotides antisens spécifiques.

Nous avons appliqué les nanocapsules de PACA à cœur aqueux à

l'encapsulation d’ODNs phosphorothioates dirigés contre l'ARN
chimérique EWS Fli-1. Ces nanocapsules chargées en ODNs ont
été administrées à des souris nudes portant une tumeur apparentée
au sarcome d’Ewing afin d’évaluer in vivo l'efficacité de ce nouveau

11
système de délivrance. Nous avons montré que l’utilisation des
nanocapsules est une condition nécessaire pour obtenir un effet
antisens à faible dose, in vivo [31].

12
 Matériels

L’ODN modèle oligothymidilate phosphodiester de 20-mer, les

ODNs phosphorothioates antisens et sens, ont été fournis par
Eurogentec (Belgique). La séquence de l’ODN antisens (AS ODN)
correspond aux nucléotides 832-856 du type 1, employé par Tanaka
et al. [32] : 5 ‘-GAC-TGA-GTC-ATA-AGA-AGG-GTT-CTG-C-3’;.
L’oligonucléotide sens (SE ODN) a été employé comme contrôle :
5’-GCA-GAA-CCC-TTC-TTA-TGA-CTC-AGT-C-3’. Le [γ-33P] ATP
(111 TBq/mmol) provenait de Dupont de Nemours (France) et la T4
polynucléotide kinase de New England Biolabs (MA, ETATS-UNIS).
Le liquide de scintillation employé était l’Ultima GoldTM (Packard
Bioscience, Pays-Bas). Le Miglyol 812 (des triglycérides à chaînes
moyennes) a été fourni par Lambert Rivière (France) et le Montane
80 (sorbitan monooleate) par Seppic (France).
L’Isobutylcyanoacrylate (IBCA) était de Loctite (Irlande), le Bromure
de cétyltrimethylammonium (CTAB) et la calcéine de Sigma
(France). Le Dextran 70 a été obtenu de Fluka (France). Les
fibroblastes Murins NIH-3T3, stablement transfectés par le gène de
fusion EWS Fli-1 [33], ont été fournies par Frederic Subra.

13
 Méthodes

Méthodes utilisées pour la préparation des nanocapsules et

des nanoparticules

Préparation des nanocapsules et encapsulation de l’ODN modèle

pour les études physico-chimiques

200 µl d'éthanol ont été ajoutés à 800 µl d'eau déminéralisée

contenant l’oligothymidylate modèle dans des concentrations
diverses de 0 à 10 µM, le tout a été ajusté à pH 7,4 par ajout de
NaOH 0.1 M. Cette solution (1 ml) a été ajoutée à une phase
organique contenant 8 g de Miglyol 812 et 1,5 g de Montane 80 en
agitant vigoureusement grâce à un Ultraturrax (1 minute, 24 000 tr-
min). 100 µg du monomère, IBCA a été alors ajouté lentement à
l'émulsion qui est laissée sous agitation mécanique à 500 tr-min.
Après 4 heures, la polymérisation est complète et les gouttelettes
d'eau ont été entourées par le polymère, menant ainsi à la formation
de nanocapsules avec un cœur aqueux contenant l'ODN. La re-
suspension de nanocapsules dans un milieu aqueux a été réalisée
par ultracentrifugation à 37 000 g pendant 30 minutes dans un tube
de centrifugeuse qui a été rempli de 700 µl d'eau déminéralisée et
700 µl de la suspension. Après avoir traversé la phase huileuse,
l'interface et la phase aqueuse, les nanocapsules ont formé un culot
qui a ensuite été re-suspendu dans 1,5 ml d'eau déminéralisée par
vortexation (1 minute) suivie d’une sonication (30 s). Afin d’ôter
l'huile résiduelle, la suspension a subit une nouvelle centrifugation et
le culot a été re-suspendu dans 700 µl d'eau déminéralisée comme

14
décrit ci-dessus. Cela a abouti à la préparation de nanocapsules
dispersées dans une phase aqueuse avec un cœur aqueux
contenant l'ODN (ODN/NC).

Préparation des nanocapsules vides pour les études physico-

chimiques

Pour les essais d’extinction de fluorescence (voir ci-dessous), les

nanocapsules ont aussi été préparées sans ODN. Dans ce cas,
l’ODN a été simplement ajouté à la suspension de nanocapsules
(NC+ODN) ou adsorbé à la surface de nanocapsules
(NC+CTAB+ODN) (14) en pré adsorbant un cation hydrophobe, le
CTAB, sur la surface des particules. Ceci a engendré la formation
de paires d’ions entre les charges positives du CTAB et les charges
négatives des groupes phosphates des ODNs. En pratique, 100 µl
d'une solution CTAB (1,5 mM) contenant l’ODN à 10 µM a été
ajouté à 100 µl de la suspension de nanocapsules et à 800 µl de
Tris-HCl (10 mM, pH 7,4) sous agitation magnétique lente.
L’agitation a été alors maintenue pendant 2 h.

Préparation de nanosphères et adsorption d’ODN modèle pour les

études physico-chimiques

Des nanosphères présentant l’ODN adsorbé sur leur surface

(NS+CTAB+ODN) ont été préparées pour fournir un contrôle pour
les études de dégradation des ODN. Pour cela, un processus de
polymérisation en émulsion précédemment décrit a été utilisé (14,

15
22). Ce contrôle a aussi permis de comparer la protection des ODN
fournie par les deux systèmes dans des conditions semblables.

Préparation des nanocapsules chargées en ODN antisens et en

ODN contrôle pour les études biologiques

200 µl d'eau déminéralisée contenant les ODN à 2,5 mM, ajustée à

pH 7,4 par ajout de NaOH 0,1 M ont été ajoutés à une phase
organique contenant 2 g de Miglyol 812 et 0,25 g de Montane 80
sous agitation vigoureuse par Ultraturrax (1 minute, 24 000 tr-min).
10 mg de monomère, IBCA a été alors ajouté lentement à l'émulsion
qui est restée sous agitation mécanique à 500 tr-min. Après 4
heures, la polymérisation était complète et les gouttelettes d'eau se
trouvant entourées par le polymère, menant ainsi à la formation de
nanocapsules avec un cœur aqueux contenant l’ODN antisens. La
re-suspension des nanocapsules dans un milieu aqueux a été
réalisée comme décrit précédemment. Le culot a été re-suspendu
dans 2,5 ml d'eau déminéralisée comme décrit plus haut. Cela a
abouti à la préparation de 2,5 ml d'une suspension aqueuse de
nanocapsules contenant l'ODN dans leur cœur aqueux.

Méthodes utilisées pour les études physico-chimiques

Marquage radioactif des oligonucléotides

Les ODNs ont été marqués à leur extrémité 5' par l'utilisation de [γ-
33P] ATP et de T4 polynucléotide kinase. La purification des ODNs
a été réalisée par filtration sur gel en employant des colonnes

16
Biospin 6 (Biorad, Richmond, CA ,ETATS-UNIS) centrifugées à 900
g pendant 1 min. La pureté a été contrôlée par électrophorèse sur
gel à 20 % de polyacrylamide, suivie par analyse de la radioactivité
en employant un Analyseur Automatique linéaire TLC (EG&G
Berthold, France) en suivant le procédé décrit par Aynié et al. (21).

Mesures de la taille et du potentiel Zéta des nanocapsules

Le diamètre des nanocapsules a été déterminé après dilution (1/10)

dans de l'eau déminéralisée en utilisant la diffusion quasi-élastique
de le lumière (Nanosizer ND4, Coultronics, FRANCE). Le potentiel
Zéta des nanocapsules préparées avec des concentrations diverses
d'ODN a été déterminé comme suit : 200 µl d’échantillon ont été
dilués dans 2 ml d'une solution à 0,1mM de KCl, ajustée à pH 7,4
puis analysés avec un Zetasizer 4 (Malvern Instruments,
ROYAUME-UNI).

Microscopie électronique après cryofracture (FFEM)

Une petite goutte de la suspension contenant de la glycérine à 30 %

comme cryoprotecteur a été déposée sur un support en cuivre,
congelée rapidement dans le propane liquide. La fracture et la
réplique ont été exécutées à l’aide d’un appareil Balzers Baf 301.
Les répliques ont été lavées et examinées par microscope
électronique Philips 410.

17
Cryodessication

Une petite goutte de la dispersion aqueuse a été déposée sur une

grille recouverte de carbone et gelée rapidement dans le propane
liquide puis séchée à -80°C pendant une heure avant de réaliser un
ombrage avec le carbone-Platine.

Coloration négative et microscopie électronique à transmission

Les nanocapsules ont subi une coloration négative par le

phosphotungstate de sodium à 2 % (pH 7,2) sur des grilles de cuivre
recouvertes d'un film formwar (Ernest Fullam, France). Les
préparations ont été observées sous un microscope électronique à
transmission JEM 1200 EX (Jeol, France) fonctionnant à 80 kV.

Détermination du taux d’encapsulation des ODN dans les

nanocapsules

De l’ODN radio marqué a été mélangé avec de l’ODN non marqué

(1/10). Cette dilution isotopique a été employée à diverses
concentrations pour préparer les nanocapsules comme décrit ci-
dessus. Après la première ultracentrifugation, la radioactivité a été
comptée dans le liquide Ultima GoldTM avec un compteur
LS6000TA (Beckman, CA) dans surnageant et le culot. Le
rendement d'encapsulation final a été calculé en employant
l'équation suivante :
 Pellet Radioactivity 
% Encapsulation =   × 100
 Total Radioactivity (pellet + supernatant) 

18
Etude de la Localisation des ODNs dans le cœur aqueux des
nanocapsules

Pour étudier la localisation de l’ODN dans les nanocapsules, nous

avons réalisé une expérience d'extinction de la fluorescence d’ODN
couplé à la fluorescéine par extinction collisionnelle à l’iodure de
potassium (KI). De l’iodure de potassium dans des concentrations
différentes (0 à 1 M) et 0,001 M de bisulfite de sodium a été ajouté
aux échantillons. Une quantité suffisante de chlorure de potassium
(KCl) a été ajoutée pour maintenir une force ionique constante et
équivalente à 1 M KI dans la solution. L’extinction de la fluorescence
dans la suspension de nanocapsules (ODN/NC) a été comparé aux
différents contrôles : l’ODN fluorescent libre en solution (ODN
LIBRE), l’ODN fluorescent adsorbé à la surface de nanocapsules
grâce à l'utilisation de CTAB (NC+CTAB+ODN), l’ODN fluorescent
mélangé à une solution de CTAB à 150 µM (CTAB+ODN) et l’ODN
fluorescent mélangé à des nanocapsules vides préparées sans
ODN (NC+ODN). L'intensité de fluorescence de l’ODNs fluorescent
a été mesurée à 520 nm après excitation à 494 nm en utilisant un
spectrofluorimètre Perkin-Elmer (LS 50 B). Les fentes d'excitation et
d'émission étaient de 5 nm. Les données ont été analysées selon
l'équation Stern-Volmer :

F0 −1=Ksv.Q
F
Où F0 et F sont les intensités de fluorescence en absence et en
présence de KI, respectivement; Q, la concentration du KI et Ksv, la
constante de Stern-Volmer. Ksv est une indication fiable du taux

19
d’extinction collisionnelle dans la phase aqueuse [34, 35]. Dans une
autre expérience, Ksv a été mesuré au cours de la dégradation du
polymère en employant une solution de soude à 1M pour des temps
d'incubation compris entre 0 et 24 h. Le pH de chaque préparation a
été ajusté à pH7 avant la mesure de fluorescence.

Libération de calcéine par les nanocapsules

Les nanocapsules ont été préparées en employant une phase

aqueuse contenant 2 mg/ml de calcéine. Des expériences de
libération ont été exécutées dans l'eau à pH 7,4 avec des
nanocapsules après dilution au 100ème. La fluorescence a été
mesurée employant un spectrofluorimètre Perkin-Elmer (LS 50 B).
Les longueurs d'ondes d'excitation et d'émission étant
respectivement de 489 et 519 nm.

Méthodes utilisées pour les études biologiques

Stabilité des ODNs phosphodiesters en présence de sérum

Les nanocapsules ont été préparées en utilisant 10 µM d’une

solution d’oligothymidylate de 20 Mer radiomarqué au P33
(ODN/NC). L’ODN libre (ODN LIBRE) et l’ODN associé aux
nanosphères par l’intermédiaire de la formation de paires d'ion avec
le CTAB (NS+CTAB+ODN) ont été employés comme contrôles. 150
µl des différentes préparations: "ODN/NC", "ODN LIBRE" ou
"NS+CTAB+ODN" ont été mélangés avec 350 µl de sérum de veau
fœtal, à 37°C, pendant des intervalles de temps divers compris

20
entre 0 et 60 min. Après incubation, le mélange a été
immédiatement placé à 70°C pendant 15 minutes pour inactiver les
enzymes sériques. Ensuite, la libération de tout l’ODN des
nanocapsules a été obtenue par incubation en présence de soude
(4M) pendant 12 h à 37°C.

L'intégrité de l’ODN a été mesurée aux différents temps

expérimentaux par électrophorèse sur gel à 20 % de polyacrylamide
- 7M Urée (PAGE) suivie par d’une analyse avec un compteur de
radioactivité à canaux multiples (Analyseur TLC-LINÉAIRE
Automatique, Berthold, Allemagne) [36]. L’oligothymidylate libre 20
Mer a migré à 3,7 cm dans nos conditions expérimentales et le
γ33ATP à environ 12,5 cm (données non montrées). La quantité
d'ODN intact pour chaque échantillon a été évaluée par intégration
de la région correspondant à la première moitié du pic de
l'oligothymidylate 20-mer (0 à 3,7 cm) pour éviter des interférences
avec des pics correspondant aux ODNs partiellement dégradés.

Stabilité et libération de l’ODN phosphorothioate en présence de

sérum

Les nanocapsules ont été préparées en utilisant de l’ODN

phosphorothioate radiomarqué. L’ODN phosphorothioate libre a été
employé comme contrôle pour les études de stabilité. 150 µl des
deux préparations ont été mélangés avec 350 µl de sérum de veau
fœtal à 37°C pendant des temps compris entre 0 et 24 heures.

Etudes de libération de l’ODN phosphorothioate dans du serum pur:

21
Après incubation, le mélange a été placé à 4°C pour arrêter l'activité
enzymatique. Le mélange a alors été ultracentrifugé à 4°C, à 18 500
g, 37 000 g et 55 500 g pendant 30 min. Cela a mené à la
localisation des nanocapsules intactes, dans le culot et de l’ODN
libre, dans le surnageant. Le pourcentage de libération a été calculé
en employant le rapport entre la radioactivité dans le surnageant et
la radioactivité totale (culot + surnageant).

Etudes de stabilité de l’ODN phosphorothioate dans du serum pur:

L’inactivation des enzymes sériques, l’électrophorèse et l’analyse
sur compteur de radioactivité à canaux multiples ont été réalisées
dans les conditions décrites plus haut pour les ODN
phosphodiesters. L’oligonucléotide 25 Mer libre a migré à 5,4 cm
(données non montrées). La détermination de demi-vie ODN (T1/2)
dans le sérum a été faite comme suit : les maxima des pics ont été
exprimés comme un pourcentage du pic contrôle (ODN au temps
zéro) et tracés sur une échelle logarithmique en fonction du temps.
Le temps nécessaire pour la dégradation de 50 % a alors été lu
directement sur l'axe des abscisses (temps).

Administration des oligonucléotides aux souris nude

Des fibroblastes murins de lignée NIH-3T3, stablement transfectés

par le gène de fusion humain EWS Fli-1 [33] ont été récoltés sur des
cultures en mono couches confluentes à 60 %, et re-suspendus
avec du PBS à la concentration de 2 X 107 cellules/ml puis inoculés
par voie sous-cutanée dans des souris athymiques (5 X 105
cellules/souris). 14 jours après l'inoculation de la tumeur, lorsque la

22
tumeur sous-cutanée a atteint une taille visible, des préparations
différentes ont été injectées dans la tumeur établie (jour 1). Les
préparations différentes consistaient en 10 µl, de nanocapsules
contenant de l’ODN phosphorothioate antisens (NC AS); 10 µl de
nanocapsules contenant l’ODN phosphorothioate sens (NC SE);
100 µl d'ODN phosphorothioate antisens à 16 µM (AS), 100 µl
d’ODN phosphorothioate sens à 16 µM (SE) et 100 µl d'eau purifiée
contenant 9 g/l de NaCl. Les résultats d'encapsulation (voir taux
d’encapsulation dans la partie résultats) ont permis de calculer que
la concentration des oligonucléotides dans la suspension de
nanocapsule était 160 µM. Ainsi, la quantité d'ODN administré dans
une injection correspondait à 1,6 nanomoles d'ODN pour NC AS et
NC SE. La dose de polymère reçue dans une injection était 40 µg.
Le traitement complet correspondait à une dose cumulative de 14.4
nano moles d'ODN et 320 µg de polymère pour NC AS et NC SE.
Ces conditions de traitement sont récapitulées dans le tableau 1. Le
volume injecté a été ajusté à 100 µL par ajout d'eau purifiée pour
NC AS et NC SE. Sept injections complémentaires ont été réalisées
aux jours 3, 6, 8, 10, 13, 15, 17. Le volume de la tumeur a été
évalué pendant la durée de l’expérience par deux mesures
perpendiculaires de la longueur (a) et de la largeur (b) de la tumeur
et a été calculé par la formule ab2/2.
Simple injection Dose cumulative
ODN Polymère ODN Polymère
NC AS 1.6 nano moles 40 µg 14.4 nano moles 360 µg
NC SE 1.6 nano moles 40 µg 14.4 nano moles 360 µg
AS 1.6 nano moles 0 14.4 nano moles 0
SE 1.6 nano moles 0 14.4 nano moles 0
NaCl 0 0 0 0
Table 1 : Récapitulatif des conditions de traitement

23
 Résultats

Etudes Physico-chimiques

Taille et morphologie des particules

Le diamètre moyen des particules, mesuré par diffusion quasi-

élastique de la lumière, était 350 nm avec un écart-type de 100 nm.
La microscopie électronique après cryofracture a confirmé cette
grande polydispersité de taille. Pour la plupart des particules
observées, le plan de fracture s’est propagé à la périphérie, en
révélant des images de fractures concaves et convexes. Dans
certains cas, il a été possible d'observer une matrice périphérique
interne (figure 4a). On peut expliquer ce type de fracture par la
présence d’un plan de fracture préférentiel à l'interface constitué par
la couche des tensioactifs. De plus, la cryodessiccation a montré
l’effondrement de la structure des particules (figure 4b). Cet
effondrement est lié à la présence d'une grande cavité aqueuse
interne dans les objets observés.

24
Figure 4 : Microscopie Electronique. (a) Cryofracture; (b)
Cryodessiccation . Barre =300nm.

La grande polydispersité de taille est expliquée par l’analyse

multimodale de la diffusion quasi-élastique de la lumière qui révèle
l’existence de deux populations, l’une présentant un diamètre de 20
à 50 nm et l’autre présentant un diamètre de 150 à 350 nm. La
microscopie électronique à transmission confirme l’existence de ces
deux populations (figure 5).

25
Figure 5 : Microscopie électronique de nanocapsules chargées en
ODN, après coloration négative. Barre=200 nm.

Taux d’encapsulation et potentiel Zéta

Le rendement d'encapsulation de l’ODN phosphorothioate a été de

81 ± 8 % (n=4). L'efficacité de l'encapsulation a été trouvée ici plus
importante que celle que nous avions obtenue avec des
nanocapsules semblables, mais en utilisant des conditions
expérimentales différentes [23]. Dans l'étude précédente, il a été
observé qu'en employant une phase aqueuse contenant de l’ODN à
5 µM, un rendement d'encapsulation de seulement 50 % pouvait
être obtenu. Dans la présente étude, en employant une
concentration en ODN de 2,5 mM, nous avons obtenu un rendement
de 81 %. Cette différence a été attribuée aux possibles interactions

26
entre l'ODN et la phase huileuse, le Montane 80 ou l'interface eau /
huile. Ces interactions sont saturées à 2.5 mM, et ainsi insignifiantes
comparées à la quantité d'ODN placée dans le coeur aqueux des
nanocapsules. L'utilisation d'un petit volume de préparation (2.5 ml
au lieu de 10 ml) pourrait aussi jouer un rôle, en raison de
l’amélioration de l'efficacité d'agitation, provoquant ainsi une
meilleure dispersion de la phase aqueuse dans l'huile, ce qui
engendre une meilleure encapsulation de la phase aqueuse.

Les nanocapsules non chargées en oligonucléotides ont présenté

un potentiel zêta de -38 ± 5,7 mV, en présence de quantité variables
d’ODN, toutes les valeurs trouvées étaient d’environ -40 mV. Dans
une étude avec des nanosphères, nous avons montré que
l'adsorption d'ODN sur la surface des nanosphères avait un effet
spectaculaire sur leur potentiel zêta en raison des charges
négatives fournies par les groupes de phosphate de l'ODN (22). Au
contraire, dans le cas présent , l’augmentation de la quantité d'ODN
dans la formulation n'avait aucun effet sur le potentiel zêta, ce qui
suggère que la plus grande partie de l’ODN est placée à l'intérieur
des nanocapsules plutôt qu'à leur surface.

Expériences de diffusion de la Calcéine

L'incubation de nanocapsules chargées en calcéine dans l'eau (pH

7,4) n'a mené à aucune augmentation des valeurs de fluorescence
pendant 24 heures. Après dilution au centième, l'échantillon a
montré une diminution proportionnelle des valeurs de fluorescence
qui n'ont pas varié pendant 24 heures (données non montrées).

27
Localisation des ODN dans les nanocapsules par extinction de
fluorescence

Les diagrammes de Stern-Volmer sont représentés dans Figure 6.

La constante de Stern-Volmer était base quand l'ODN était à
l'intérieur des nanocapsules "ODN/NC" (Ksv = 0,64 M-1), tandis que
la valeur de Ksv était 4,03 M-1 pour l’ODN libre, "ODN LIBRE". Ces
données montrent que l'ODN conjugué à la fluorescéine a été
presque inaccessible au KI lorsqu’il était localisé dans le coeur
aqueux des nanocapsules tandis qu'il a été fortement accessible au
KI lorsqu’il était libre en solution. Les valeurs intermédiaires de Ksv
ont été obtenues avec les contrôles suivants : "CTAB+ODN" (Ksv =
3,56 M-1), "NC+CTAB+ODN" (Ksv = 3,48 M-1) et "NC+ODN" (Ksv =
2,52 M-1). Même après une dilution au dixième des échantillons,
aucun changement de Ksv n'a été observé, indiquant que la
concentration de polymère n'a aucune influence sur la constante de
Stern-Volmer (données non montrées). Lorsque les nanocapsules
ont été dégradées par incubation avec NaOH 1 M, Ksv est monté de
0,64 M-1 à 3,73 M-1 après 24 heures (figure 7). Cette augmentation
de Ksv représente une transition d'un état où la fluorescéine
couplée à l'ODN n'était pas accessible au KI à un état dans lequel
elle est devenue accessible à KI une fois le polymère hydrolysé par
NaOH. Ainsi, après 24 h, la plus grande partie de l'ODN couplé à la
fluorescéine est sortie du coeur aqueux des nanocapsules.

28
 4,5 y = 4,0289x
2
R = 0,9936
ODN Libre
4 y = 3,5596x
ODN + CTAB 2
R = 0,991

3,5 NC + CTAB + ODN y = 3,4809x

2
R = 0,9965
ODN Libre + NC
3
ODN / NC
y = 2,5237x
2,5 R2 = 0,9869

1,5

y = 0,6391x
R2 = 0,9183
0,5

0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

Figure 6 : Diagramme de Stern-Volmer de l’extinction de

fluorescence par l’iodure de potassium d’oligonucléotides couplés à
la fluorescéine dans différentes formulations (classées par Ksv
décroissant) : oligonucléotides libres [ODN LIBRE], oligonucléotides
complexés au CTAB [CTAB+ODN], oligonucléotides adsorbés sur
les nanocapsules grâce au CTAB [NC + CTAB +ODN],
oligonucléotides libres mélangés avec des nanocapsules vides
[NC+ODN] et oligonucléotides encapsulés dans les nanocapsules
[ODN/NC].

29
Figure 7 : Diagramme de Stern-Volmer de l’extinction de
fluorescence par l’iodure de potassium d’oligonucléotides couplés à
la fluorescéine encapsulés dans des nanocapsules progressivement
dégradées par une solution de NaOH 1 M.

L’extinction de la fluorescence suggère que l’ODN fluorescent est

localisé dans le coeur aqueux des nanocapsules, entouré par le
polymère, et ainsi inaccessible au KI. Au contraire, quand l’ODN
fluorescent est libre dans la solution, il est fortement accessible et
une extinction importante de la fluorescence se produite. Une
extinction semblable a pu être obtenue après l'hydrolyse du
polymère formant les nanocapsules engendrant ainsi la libération de
l'ODN. Une complète protection de l'ODN par les nanocapsules
aurait abouti à une valeur de Ksv de zéro. Cependant, la valeur
obtenue de Ksv avec les nanocapsules d’ODN n’était pas nulle mais
très basse (0.64 M-1), on pourrait expliquer cette valeur par la
présence d'une petite partie d'ODN non-encapsulée dans le
mélange. On a montré que l'auto extinction de la fluorescence ne se
produisait pas pour un grand intervalle de concentrations (5-100 µ

30
M) (données non montrées). Par ailleurs, l’ODN libre mélangé aux
nanocapsules vides a présenté une valeur de la constante de Stern-
Volmer intermédiaire, entre celles obtenues avec l’ODN nano
encapsulé et libre. En effet, il a été constaté que lorsqu’il est
mélangé avec des nanocapsules de PIBCA vide, l’ODN fluorescent
est partiellement adsorbé à leur surface en raison des forces de
cohésion hydrophobes qui impliquent les hétérocycles appartenant
au groupe de la fluorescéine (données non montrées). Cette
adsorption peut partiellement diminuer l'accessibilité du KI et donc,
réduire la constante de Stern-Volmer. Quand l’ODN est mélangé
avec le CTAB, l'interaction ionique entre le CTAB et les phosphates
n’a pas gêné l’accès du KI aux groupements fluorescéine qui sont
restés entièrement accessibles. Lorsque le CTAB a été mélangé
avec l’ODN et des nanocapsules vides, nous avons pu montrer que
l'ODN s’est adsorbé à la surface des capsules (données non
montrées) par des interactions électrostatiques avec le CTAB. Dans
ce cas, le marqueur fluorescéine n'a pas ou peu été impliqué dans
l'association et a pu rester accessible au KI. La figure 8 donne un
modèle schématique de la localisation de l’ODN fluorescent et de
l’extinction de la fluorescence dans les différentes préparations.

31
Figure 8 : Modèle pour la localisation et l’extinction de fluorescence
d’oligonucléotides a : [ODN/NC], b : [NC+ODN], c : [ODN LIBRE], d
: [CTAB+ODN] et e : [NC+CTAB+ODN].

La possibilité que des nanosphères poreuses avec l’ODN placé

dans leur coeur aient été formées au lieu de nanocapsules peut être
exclue parce qu’il a clairement été montré qu'en raison de leurs
charges négatives et de l'absence d'interactions hydrophobes,
l’ODN n'interagit pas spontanément avec le polymère PACA [15].
Pour cette raison, l’association d’ODN sur des nanosphères
nécessite la présence d’un cation hydrophobe comme le CTAB.
Ainsi, si l’ODN n'est pas capable de s'adsorber à la surface du
PACA en absence de CTAB, il est peu probable qu'ils s'associent
avec des nanosphères poreuses. De plus, dans la procédure
employée pour la préparation des nanocapsules, bien que le lavage

32
ait été exécuté avec de l'eau, aucune libération significative d'ODN
ou désorption n'a été observée. De plus après la dilution dans l’eau
du complexe ODN fluorescent - nanocapsules, la valeur de Ksv est
restée inchangée (données non montrées), ce qui confirme
qu'aucune libération ne s'est produite. De nouveau, dans le cas
d'une structure de nanosphères poreuses, nous pourrions attendre
une forte désorption de l'ODN pendant le lavage ou la dilution.
Finalement, lorsque de la calcéine a été encapsulée, aucune
augmentation de la fluorescence en fonction du temps n'a été
observée durant plus de 24 h. Cela est à nouveau en faveur d'une
structure de nanocapsule plutôt qu’un système de nanosphères
poreuses qui aurait libéré la calcéine après la dilution.

Etudes biologiques

Libération de l’ODN phosphorothioate à partir de nanocapsules

incubées dans le sérum

Le profil de libération de l'ODN des nanocapsules incubées dans le

sérum montre une sortie précoce importante d’environ 50 % au
cours des 30 premières minutes d'incubation (Figure 9). Ensuite, la
libération de l’ODN a suivi une cinétique linéaire en fonction du
temps entre 1 et 3 heures. A 3 heures, presque tout l'ODN a fui hors
des nanocapsules.

33
 100
55,500 g
80
% Libération ODN

60

40 37,000 g
18,500 g
20

0
0 60 120 180
Temps(min)

Figure 9 : Libération d’oligonucléotides (% ODN release) a partir de

nanocapsules dans du sérum pur, après séparation par
ultracentrifugation à 18,500 g, 37,000 g et 55,500. g.

On pourrait expliquer la sortie précoce par le fait qu'une partie de

l'ODN a été associé à la surface des nanocapsules plutôt que
encapsulé dans leur compartiment aqueux. Cette hypothèse n'est
pas en accord avec les expériences précédentes d’extinction de
fluorescence qui ont bien montré la localisation de la majorité des
oligonucléotides dans le coeur aqueux des capsules [23]. Une autre
explication du profil bi-phasique de sortie de l'ODN pourrait être liée
aux différences de résistance de la membrane polymère. Ce qui
peut aboutir à deux types de capsules : une population ayant une
membrane résistante et une autre ayant une membrane plus fragile.
Cette hypothèse est, de plus, suggérée par l’observation en
microscopie électronique de deux populations de nanocapsules
(Figure 5). En effet, il est probable que sous la contrainte physique
liée à la centrifugation, les capsules les plus grandes sont
déstabilisées plus facilement. Ainsi, les nanocapsules les plus
fragiles libèreraient rapidement l’ODN au cours de

34
l’ultracentrifugation, ce phénomène étant responsable de la sortie
précoce observée, tandis que le reste de l'ODN est sorti
progressivement des capsules plus résistantes en raison de la
dégradation progressive de l’enveloppe des nanocapsules par les
estérases du sérum. En effet, il est connu que le
polyisobutylcyanoacrylate est métabolisé par ces enzymes [37].

La présence de capsules sensibles aux contraintes physiques a

alors été étudiée en exécutant une ultracentrifugation des
nanocapsules d'ODN incubées en présence de sérum à différentes
vitesses (55.500g, 37.000g et 18.500g). Il a été clairement observé
que plus la force de centrifugation était importante, plus la première
phase de sortie de l’ODN à été rapide (Figure 9). De l'intersection
entre l'axe des ordonnées et la partie linéaire du tracé, on peut
conclure que 40 % de l'ODN, approximativement, est inclus dans le
type "résistant" des nanocapsules tandis que les 60 % restant sont
associés au type de nanocapsules plus fragiles. Ainsi, il faut être
prudent dans l'interprétation du profil de sortie de l'ODN des
nanocapsules dans le sérum - testé par ultracentrifugation - puisqu'il
est probable que sans la contrainte physique appliquée pendant la
centrifugation, une grande quantité de l'ODN n’aurait pas été libérée
si tôt.

35
Stabilité de l’ODN encapsulé dans des nanocapsules placées dans
du sérum pur

ODN phosphodiester

L’oligothymidylate libre a été rapidement dégradé dans le sérum

(Figure 10a). Dans ce cas, le pic de l’espèce 20-mer à 3,7 cm,
correspondant à l’ODN intact a diminué après seulement 30 s dans
le sérum et s'est déplacé rapidement vers les poids moléculaires
bas, indiquant qu'une importante part d'ODN a été complètement
dégradée en 33P monothymidylate (à 12,5 cm) et en des composées
de poids moléculaire plus faible (g33P) qui sont sortis du gel (> 14
cm). L'intégration entre 0 et 3,7 cm a indiqué que 50 % de
l'oligothymidylate a été dégradé après 30 s et que moins de 5 % est
resté intact après une incubation de 60 minutes. L'oligothymidylate
encapsulé dans les nanocapsules a montré un profil de dégradation
radicalement différent (Figure 10b). Le pic principal obtenu pour
chaque temps expérimental est resté à une distance de 3,7 cm ce
qui signifie que l'ODN intact était toujours présent tout au cours de
la période d'incubation. Cependant, l'intensité de ce pic a diminué,
montrant qu'une partie de l'ODN a été dégradée. Le destin de l'ODN
encapsulé semble être « tout ou rien » : entièrement protégé ou
entièrement dégradé, selon sa localisation dans les capsules ou
hors des capsules après dégradation du polymère formant
l’enveloppe des nanocapsules. En effet, l'ODN qui a été libéré a
suivi la même cinétique de dégradation que l'ODN libre. Pour la
formulation de nanocapsules, l’intégration de la région 0-3,7 cm
indique que 35 % de l'ODN est resté intact après 60 minutes de

36
contact avec le sérum. Quand l’oligothymidylate a été adsorbé à la
surface de nanosphères (NS+CTAB+ODN), le profil de dégradation
a été complètement différent (la Figure 10c) : dès 30 s, le pic
principal s’est déplacé progressivement vers les poids moléculaires
plus faibles tandis que la hauteur du pic diminuait graduellement.
Dans ce cas, l’ensemble de l'ODN a été progressivement dégradé.
L'adsorption à la surface des particules ne peut pas empêcher
l’initiation de la dégradation à l'extrémité de l'ODN, ce qui a donné
lieu à ce type de protection.

37
 450

400 a
0 min
350

300

250
Cts

200 30 sec

150 5 min
10 min
100 30 min
1 min
60 min
50

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Cm
120

b
100
0 min

30 sec
80
1 min
5 min
Cts

60 10 min

30 min
40
60 min

20

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Cm
300

c
250 0 min
30 sec

200 1 min

150 5 min
Cts

100 10 min
30 min

50 60 min

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Cm

Figure 10 : Électrophorèse d'oligothymidylate libre (a),

oligothymidylate encapsulé dans des nanocapsules (b) et
oligothymidylate adsorbé à la surface de nanosphères (c), après
différent temps d’incubation dans du sérum.

38
ODN phosphorothioate

L’ ODN phosphorothioate libre s’est dégradé lentement en présence

de sérum (Figure 11a). Le pic initial à 5,4 cm, correspondant à
l’ODN 25-mer intact a diminué graduellement et s’est déplacé vers
les plus bas poids moléculaires.

39
Figure 11 : Electrophorèses d’ODN phosphorothioate libre (a) et
d’ODN phosphorothioate encapsulé dans des nanocapsules (b)
après incubation dans du sérum pur. (c) représente le % d’ODN
phosphorothioate intact, tracé sur une échelle logarithmique en
fonction du temps.

40
Lorsque les ODN phosphorothioates sont encapsulés dans des
nanocapsules, leur stabilité a été améliorée (Figure 11b) puisque la
quantité d'ODN intact est restée beaucoup plus importante pendant
les 3 premières heures d'incubation. Le temps de demi-vie de l’ODN
phosphorothioate dans les capsules a été multiplié par 2 par rapport
à l'ODN libre en solution (Figure 11c). Si nous comparons la
cinétique de dégradation de l’ODN (Figure 11) avec les données de
l’expérience de libération (Figure 9), il apparaît que la dégradation
ne se produit qu’une fois que l’ODN est libéré des capsules.

Bien que la protection de l’ODN encapsulé soit moins marquée dans

le cas de l’ODN phosphorothioate, en raison de sa plus grande
stabilité intrinsèque, ces études ont bien montré que cette nano-
encapsulation était capable de protéger l’ODN contre la dégradation
par les nucléases sériques et que cette protection était beaucoup
plus efficace que celle obtenue avec nanosphères recouvertes de
CTAB (NS+CTAB+ODN), qui permettent seulement l'adsorption
simple d'ODN sur leur surface plutôt que l'encapsulation [15]. De
plus, le profil de dégradation d'ODN nano encapsulé diffère
totalement de celui de l'ODN adsorbé. En effet, lorsque l’ODN a été
adsorbé à la surface des nanosphères, il a été dégradé
progressivement par les exonucléases, comme cela à été
également observé Chavany sur une électrophorèse en gel de
polyacrylamide [38]. Au contraire, quand l'ODN est encapsulé dans
les nanocapsules, une grande proportion de l'ODN est restée intacte
tandis qu'une partie a été dégradée, cette dernière correspondant à
la fraction de l’ODN progressivement libérée alors que l'enveloppe

41
polymère a été hydrolysée par l'action des estérases du sérum [37,
39]. Ce profil de dégradation a aussi confirmé la structure de
nanocapsule des particules car si l'ODN avait été simplement
adsorbé à la surface des nanocapsules, un profil de dégradation
semblable à celui de l'ODN adsorbé aurait été observé.

Administration à la souris

Comme on peut le voir dans la figure 12, seules les injections intra
tumorales de nanocapsules chargées en antisens (NC AS) ont
permis d’obtenir une inhibition significative de la croissance de la
tumeur pour une dose cumulée de 14.4 nanomoles. Au jour 20, la
croissance a été réduite d’environ un facteur trois entre NC AS et
toutes les autres conditions de traitement. Aucun effet n’a pu être
détecté avec l'ODN libre. Dans une étude précédente, en employant
le même antisens libre, Tanaka et al. ont montré l’inhibition de la
croissance d’une tumeur dans un modèle semblable, mais une dose
cumulée de 500 nanomoles a été nécessaire. Dans notre étude,
l'utilisation de nanocapsules a permis d’ obtenir un effet comparable
à celui observé par Tanaka, mais avec une dose administrée 35 fois
plus faible.

42
 10000

9000
NC SE
8000
Croissance Tumorale %

NaCl
7000
SE
6000
AS
5000

4000

3000
NC AS
2000

1000

0
1 6 11 16 21

Jours suivant l’injection

Figure 12 : Effet de l’ODN antisens encapsulé (!, NC AS), ODN

antisens libre (", AS), ODN sens (#, SE), NaCl 9g/l ($, NaCl) et
ODN sens encapsulé (!, NC SE) sur la croissance tumorale dans
des souris nudes, exprimée en % du volume de la tumeur au jour 1.
8 injections ont été réalisées aux jours 1, 3, 6, 8, 10, 13, 15, 17.
Tous les ODN, libres ou encapsulés ont été utilisés à la dose de 1.6
nanomoles par injection. La dose cumulative en ODN était de 14.4
nanomoles.

Cette importante augmentation de l’efficacité des oligonucléotides

est due en partie à la protection de ceux-ci vis-à-vis des nucléases
qui induisent leur dégradation. Un autre rôle important des
nanocapsules dans l’augmentation de l’efficacité des
oligonucléotides réside dans l’augmentation des interactions avec
les cellules. Classiquement, les systèmes colloïdaux pénètrent dans
les cellules après endocytose. Ici, après avoir mis en contact des
nanocapsules chargées en oligonucléotides fluorescents avec des
cellules EWS Fli-1 NIH 3T3 en culture, nous n’avons pas pu mettre
en évidence de fluorescence intracytoplasmique (Données non

43
montrées). Une endocytose importante aurait concentré le matériel
fluorescent dans les vésicules endosomales qui seraient alors
apparues clairement [40-43].

Dans notre cas, les nanocapsules sont restées dans la tumeur, elles
se sont peut être associées à la surface des cellules et elles ont
oeuvré comme un système de libération prolongée des
oligonucléotides qui libèrerait le principe actif à proximité de la cible.
Il a été montré que des microsphères permettant la libération
prolongée d’oligonucléotides augmentent la pénétration
intracellulaire des oligonucléotides [44]. L’utilisation de
nanocapsules permettrait donc de maintenir une concentration
efficace en oligonucléotide durant une longue période, tout en
réduisant l’exposition systémique. Ainsi, en permettant d’obtenir un
effet antisens en utilisant de faibles doses en oligonucleotides, les
nanocapsules permettraient d’éviter l’apparition des effets
indésirables et la diminution de la spécificité observés à forte dose
[45-47].

44
 Discussion

Etudes Physico-chimiques

Stabilité du système

L’innovation apportée par les nanocapsules à contenu aqueux, en

suspension aqueuse que nous avons développées réside dans le
fait que pour la première fois, une phase aqueuse est encapsulée
dans des nanocapsules en suspension en phase aqueuse. En effet,
le mode de préparation des nanocapsules qui était toujours basé sur
la réalisation d’une émulsion permettant soit l’obtention de
nanocapsules à contenu huileux dans une phase aqueuse suite à la
préparation d’une émulsion huile dans eau [19, 21], soit l’obtention
de nanocapsules à contenu aqueux dans une phase huileuse [22].
Nous avons pu obtenir des nanocapsules à contenu aqueux en
réalisant une préparation en deux temps : la préparation de
nanocapsules à contenu aqueux en phase huileuse suivie d’une
ultracentrifugation et de la resuspension des capsules en phase
aqueuse.

L’étape critique dans la préparation des nanocapsules réside dans

l’ultracentrifugation. En effet, lors de l’utracentrifugation, les
particules qui présentent une surface hydrophobe vont passer en
phase aqueuse. A ce stade, si aucun phénomène ne venait
stabiliser la suspension, les particules se seraient agrégées sous
l’effet des interactions hydrophobes entre leurs surfaces. Cette
agrégation est d’autant plus facilitée que lors de la formation du

45
culot, les distances entre les particules sont réduites, ce qui rend
l’influence des forces d’attraction de Van der Waals plus importante
et risque de dresser une importante barrière de potentiel rendant la
remise en suspension difficile (théorie DLVO) [48, 49].

Dans le cas présent, le monooléate de sorbitane (Span 80), qui sert

à stabiliser l’émulsion, va probablement jouer un rôle au moment du
passage des nanocapsules en phase aqueuse. En effet, tant que les
capsules sont en phase huileuse, elles sont entourées d’une
monocouche de tensioactif, orientée avec sa partie hydrophobe vers
l’huile et sa partie hydrophile vers le cœur aqueux. L’excès de
tensioactif se place à l’interface entre la phase huileuse et la phase
aqueuse destinée à recevoir les nanocapsules. Lors de
l’ultracentrifugation, les nanocapsules migrent de la phase huileuse
vers la phase aqueuse. Lorsque les capsules traversent l’interface, il
y a une réorganisation du tensioactif. Deux hypothèses peuvent être
émises :

1. Les molécules de span 80 se retournent afin de présenter leur

têtes hydrophiles à la solution aqueuse et d’associer leurs
queues hydrophobes à la surface du polymère.
2. Les molécules de span 80 sont piégées par la membrane de
polymère avec leur têtes hydrophiles dans le corps aqueux
des capsules. Elles ne peuvent donc pas se retourner. Dans
ce cas, une seconde couche de span se dépose sur la
première. Cette hypothèse est schématisée Figure 13.

46
 Déplacement des capsules
Phase
Huileuse

Interface

Phase
Aqueuse

Figure 13 : Hypothèse sur l’organisation du Span 80 lors du

passage des capsules de la phase huileuse à la phase aqueuse.

Les images de cryofracture semblent confirmer l’hypothèse 2, en

effet, les images de nanocapsules observées sont similaires aux
observations réalisées sur des liposomes. Ces aspects de demi-
creux ou de demi-bosses proviennent, dans le cas des liposomes,
de la fracture de ceux-ci selon un plan qui passe dans la bicouche
phospholipidique. La figure 14 montre comment le plan de fracture
pourrait se former autour des nanocapsules en donnant un plan de
fracture.

47
Figure 14 : Hypothèse sur l’organisation du Span 80 et sur la
formation du plan de fracture lors des cryofractures.

La bicouche de Span 80 apporte une stabilisation du système en

hydrophilisant sa surface. Un autre facteur important dans la
stabilité des nanocapsules est leur charge négative. En effet les
mesures de potentiel Zéta ont montré que la charge des
nanocapsules est d’environ -40 mV. Cette charge apporte une
importante stabilisation de type électrostatique au système.

Dans les deux systèmes étudiés, nanosphères et nanocapsules, la

stabilité de la suspension résulte d’un équilibre délicat. Les
nanosphères tendent à s’agréger par les forces de cohésion
hydrophobes. Le système est stabilisé par l’action stérique du
dextran et par les forces de répulsion électrostatique apparaissant
lorsque les particules présentent une charge suffisante, soit positive,
soit négative. Les nanocapsules sont fortement chargées
négativement, ce qui assure une bonne stabilisation électrostatique,
d’autre part, le tensioactif (span) s’organise de manière à
hydrophiliser la surface des capsules, ce qui réduit l’influence des
forces de cohésion hydrophobe.

48
Localisation et stabilité des oligonucléotides

Dans le cas des nanosphères, la polymérisation a eu lieu avant

l’introduction des oligonucléotides dans le système. Les
oligonucléotides sont des molécules hydrophiles, chargées
négativement alors que le polymère est hydrophobe et également
chargé négativement. Ainsi, les oligonucléotides ne s’associent pas
au nanosphères en absence de CTAB et on peut donc écarter la
possibilité qu’auraient ceux-ci de diffuser vers l’intérieur du réseau
polymérique. En mettant en parallèle le potentiel Zéta du système
ainsi que l’isotherme d’association des oligonucléotides aux
nanosphères [50], on peut conclure que les oligonucléotides sont
localisés à la surface des nanosphères.

En revanche, démontrer qu’un système sub-micronique a une

structure de capsule n’est pas chose aisée. L’idée la plus simple qui
vient à l’esprit est d’utiliser la microscopie électronique après
cryofracture afin de visualiser la membrane polymérique entourant
la phase interne de la capsule. Dans notre cas, les images de
cryofractures ont montré un plan de fracture qui contourne les
capsules. Dans la mesure où aucune des capsules n’a été fracturée
selon un plan qui la traverse, ces images ne permettent pas de tirer
des conclusions sur leur structure interne. Cependant, lorsque la
suspension de capsules est cryodessiquée, un certain nombre
d’objets s’affaissent en mettant en évidence, d’une part, leur
contenu aqueux et, d’autre part, l’existence d’une membrane
relativement souple (figure 4b). Ce phénomène est schématisé par
la figure 15.

49
 CRYODESSICATION

Figure 15 : Cryodessication et affaissement des capsules.

Dans le cas des nanoparticules recouvertes de CTAB, les mesures

de potentiel Zêta avaient permis d’étudier l’adsorption des
oligonucléotides sur le système. Ici, on utilise les mesures de
potentiel Zêta afin de vérifier que les oligonucléotides ne
s’adsorbent pas à la surface des nanocapsules, mais qu’ils sont
localisés à l’intérieur du système. En effet, le potentiel Zéta ne varie
pas de manière significative avant et après adsorption des
oligonucléotides. Ce résultat permet d’affirmer que les
oligonucléotides ne sont pas localisés à la surface des
nanocapsules, et qu’ils sont donc vraisemblablement à l’intérieur de
celles-ci.

Les expériences de relargage de la calcéine ont montré que le

système n’est pas sensible à la dilution. Ceci signifie que nous ne
sommes en présence ni d’un système poreux, ni d’un système de
type liposome, car ceux-ci relargueraient les oligonucléotides lors de
la dilution.

50
Les expériences d’extinction de fluorescence et spécialement
l’étude de la constante de Stern-Volmer permettent également de
tirer des conclusions sur la structure du système. Comme le
schématise la figure 16, si un oligonucléotide marqué à la
fluorescéine se trouve à l’extérieur des nanocapsules, il va être
possible d’éteindre la fluorescence de celui-ci grâce à l’extinction
collisionnelle provoqué par l’iodure de potassium. En revanche,
lorsque l’oligonucléotide est encapsulé dans les capsules, le KI ne
peut pas l’atteindre et on ne devrait pas observer de extinction.

Figure 16 : Schéma représentant la non-extinction de fluorescence

d’un oligonucléotide encapsulé et l’extinction de fluorescence d’un
oligonucléotide placé à l’extérieur du système.

Les diagrammes de Stern-Volmer montrent que les oligonucléotides

sont localisés dans les nanocapsules. En effet, la constante de
Stern-Volmer est très faible pour les oligonucléotides encapsulés
(Ksv=0.64M-1), ce qui signifie qu’il y a très peu d’extinction de
fluorescence. Par comparaison, les oligonucléotides libres en
solution ont une constante de Stern-Volmer de 4 M-1. Ksv est le

51
rapport de la fluorescence en absence de KI sur la fluorescence en
présence de KI moins 1. L’absence totale d’extinction de
fluorescence donnerait donc Ksv=0, nous sommes donc en
présence d’une faible extinction qui provient probablement d’une
petite portion d’oligonucléotides qui ne sont pas encapsulés et qui
n’ont pas été éliminés par les lavages des nanocapsules. Ces
oligonucléotides sont peut-être adsorbés à la surface des capsules.
Les valeurs de Ksv obtenues avec les différents contrôles se situent
entre la valeur obtenue avec les oligonucléotides encapsulés et la
valeur obtenue avec des oligonucléotides libres. Les
oligonucléotides complexés par du CTAB et associés ou non aux
nanocapsules donnent une valeur de Ksv très proche de celle
obtenue avec les oligonucléotides libres ; en revanche, le mélange
oligonucléotide/nanocapsules dans lequel les oligonucléotides sont
à l’extérieur des capsules donne une valeur de Ksv beaucoup plus
faible (2.5 M-1). Ce résultat est riche d’enseignements sur le
comportement des oligonucléotides en présence de CTAB ou de
nanocapsules En effet, en présence de CTAB, c’est le groupement
phosphate des oligonucléotides qui se lie avec l’ammonium
quaternaire du CTAB par interaction électrostatique, en laissant le
groupement fluorescéine totalement accessible au KI, ce qui donne
un Ksv proche de celui qui est obtenu dans le cas des
oligonucléotides libres. Mais, lorsque les oligonucléotides sont mis
en présence des nanocapsules, en absence de CTAB, ceux-ci
s’associent par interaction hydrophobe à la surface des
nanocapsules; dans ce cas, ce sont les hétérocycles du groupement
fluorescéine qui sont impliqués, ce qui pourrait engendrer un
encombrement stérique rendant plus difficile l’extinction

52
collisionnelle. La figure 8 donne une représentation schématique de
ces différentes interactions.

Libération des oligonucléotides dans le sérum

La figure 9 montre des courbes de libération des oligonucléotides

après incubation dans le sérum pur. Ces courbes ont été obtenues
après des ultracentrifugation à des forces différentes. On peut
constater une libération massive d’environ 50 % des
oligonucléotides dans les 30 premières minutes. Ensuite, la
libération est linéaire. La libération initiale peut être expliquée par
l’existence de deux populations de nanocapsules : une population
qui présenterait une enveloppe polymère résistante et une autre qui
aurait une enveloppe plus fragile. Cette hypothèse est appuyée par
les différentes images de microscopie électronique (Figures 4, 5) qui
montrent des grosses et des petites particules. Nous pensons que
les grosses capsules se brisent plus facilement sous la contrainte
physique imposée par l’ultracentrifugation et qu’elles sont
responsables de la libération initiale. Les plus petites capsules
libéreraient ensuite les oligonucléotides plus progressivement au fur
et à mesure de la dégradation de leurs enveloppes par les
estérases.

La présence de capsules plus sensibles aux contraintes physiques

a été confirmée par le fait que plus la force de centrifugation est
importante, plus rapide est le re-largage initial.

53
Etudes Biologiques

Protection des oligonucléotides

Nous avons montré que dans le cas des nanosphères, les

oligonucléotides sont localisés à la surface du système, tandis que
dans le cas des nanocapsules, les oligonucléotides sont bien
localisés dans le cœur aqueux. Nous allons maintenant comparer la
protection vis à vis de la dégradation enzymatique que l’une ou
l’autre de ces localisations peut apporter aux oligonucléotides.

Les oligonucléotides encapsulés dans des nanocapsules présentent

une cinétique de dégradation dans le sérum complètement
différente de celle des oligonucléotides libres ou encore de celle que
l’on obtient avec des oligonucléotides associés en surface de
nanosphères (Figure 10). Lorsque les oligonucléotides sont libres,
ils sont dégradés massivement et immédiatement. Leur demi-vie est
d’environ 30 secondes dans du sérum de veau fœtal pur. Lorsqu’ils
sont adsorbés à la surface de nanosphères, via le CTAB, les
oligonucléotides se dégradent sous l’action des exonucléases, leur
poids moléculaire diminue lentement et progressivement. Cette
dégradation progressive pourrait être la conséquence d’une
désorption des oligonucléotides de la surface des particules, qui
serait due à une compétition avec les protéines plasmatiques. La
bioérosion du polymère sous l’action des estérases [37] pourrait être
une autre explication de cette désorption [16].

54
En revanche, lorsqu’ils sont encapsulés dans des nanocapsules, les
oligonucléotides sont protégés totalement jusqu’au moment de la
rupture de la capsule. En effet, tant que la membrane de polymère
constituant l’enveloppe de la capsule n’est pas dégradée, les
oligonucléotides encapsulés n’entrent pas en contact avec les
nucléases du sérum. On peut très clairement observer cette
protection dans la Figure n°10. Dans les études chez la souris, les
oligonucléotides phosphorothioates utilisés étant naturellement plus
stables, cet effet, bien que restant important, est moins marqué.

Effet in-vivo des nanocapsules de PIBCA chargées en

oligonucléotides antisens EWS-Fli1.

Après 8 injections réparties en 20 jours, dans des tumeurs

apparentées au sarcome d’Ewing [33], implantées à des souris
nudes, les nanocapsules chargées en oligonucléotides EWS-Fli1
ont permis de réduire d’environ 60% la croissance tumorale. Cet
effet, obtenu avec des oligonucléotides phosphorothioates est
comparable à celui qui a été obtenu par Tanaka et al.[32] dans un
modèle similaire, mais les nanocapsules ont permis de réduire la
dose d’oligonucléotides nécessaire d’un facteur 35.

55
 Conclusion

Ayant rencontré des problèmes de non-spécificité et de toxicité,

avec des nanospères sur lesquelles les oligonucléotides étaient
simplement adsorbés en surface, nous avons évolué vers un
système réservoir de type nanocapsule.

Cette étude décrit, pour la première fois, une méthodologie

permettant l'encapsulation ODN. Les études de potentiel zêta,
d’extinction de fluorescence et de dégradation des oligonucléotides
ont confirmé la localisation de ceux-ci dans le cœur aqueux des
nanocapsules. Ce nouveau transporteur a montré que sa capacité
de protéger l’oligonucléotide associé est plus importante que celle
de nanosphères sur lequel l’oligonucléotide a simplement été
adsorbé par des interactions ioniques.

Les avantages de ce nouveau système sont nombreux :

• La quantité d’oligonucléotide pouvant être encapsulée peut

être très importante et pourrait n’être limitée que par la
solubilité des oligonucléotides dans la phase aqueuse interne.
Dans les nanosphères précédemment développées,
l’adsorption des oligonucléotides était rapidement saturée.
• La quantité de polymère par nanocapsule se limitant à
l’enveloppe, le ratio oligonucléotide/polymère est fortement
réduit dans ce système. Ceci permet d’administrer des doses
plus importantes d’oligonucléotides avant l’apparition de la
toxicité du polymère.

56
 • Les cations tels que le CTAB présentent une toxicité très
nette, qui s’exerce notamment sur les membranes des
cellules. Les oligonucléotides sont encapsulés dans les
nanocapsules sans avoir recours à un cation de type CTAB.

Bien que les nanocapsules aient permis d’obtenir un effet biologique

in vivo, la question de leur mode d’action reste ouverte ; ce système
favorise-il la pénétration des oligonucléotides dans les cellules ou
agit-il simplement comme un système de libération contrôlée ? La
charge fortement négative des nanocapsules est défavorable aux
interactions avec les cellules qui sont également chargées
négativement, mais après une administration intra-veineuse, ce
système serait sûrement recouvert d’opsonines, puis capté par les
cellules du système réticulo-endothélial. Comment, alors, les
nanocapsules permettraient-elles de libérer les oligonucléotides
dans le cytoplasme avant qu’ils n’aient été dégradés dans les
lysosomes ?

De nombreuses améliorations peuvent être apportées à ce système.

Nous pouvons envisager de cibler ces nanocapsules vers certains
types cellulaires en utilisant des ligands spécifiques de ces cellules.
Il est également possible, en utilisant le modèle que nous offrent les
virus, de doter ces nanocapsules de systèmes d’échappement aux
lysosomes. Il serait envisageable d’insérer, soit dans la membrane
polymérique, soit dans le cœur aqueux, des molécules capables de
déstabiliser les vésicules endosomiales, telles que des peptides
viraux. Les nanocapsules dotées de ces améliorations

57
représenteraient une alternative sérieuse aux vecteurs viraux pour
l’administration des oligonucléotides antisens.

Enfin, les nanocapsules, avec leur cœur aqueux, offrent de

nombreuses autres applications, elles pourraient être un vecteur de
choix pour toutes les molécules solubles dans l’eau telles que l’ADN
ou les peptides.

58
 Résumé

Grâce au programme international financé depuis dix ans par

18 pays, l'essentiel des trois milliards de paires de bases qui
composent notre patrimoine héréditaire est désormais décrypté.
C’est le lundi 26 Juin que les pays finançant le HGP (Projet du
Génome Humain) ont présenté une ébauche du génome humain. Le
séquençage du génome est quasiment achevé avec quinze ans
d'avance sur ce qui était prévu en 1989, lors de son lancement
officiel.

La connaissance du génome humain permettra non seulement de

mieux comprendre les procédés donnant naissance aux maladies
mais aussi d’envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques
basées sur un traitement de leurs causes. De nombreuses maladies
résultent du fait qu’une protéine est non fonctionnelle ou absente ou
au contraire sur-exprimée. Ce défaut dérive directement d’une
séquence nucléotidique anormale ou mutée d’un gène.
L’identification du gène codant pour cette protéine spécifique permet
de définir une nouvelle cible pour la thérapeutique.

A l’heure actuelle, les principes actifs agissent surtout sur des cibles
ubiquitaires impliquées dans le mécanisme de nombreuses
maladies telles que des enzymes, des récepteurs nucléaires, des
récepteurs membranaires ou des canaux ioniques. Ce type
d’approche implique l’apparition de nombreux effets indésirables.
Grâce à la connaissance du génome, on peut désormais envisager
de traiter de nombreuses maladies par l’administration d’ADN

59
codant pour la ou les protéines déficientes. A l’inverse, on peut
également envisager de bloquer l’expression de protéines néfastes
telles que les protéines oncogènes par l’utilisation d’oligonucléotides
(ADN ou protéines sens, ADN antisens). Ces acides nucléiques très
courts s’hybrident de façon très spécifique à un gène et en modulent
l’expression. En effet, l’hybridation de l’oligonucléotide sur un brin
d’ARN messager bloque la traduction de la protéine
correspondante, celle-ci ne sera donc plus produite.

Cependant, des problèmes de faible stabilité, de passage

transmembranaire et de ciblage dans le compartiment cellulaire
approprié limitent encore l’emploi des oligonucléotides en
thérapeutique.

L’utilisation d’oligonucléotides chimiquement modifiés a été

proposée afin d’augmenter leur stabilité et leur pénétration dans les
cellules.

Des nanocapsules à contenu aqueux ont été préparées par

polymérisation anionique à l’interface dans une émulsion eau dans
huile. Cette première étape est suivie de la séparation puis de la re-
suspension des nanocapsules dans l’eau. Ce système s’est montré
efficace pour l’encapsulation d’oligonucléotides qui étaient localisés
dans la partie interne des capsules. Nous avons confirmé cette
localisation grâce à des techniques de microscopie électronique,
l’étude du potentiel Zéta du système et une étude d’extinction de
fluorescence des oligonucléotides encapsulés. L’encapsulation a
permis de protéger les oligonucléotides contre la dégradation en

60
présence de sérum pur, ainsi la demi-vie d’un oligonucléotide
phosphorothioate a-t-elle été doublée lorsque celui-ci était
encapsulé. Enfin, ces nanocapsules ont permis d’obtenir une
inhibition in vivo de la croissance d’une tumeur apparentée au
sarcome d’Ewing, après injection intra tumorale .

Le nouveau système nanocapsulaire que nous avons développé

semble réunir des qualités nécessaires à un vecteur, l’effet in-vivo
obtenu en atteste.

Il faut maintenant envisager de doter ces nanocapsules de

systèmes de ciblage tissulaires afin de pouvoir utiliser ce vecteur
après administration intra-veineuse. D’autre part, ce type de vecteur
à contenu aqueux pourrait également être mis à profit pour
l’administration d’autres principes actifs hydrophiles tels que les
peptides.

61
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67
RESUME :
Cette thèse présente la mise au point d’un système de transport et
de ciblage des oligonucléotides antisens constitué d’un polymère
biodégradable, le polyisobutylcyanoacrylate. Ce nouveau vecteur se
présente sous la forme de nanocapsules à contenu aqueux. Ce
système s’est montré efficace pour l’encapsulation
d’oligonucléotides qui se localisent dans la partie interne des
capsules. Des études de microscopie électronique et d’extinction de
fluorescence ont permis de confirmer la structure de ce système.
Nous avons montré que l’encapsulation a permis de protéger les
oligonucléotides contre la dégradation en présence de sérum pur.
Enfin, ces nanocapsules, chargées en oligonucléotides antisens ont
permis d’obtenir une inhibition de la croissance d’une tumeur
apparentée au sarcome d’Ewing implantée chez des souris nudes.

MOTS CLES :

Nanocapsule, oligonucléotide, antisens, polyalkylcyanoacrylate,

polyisobutylcyanoacrylate, Sarcome d’Ewing.

LABORATOIRE DE RATTACHEMENT :
Laboratoire de Pharmacotechnie et Biopharmacie
Faculté de Pharmacie
5, rue Jean Baptiste Clément
92296 CHATENAY MALABRY