Polycopié UE2 2017-2018 (Définitif)

ÉDITION 3
UE 2
Biologie cellulaire
Année universitaire 2017-2018
Tutorat PACES Lyon Est 2
Polycopié UE2
Polycopié UE2
Introduction
Informations générales concernant les polycopiés
Les polycopiés du Tutorat PACES Lyon Est sont mis à votre disposition comme compléments possibles à
votre méthode de travail. Ils n'ont pas vocation à remplacer votre présence en cours ou le cours de l'enseignant.
Les polycopiés ont été rédigés à partir des cours de l'année précédente, il est donc possible que certaines parties
ne soient plus au programme ou soient devenues inexactes (eh oui, la science évolue !). Nous vous conseillons
de vous approprier au maximum ces polycopiés en les annotant, en les surlignant, en les corrigeant et en les
modifiant en fonction du nouveau cours.
Nous insistons sur le fait que les polycopiés du Tutorat sont des Supports Pédagogiques, et ne sont
absolument pas une manière de remplacer les cours en amphithéâtre, ou une référence pour le concours.
La parole du professeur au cours de la présente année universitaire fera toujours foi.
Informations concernant l'UE2 et son polycopié

L'UE2 (ou biologie cellulaire) est l'étude en long, en large et en travers de la plus petite unité fonctionnelle
de notre organisme, à l'origine des processus physiologiques que vous pourrez apprendre par la suite : la cellule.
Cette cellule peut prendre des formes diverses et exercer de nombreuses fonctions selon son environnement et
l'expression de son génome, et c'est ce que vous fera découvrir la « bio'cell ».
L'UE2 est l'une des rares UE en PACES qui vous permettra de développer vos capacités d'analyse et de
réflexion sur des sujets scientifiques. Cette UE offre donc la possibilité d'appréhender les sciences médicales
autrement que par l'apprentissage par cœur que nous associons couramment (et à tort) à la PACES. L'épreuve
du concours d'UE2 est donc une épreuve de logique et de compréhension.
Dans le cadre de cette UE, il faut prendre en compte le fait que toutes les informations apportées par ce
polycopié ne sont pas à apprendre par cœur, mais sont à mettre en relation pour essayer in fine de comprendre
un mécanisme global de fonctionnement. Rien ne sert d'apprendre des détails extrêmement pointus qui ne vous
seront d'aucune utilité pour le concours, même s'ils restent des éléments intéressants pour votre culture
générale.
Les définitions marquées de deux étoiles (ÙÙ) sont présentes dans le glossaire de biologie cellulaire que vous
retrouverez sur Spiral dans le dossier « UE2 : La cellule » en temps voulu.
La présence de trois étoiles (ììì) indique que la sous-partie ne contient pas d'information mais que le
titre a été laissé en guise de déclaration.
3 Année 2017 - 2018

Sommaire
Sommaire
Introduction ...................................................................................................................................................................... 3
Sommaire .......................................................................................................................................................................... 4
De la cellule au noyau et à l’ADN, support de l’hérédité .................................................................................................... 9
I. Introduction ............................................................................................................................................................... 9
II. Localisation de l’information génétique dans la cellule ........................................................................................... 9
A. Information génétique contenue dans le noyau ............................................................................................ 9
B. Utilisation par la cellule de l’information contenue dans le noyau.............................................................. 12
III. Nature chimique du matériel génétique ............................................................................................................... 13
A. Transformation des bactéries, découverte de la substance transformante ................................................ 13
B. Découverte de la fonction d’un gène ........................................................................................................... 14
C. Redécouverte de la substance transformante ............................................................................................. 15
D. ADN support de l’information génétique ..................................................................................................... 16
E. Nature de la liaison chimique et diffraction des rayons X ............................................................................ 18
F. Structure de l’ADN ....................................................................................................................................... 18
G. Rappel sur les différentes liaisons rencontrées ........................................................................................... 22
Transmission des caractères de l’hérédité ....................................................................................................................... 23
I. Mécanismes du maintien de l’information génétique ............................................................................................ 23
A. Introduction ................................................................................................................................................. 23
B. Les mécanismes de réplication de l’ADN ..................................................................................................... 23
C. Mécanisme de réparation de l’ADN ............................................................................................................. 32
II. Structure et réplication des chromosomes ............................................................................................................ 33
A. Introduction ................................................................................................................................................. 33
B. L’ADN au sein du chromosome .................................................................................................................... 34
C. Protéines de structure associées à l’ADN..................................................................................................... 36
D. Diversité de structure et de fonctions de la chromatine ............................................................................. 38
E. Organisation globale des chromosomes ...................................................................................................... 39
F. Réplication des chromosomes ..................................................................................................................... 41
Noyau et nucléole ̶ Relations nucléo-cytoplasmiques ..................................................................................................... 43
I. De la structure de la chromatine à l’expression des gènes ..................................................................................... 43
A. Introduction – Comment passer du génotype au phénotype ? ................................................................... 43
B. Mécanismes généraux de la transcription ................................................................................................... 43
C. Trois sortes de transcription chez les eucaryotes ........................................................................................ 46
D. Synthèse et maturation des ARNm par l’ARN polymérase II ....................................................................... 47
E. Synthèse et maturation des ARN de transferts et des ARN 5s et 7s ............................................................ 54
F. Synthèse et maturation des ARNr par l’ARN polymérase I .......................................................................... 55
G. Conclusions .................................................................................................................................................. 57
II. Du gène à la protéine ............................................................................................................................................. 58
A. Principes du code génétique ........................................................................................................................ 58

Polycopié UE2
B. Caractéristiques du code génétique............................................................................................................. 59

C. Traduction du message génétique ............................................................................................................... 60
Les méthodes de biologie cellulaire ................................................................................................................................. 63
I. Source du matériel biologique ................................................................................................................................ 63
A. Micro-organismes utilisés dans les laboratoires .......................................................................................... 63
B. Animaux utilisés dans les laboratoires ......................................................................................................... 63
C. Modification du génome par la méthode CRISPR ........................................................................................ 65
D. Cellules eucaryotes en culture ..................................................................................................................... 66
E. Origine des cellules cultivées ....................................................................................................................... 66
F. Culture en suspension, culture sur support solide ....................................................................................... 67
G. Les différents types de culture cellulaire ..................................................................................................... 67
II. Méthodes de séparation ........................................................................................................................................ 68
A. La cytométrie en flux .................................................................................................................................... 68
B. Fractionnement cellulaire, ultracentrifugation ............................................................................................ 69
C. Chromatographie ......................................................................................................................................... 72
D. Électrophorèse ............................................................................................................................................. 73
III. Méthodes de quantification et d’analyse .............................................................................................................. 75
A. Spectrophotométrie ..................................................................................................................................... 75
B. Électrotransfert des protéines sur support solide ....................................................................................... 77
C. Détection des protéines ............................................................................................................................... 78
D. Microscopie .................................................................................................................................................. 80
IV. Notions de génie génétique .................................................................................................................................. 84
A. Les vecteurs .................................................................................................................................................. 84
B. Les enzymes utilisées le plus couramment en génie génétique .................................................................. 85
C. Le clonage .................................................................................................................................................... 86
D. Électrophorèse des acides nucléiques ......................................................................................................... 87
E. Hybridation moléculaire et sondes .............................................................................................................. 88
F. Marquage des acides nucléiques - Marquage in vitro ................................................................................. 89
G. La PCR ........................................................................................................................................................... 89
L’interférence par ARN ou RNAi....................................................................................................................................... 93
I. Un peu d’histoire ..................................................................................................................................................... 93
II. Mécanismes ............................................................................................................................................................ 93
III. Un outil extrêmement puissant pour inhiber l’expression d’un gène cible .......................................................... 94
Le cytosquelette .............................................................................................................................................................. 97
I. Structuration du cytosol par des filaments constituants le cytosquelette .............................................................. 97
A. Filaments d’actine ........................................................................................................................................ 98
B. Microtubules (MT) ....................................................................................................................................... 99
C. Filaments intermédiaires : grande famille hétérogène de protéines......................................................... 101
Maturation et transport des constituants de la cellule................................................................................................... 103
I. Compartimentation des cellules eucaryotes ......................................................................................................... 103
A. Introduction ............................................................................................................................................... 103
5 Année 2017 - 2018

Sommaire
B. Origines possibles de ces organites ............................................................................................................ 104

C. Comment reconnaître la route suivie par les protéines ............................................................................ 105
D. Deux routes divergentes ............................................................................................................................ 105
E. Trois façons différentes d’aller d’un compartiment à l’autre .................................................................... 106
F. Ce qui détermine le destin d’une protéine ................................................................................................ 107
II. Le compartiment cytosolique ............................................................................................................................... 107
A. Modifications des protéines dans le cytosol, réversibles ou non .............................................................. 107
B. Attachement à la membrane de certaines protéines du cytosol ............................................................... 108
C. Adoption d'une conformation par les protéines en cours de synthèse ..................................................... 108
D. Rôle des protéines chaperons dans la conformation des protéines .......................................................... 108
E. Protéolyse sélective par les protéasomes, dépendante d’une étiquette .................................................. 110
F. Deux façons d’induire la dégradation spécifique d’une protéine .............................................................. 110
G. Différentes sortes d’ubiquitinylation pour des rôles différents de l’ubiquitine ......................................... 110
H. Résistance aux protéases de certaines protéines de conformation anormale .......................................... 110
III. Le transport cytoplasme – noyau ........................................................................................................................ 110
A. Transport à travers les pores du noyau...................................................................................................... 110
IV. Le transport à partir du réticulum endoplasmique (RE)...................................................................................... 114
A. RE endoplasmique granulaire et RE lisse ................................................................................................... 114
B. RE lisse dépourvu de ribosomes et abondant dans certaines c. ................................................................ 115
C. Séparation possible du RE lisse et RE granulaire ........................................................................................ 115
D. Transport des protéines à travers la membrane du RE granulaire ............................................................ 115
E. Ce qui se passe dans la lumière du RE........................................................................................................ 123
F. Synthèse des lipides au niveau du RE......................................................................................................... 127
V. Mécanismes mol. du transport par des vésicules et maintien de la diversité des différents compartiments ..... 129
A. Principe du transport, problématique et questions ................................................................................... 129
B. Stratégies d’étude du transport par les vésicules ...................................................................................... 130
C. Plusieurs types de couverture des vésicules .............................................................................................. 131
D. Mécanismes de formation des vésicules recouvertes ............................................................................... 131
E. Vésicules recouvertes de COPI et COPII ..................................................................................................... 132
F. Mécanismes moléculaires du transport par les vésicules .......................................................................... 133
VI. Transport des protéines à travers l’appareil de Golgi ......................................................................................... 137
A. Organisation de l’appareil de Golgi ............................................................................................................ 137
B. Principes généraux du transport dans le Golgi par des vésicules .............................................................. 137
C. Modifications des chaînes N-oligosaccharidiques dans le Golgi ................................................................ 140
D. Modification des chaînes O-oligosaccharidiques dans le Golgi.................................................................. 141
E. Modifications séquentielles dans des compartiments spécialisés ............................................................. 143
F. Conséquences pour les protéines modifiées ............................................................................................. 143
VII. Transport à partir de l’appareil de Golgi ............................................................................................................ 143
A. Différentes voies possibles à partir de la face trans du Golgi .................................................................... 143
B. Vers les lysosomes ..................................................................................................................................... 144
C. Vers les vésicules de sécrétion et la surface de la cellule : exocytose ....................................................... 149

Polycopié UE2
VIII. Transport à partir de la membrane plasmique : endocytose ............................................................................ 156

A. Introduction et définitions ......................................................................................................................... 156
B. Pinocytose .................................................................................................................................................. 156
C. Endocytose par récepteur interposé .......................................................................................................... 157
D. Quelles routes après l’endocytose ? .......................................................................................................... 159
E. Dans les c. épithéliales : 2 compartiments distincts d’endosome initial .................................................... 161
IX. Transport vers les mitochondries ........................................................................................................................ 161
A. Structure générale de la mitochondrie et problèmes de transport ........................................................... 161
B. Moyens d’étude de la mitochondrie .......................................................................................................... 163
C. Génome de la mitochondrie, sa réplication et son expression .................................................................. 164
D. Démonstration du transport par des méthodes biochimiques .................................................................. 165
E. Translocation dans la matrice de la mitochondrie ..................................................................................... 166
X. Le cas des peroxysomes ....................................................................................................................................... 169
A. Introduction ............................................................................................................................................... 169
B. Ce qu’il se passe dans les peroxysomes ..................................................................................................... 169
C. Importation de tout le contenu à partir du cytosol ................................................................................... 169
D. Biogenèse et division des peroxysomes ..................................................................................................... 169
Matrice extracellulaire et adhésion cellulaire ................................................................................................................ 173
I. MEC : ensemble structuré de macromol. mis en place par les cellules dans leur environnement immédiat ....... 173
II. Tissus conjonctifs .................................................................................................................................................. 173
A. Des propriétés mécaniques très diverses .................................................................................................. 173
B. Les collagènes sont les principaux constituants protéiques EC des TC ...................................................... 174
C. Structure des collagènes ............................................................................................................................ 174
D. Les fibres élastiques sont composées d’élastine ........................................................................................ 175
E. La fibronectine est une prot.à multiples dom. qui aide les cellules à s’attacher et qui organise la MEC ........ 175
F. Polysaccharides et protéines de la matrice ..................................................................................................... 175
III. La lame basale ..................................................................................................................................................... 176
A. Introduction : des fonctions variées ........................................................................................................... 176
B. Les laminines sont les composants principaux des lames basales ............................................................. 176
C. Le collagène IV donne à la lame basale sa force élastique......................................................................... 177
IV. Jonctions cellulaires ............................................................................................................................................ 177
A. Jonctions serrées ........................................................................................................................................ 178
B. Jonctions d’ancrage .................................................................................................................................... 178
C. Les jonctions communicantes (gap junctions) ........................................................................................... 180
V. Conclusion ............................................................................................................................................................ 180
Communications cellulaires chimiques et leur régulation .............................................................................................. 181
I. Introduction ........................................................................................................................................................... 181
II. Principes généraux de la communication chimique ............................................................................................. 182
A. Classification selon la distance parcourue par la molécule de signalisation .............................................. 182
B. Caractéristiques de la signalisation chimique ............................................................................................ 184
III. Transport des petites molécules à travers la membrane .................................................................................... 188
7 Année 2017 - 2018

Sommaire
A. Introduction ............................................................................................................................................... 188

B. Principes du transport à travers la membrane .......................................................................................... 189
C. Protéines de transport et transport actif à travers la membrane .............................................................. 190
IV. Signalisation via des récepteurs transmembranaires ......................................................................................... 196
A. Signalisation via des récepteurs couplés aux protéines G ......................................................................... 196
B. Production de l’AMPc par régulation de l’activité de l’adénylyl-cyclase ................................................... 197
C. Voie d’activation des inositol-phospholipides via une phospholipase C-β ................................................ 200
D. Odorat et vision dépendent de récepteurs couplés aux protéines G ........................................................ 203
E. Signalisation par l’intermédiaire de récepteurs associés à une enzyme.................................................... 204
Division et cycle de division de la cellule, apoptose ....................................................................................................... 211
I. Mécanismes de division de la cellule .................................................................................................................... 211
A. Introduction ............................................................................................................................................... 211
B. Les différentes phases du cycle de division de la cellule ............................................................................ 212
C. Division de la phase M en six phases ......................................................................................................... 213
D. Préparation des chromosomes à la mitose ................................................................................................ 214
E. Mise en place d’une machine du cytosquelette pour assurer la division .................................................. 216
F. Les étapes de la mitose .............................................................................................................................. 218
G. Dynamique des microtubules au cours de la mitose ................................................................................. 219
H. La cytodiérèse ............................................................................................................................................ 221
II. Cycle de division de la cellule (cycle cellulaire) .................................................................................................... 222
A. Constituants du système de régulation du cycle de division de la cellule ................................................. 222
B. Régulation intracellulaire des événements du cycle de division cR. ........................................................... 226
III. Apoptose et mort de la cellule ............................................................................................................................ 232
A. Définitions : nécrose et apoptose .............................................................................................................. 232
B. Marqueurs biochimiques des cellules en apoptose ................................................................................... 233
C. Apoptose déclenchée par une cascade de protéolyses intracellulaires..................................................... 233
D. Activation initiale des pro-caspases ........................................................................................................... 234
E. Protéines pro-apoptose et anti-apoptose .................................................................................................. 235
Remerciements et Remarques ....................................................................................................................................... 238

De la cellule au noyau et à l’ADN, support de l’hérédité

Rédigé à partir du cours du Pr SCHAEFFER
Pour ce chapitre, l'important est surtout de comprendre et d'assimiler les notions fondamentales
abordées. Les expériences sont donc à comprendre et non à apprendre. Il faut néanmoins s'attarder sur
les conclusions qui en sont tirées.
I. Introduction
Différentes dates concernant les découvertes de la cellule et de ses constituants :
§ 1869. – Découverte de l’Acide DésoxyriboNucléique (ou ADN), seulement dix ans après
les travaux de Charles Darwin et quatre ans après les expériences de Mendel sur
l’hybridation des plantes.
§ 1900. – Découverte de la constitution des acides nucléiques et de la notion de
complémentarité des bases. Un acide nucléique est composé :
- de sucres à cinq carbones,
- de phosphates acides,
- de bases riches en azote (A, T/U, G, C) dites complémentaires, ne s’associant pas
aléatoirement mais fonctionnant par couple.
§ 1920. – Différenciation entre l’acide désoxyribonucléique (ADN) et l’acide ribonucléique
(ARN). Ces deux acides se différencient, entre autres, par leur composition en bases :
- dans l’ADN les quatre bases majeures retrouvées sont A, T, G, C ;
- dans l’ARN les quatre bases majeures retrouvées sont A, U, G, C.
Remarque. – Ces deux molécules sont des acides nucléiques, elles respectent la constitution
donnée ci-dessus ainsi que les règles de complémentarité des bases.
§ 1928-1935. – Découverte de la liaison chimique par Linus Pauling.

§ 1950. – Erwin Chargaff découvre que la composition en bases de l’ADN varie d’un
organisme à l’autre mais que les rapports !/# et $/% sont quasiment égaux et proches
de 1 (signifiant qu’il y a autant de A que de T, et autant de G que de C). La notion de
complémentarité des bases se précise.
§ 1953. – Watson et Crick découvrent la formation en double hélice de l’ADN en s’appuyant
sur les travaux de Franklin et Wilkins.
II. Localisation de l’information génétique dans la cellule

A. Information génétique contenue dans le noyau
1. Première expérience
La notion d’information génétique a été mise en valeur par des expériences, notamment par celle
présentée ici et conduite avec des souris. Le principe est simple :
9 Année 2017 - 2018

UE2 – Biologie cellulaire
§ Nous prenons un noyau de cellule germinale d’une souris grise.

ÙÙ
Germinale (cellule). – En génétique, désigne les gamètes et leurs précurseurs. En immunologie,
désigne toutes les cellules dans lesquelles les gènes de l’immunité ne subissent pas de
réarrangement.
§ Nous l'introduisons dans l'ovocyte (démuni de contenu génétique) d’une souris noire.
ÙÙ
Ovocyte ou oocyte. – Gamète femelle, cellule à vitellus (= ensemble de substances de réserves)
abondant, munie d’une enveloppe (follicule) ; le terme d’ovule est plutôt employé en médecine et
en anatomie qu’en embryologie.
ÙÙ
Pronucléus. – Noyaux des gamètes dans l’ovocyte fécondé, avant leur fusion.
§ Nous cultivons l'ovocyte in vitro (pour qu'il puisse poursuivre son développement).
§ Nous l'injectons sous forme de blastocyste dans l’utérus d’une souris porteuse qui se
trouve être une souris blanche.
ÙÙ
Blastocyste. – Forme segmentée de l’œuf fécondé, au moment où il entre dans l’utérus. Le terme
de blastocyste correspond donc à un stade de développement de l’œuf fécondé.
La souris naissante est alors de couleur grise.
Schéma de la première expérience.
Le noyau porte l’information génétique et a déterminé la couleur de la souris

naissante. L’utérus de la souris porteuse (blanche), tout comme le cytoplasme de la souris
Conclusion
receveuse (noire), n’ont pas eu d’influence dans la transmission des caractères

héréditaires.
Le noyau de la souris grise porte à lui seul l’information génétique
permettant le développement du phénotype de la souris grise.
Cette expérience soulève deux notions importantes, celles du génotype et du phénotype. Ces
deux termes sont différents.

ÙÙ
Génotype. – Constitution génétique d'un individu.
ÙÙ
Phénotype. – Manifestation apparente de la constitution du génome sous la forme d’un trait
morphologique, d’un syndrome clinique, d’une variation qualitative ou quantitative du produit
final d’expression d’un gène.
2. Seconde expérience
Le modèle animal varie, nous travaillons ici avec des bovins. Le principe est le suivant :
Remarque. – correspond à la numérotation du schéma bilan de l’expérience ci-dessous.
§ (1) – Un embryon est prélevé au stade de 32 cellules sur une vache de race Holstein.
§ (3) – Parmi ces 32 cellules, l'une est prélevée et son noyau est aspiré.
§ (2) – En parallèle un ovule non fécondé est prélevé sur une vache d’une autre race. Le
noyau de l’ovule non fécondé est retiré. Nous obtenons donc un ovule dénué de noyau.
§ (4) – Le noyau prélevé sur une des 32 cellules de l’embryon de la vache Holstein est
transplanté dans l’ovule non fécondé de l’autre vache de race inconnue, dont nous avons
préalablement enlevé le noyau.
§ (5) – Ce tout nouvel embryon, constitué d’un noyau de cellule embryonnaire Holstein et
d’un ovule d’une autre vache, est réimplanté dans une vache porteuse.
§ (6) – Après gestation, naissance d’un veau de phénotype Holstein.
Schéma de la seconde expérience.

Conclusion
La conclusion est identique à celle de l'expérience précédente, à savoir :

Le noyau porte à lui seul l’information génétique
permettant le développement d'un organisme.
11 Année 2017 - 2018

Une seconde notion importante est abordée : l’haploïdie et la diploïdie des cellules.
ÙÙ
Haploïde. – Jeu de chromosomes dans lequel il n'existe qu'un seul exemplaire de chaque
autosome et un seul chromosome sexuel (étant n). Les gamètes sont des cellules haploïdes.
ÙÙ
Diploïde. – Jeu de chromosomes où chaque autosome est en double exemplaire et comporte
deux chromosomes sexuels (état 2n).
B. Utilisation par la cellule de l’information contenue dans le noyau

1. Expérience sur les acétabulaires (algues unicellulaires)
Les acétabulaires sont des algues qui possèdent la particularité de n’être constituées que d’une
cellule. Elles ne contiennent ainsi qu’un seul noyau. Un tel type d'algue peut être divisé en trois
portions : un chapeau, une partie centrale et une partie basale. Nous notons que le noyau est présent
dans la partie basale de l’algue.
§ Expérience 1. – Sections et régénérations.

Nous nous apercevons que lorsque nous coupons les acétabulaires en trois portions (comme cité
ci-dessus), seule la portion contenant le noyau est en mesure de régénérer une algue complète.
§ Expérience 2. – Transplantation du noyau.

Lorsque l’algue est coupée en trois portions et que le noyau est transplanté dans la partie
centrale, nous remarquons que c’est la portion centrale qui persiste et qui possède la capacité de
régénérer une nouvelle algue (alors que la partie basale ne persiste pas).
§ Expérience 3. – Greffe croisée des noyaux.

Nous prenons deux espèces d’acétabulaires, nous retirons leurs chapeaux, puis nous procédons
à un échange croisé de leurs noyaux. Nous constatons alors que chaque acétabulaire régénère un
chapeau en lien avec le noyau nouvellement implanté.
Schéma de l'expérience 3. – Greffe croisée des noyaux.
La cellule utilise l'information génétique contenue dans le noyau.

Conclusion
Deux noyaux identiques provenant de cellules issues de la division d'une cellule

initiale unique vont donner deux individus identiques par déroulement du même
processus d'expression génique.

Il apparaît ici une autre notion importante qu'est la notion de clonage.

ÙÙ
Clonage cellulaire. – Isolement d’une cellule et de sa descendance pour former une lignée
cellulaire qui provient donc d’un unique ancêtre. Toutes les cellules issues de cet ancêtre possèdent
un génotype identique et sont appelées clones.
ÙÙ
Clonage moléculaire. – Recombinaison in vitro d’un gène et, par extension, d’un fragment
d’ADN avec un vecteur qui se réplique de façon autonome à l’intérieur d’une cellule hôte. La culture
de cette cellule qui contient le vecteur recombiné permet l’isolement de l’ADN inséré, à l’état pur
et en quantités illimitées.
2. Le clonage
Il y a une vingtaine d’années, le premier clonage sur un mammifère à partir d’un noyau d'une
cellule somatique (non germinale) a été réussi. La brebis a vécu de 1996 à 2003. Le principe était le
suivant : le noyau d’une cellule de glande mammaire issu d’une brebis « Finn-Dorset » a été introduit
dans l’ovocyte énucléé (= dont nous avons enlevé le noyau) d’une brebis « Black Face ». L’embryon,
au stade blastocyste, a été réimplanté dans l’utérus d’une mère porteuse « Black Face ». La brebis née
est un clone de la brebis « Finn-Dorset » et possède le même génome que celle-ci. Elle a été nommée
Dolly.
III. Nature chimique du matériel génétique

A. Transformation des bactéries, découverte de la substance transformante
1. Expérience de Frederick Griffith
Griffith a utilisé deux souches de bactéries pneumocoques : une première « R » (inoffensive) et
une seconde « S » (virulente). Il a injecté ces deux souches chez des souris dans des conditions
différentes notées dans le tableau ci-dessous.
Nature de l’injection chez la souris Conséquence sur la souris

Souche S Mort
Souche R SURVIE
Souche S tuée par la chaleur SURVIE
Souche S tuée par la chaleur + souche R

Mort (et toutes les bactéries ont un aspect S)
vivante
Conclusion
Un principe actif transféré de la souche S, pourtant rendu inoffensif par la chaleur, a

converti la souche R en souche pathogène.
13 Année 2017 - 2018

2. Recherche du principe actif transformant – Expérience d’Oswald T. Avery

1930-1933. – Cette expérience reprenant le principe de la précédente démontre deux choses.
§ Premièrement, la capside polysaccharidique de la souche S seule ne peut pas transformer

les bactéries de la souche R en bactéries virulentes. La substance transformante n’est
donc pas cette capside.
§ Deuxièmement, grâce au microscope nous identifions que la pathogénicité de la souche

R est obtenue par formation d'une paroi polysaccharidique non présente initialement.
1944. – La substance transformante est dévoilée. En effet, nous découvrons qu’après mélange
d’ADN purifié de la souche S aux bactéries de la souche R, la souche R possède un pouvoir pathogène.
Avery, Macleod et McCarthy ont conclu que la substance induisant la transformation est
vraisemblablement un « gène » dont le produit serait la paroi polysaccharidique initialement absente
de la souche R.
B. Découverte de la fonction d’un gène

1. Expérience d’Archibald Edward Garrot
Archibald Garrot est un médecin qui a étudié l’alcaptonurie (maladie qui provoque une atteinte
au niveau du métabolisme de la phénylalanine et de la tyrosine engendrant un excès d’acide
homogentisique colorant les urines en noir). L’alcaptonurie est une maladie récessive (d’origine
héréditaire) qui est provoquée par une enzyme : l’homogentisatedioxygénase. Cette enzyme permet
normalement la dégradation de l’acide homogentisique en acide maleylacetoacétique.
Conclusion
Grâce à ses travaux sur cette maladie (alcaptonurie), Archibald Garrot est
le premier à faire une relation entre une protéine [enzyme] et un gène.
2. Expérience de Beadle et Tatum

Le principe de l’expérience est de bombarder des spores de levures aux rayons X afin d’induire
des mutations et de voir ensuite les conséquences de ces mutations. Nous nous servons d’une voie de
métabolisme connue, que les levures sont normalement capables d’effectuer (tableau).
Métabolisme AVANT rayons X Métabolisme APRÈS rayons X
Levures : plus capables de pousser dans un milieu

Précurseur Æ ornithine Æ citrulline Æ arginine
avec le minimum de bonnes conditions
Après traitement aux rayons X, les levures ne sont plus capables de transformer la molécule
précurseur en arginine. La question que se sont alors posée les chercheurs était de savoir précisément
quelle portion de la cascade réactionnelle était perturbée par les rayons X. Ils ont alors utilisé différents
milieux composés directement d’ornithine, de citrulline ou d’arginine. En déposant les levures sur ces
milieux, ils ont pu savoir comment la mutation avait atteint les levures.

Schéma du principe de l'expérience de Beadle et Tatum.
Exemple. – Prenons une colonie de levures atteinte d’une mutation les empêchant de synthétiser
l’enzyme nécessaire pour passer de la molécule précurseur à l’ornithine (1ère réaction de la voie
métabolique). Leur chaîne métabolique est bloquée alors qu’elles sont capables de transformer
l’ornithine en citrulline et la citrulline en arginine. En les déposant sur un milieu riche en ornithine,
elles pourront synthétiser l’arginine.
Les rayons X induisent des mutations au niveau d'un ou plusieurs gènes chez différentes
Conclusion
cellules de levures ce qui bloque la synthèse d'arginine à différents niveaux.

Le lien entre un gène et une protéine s'éclaircit :
une atteinte génomique peut posséder une conséquence au niveau protéique.
C. Redécouverte de la substance transformante

1. Expérience d’Hershey et Chase « The Blender Experiment. »
À la même époque, Hershey et Chase essayaient de démontrer que l’ADN était la substance
transformante. Le principe de leur expérience était d’analyser le mode d’action d’un bactériophage (=
virus mangeant les bactéries) sur la membrane d’une bactérie.
Connaissance actuelle. – Le phage injecte son ADN dans la bactérie qui va exprimer cet ADN et
même produire certaines particules phagiques. Ces particules vont elles-mêmes pouvoir aller
infecter d’autres bactéries et les lyser. Nous obtiendrons dès lors des plages de lyse (c’est-à-dire
des trous dans la membrane bactérienne suite à l’injection de l’ADN phagique). Ces multiples lyses
auront raison de la bactérie.
Revenons maintenant à l’époque de l’expérience du Blender. Pour connaître le rôle des

composants phagiques, les chercheurs utilisent le marquage isotopique :
§ le soufre 35 (35S) va marquer radioactivement une protéine de la capside du phage. Si

cette protéine est synthétisée par la bactérie, elle sera marquée par cet isotope.
§ le phosphore 32 (32P) est incorporé à l’ADN du phage. Tout l’ADN phagique synthétisé par
la bactérie sera alors marqué au 32P et sera visible au sein de la bactérie.
Suite à la fixation, nous passons le tout au mixeur (« blender » en anglais) pour effectuer une
agitation mécanique qui détache les virus de la bactérie, et ainsi tout remettre en suspension. Après
le blender, nous passons à la centrifugation.
15 Année 2017 - 2018

Centrifugation. – Méthode de séparation des constituants d’une solution. Le principe est de faire
tourner à haute vitesse des tubes contenant la solution. La gravité étant augmentée, la
sédimentation des éléments s’initie avec les éléments les plus lourds qui migrent au fond du tube.
§ Les éléments les plus lourds vont aller au fond du tube et former le culot.
§ Les éléments les plus légers restent en surface et forment le surnageant.
CULOT
SURNAGEANT
Observations (essentiellement les
(essentiellement des phages)
bactéries)
Phosphore 32 (32P) OUI NON
Soufre 35 (35S) NON OUI
L'ADN du phage reste pour l'essentiel dans la bactérie (= culot) alors que les
protéines du phage sont essentiellement retrouvées dans le surnageant.
Conclusion
Les protéines du phage arrachées des bactéries par l'agitation au mixeur sont des
protéines de la capside du phage.
Supposition. – Ces protéines servent de véhicule passif pour
le transport de l'ADN d'une cellule bactérienne à une autre cellule bactérienne.
D. ADN support de l’information génétique

1. Introduction
Linus Pauling est la personne qui a décrit la liaison chimique, la façon dont les liaisons se forment.
Sans ses travaux, il n’aurait pas été possible de déduire la structure de l’ADN. C’est un des seuls
scientifiques qui a été récompensé par deux prix Nobel.
2. Découverte et composition chimique de la « nucléine »

1869. – Friedrich Miescher, médecin Suisse, isole une substance qu’il appela la nucléine, à partir
de grands noyaux de globules blancs, provenant de bandages chirurgicaux souillés par du pus.
Remarque. – Ici, l’historique de la découverte de l’ADN est réabordé. Il a déjà été détaillé dans
l’introduction du chapitre.
Rappel. – Composition des acides nucléiques :

§ Cinq types de bases azotées,
§ Sucres à cinq carbones,
§ Phosphates acides.

3. Les bases azotées

Adénine Guanine
Purines
Thymine Cytosine Uracile

Pyrimidines
§ Les 4 bases azotées A, G, T et C sont les 4 principales bases de l’ADN.
§ Les 4 bases azotées A, G, U, C sont les 4 principales bases de l’ARN.
4. Les sucres
Les sucres composant les acides nucléiques ADN et ARN, possèdent cinq carbones. Le sucre en
question reste le même, c’est un ribose dans les deux cas. Ce qui varie cependant entre l’acide
désoxyribonucléique et l’acide ribonucléique est l’état du sucre. En effet, le ribose est sous sa forme
« classique » dans l’ARN alors qu’il est sous forme « désoxy » (littéralement avec un atome d’oxygène
en moins) de son carbone n°2 dans la composition de l’ADN. Cette absence d’atome d’oxygène sur le
carbone n°2 du ribose formant un 2’-désoxyribose est à l'origine de la formation en double hélice de
la molécule d’ADN, au contraire de la molécule d'ARN. La base, quant à elle, est accrochée sur le
premier carbone du sucre.
Ribose = présent dans l'ARN 2'-désoxyribose = présent dans l'ADN
17 Année 2017 - 2018

5. Les phosphates
Ils sont accrochés au niveau du carbone n°5 du sucre. Leur nombre peut varier d’un à trois.
Lorsqu’ils sont plusieurs, nous les nommons en partant du ribose : α (alpha), β (bêta) et ɣ (gamma).
E. Nature de la liaison chimique et diffraction des rayons X

Quelle que soit la configuration du sucre, ribose ou désoxyribose :
§ la base azotée s’accroche toujours sur le carbone n°1 du sucre,
§ les phosphates s’accrochent sur le carbone n°5 du sucre.
Voici par exemple l’adénosine 5’-monophosphate (en forme abrégée l’AMP) :
Adénosine 5'-monophosphate (ATP)
Remarque. – Ici, le cours incite fortement à définir la notion de nucléotide mais cela est réalisé plus
tard, alors dans le respect de la chronologie du cours cette notion est explicitée ci-après.
Les rayons X ont été utilisés pour faire avancer nos connaissances sur les acides nucléiques :
§ 1912. – Max Von Laue découvrit qu’en tirant des rayons X sur des cristaux simples, les
rayons X subissaient un phénomène de diffraction.
§ Même année. – Deux autres physiciens (William Henry Bragg et William Lawrence)
résolurent les équations mathématiques nécessaires à l’interprétation des schémas et les
utilisèrent pour déterminer la structure moléculaire du sel de table (NaCl).
§ 1934. – John Desmond Bernal a réussi à cristalliser des protéines par augmentation lente
de la solution saline. À la suite de cette cristallisation, Desmond a eu l’idée de bombarder
ces protéines par des rayons X. Par l’étude de la déviation des rayons, il a réussi à observer
la structure d’une protéine : la pepsine.
§ Rosalind Franklin eut la même idée que Desmond avec une autre structure : l’ADN. Elle
obtient alors les premiers clichés de diffraction des rayons X sur un cristal d’ADN.
F. Structure de l’ADN
Erwin Chargaff, grâce aux techniques de la chromatographie sur papier et de la spectroscopie UV
a publié ses résultats sur les rapports de bases azotées de l’ADN. Il démontre que :

(' ) *)
§ les rapports sont spécifiques pour une espèce donnée,
(, ) -)
§ les rapports '/* et ,/- sont tous deux quasiment égaux à 1.
Ceci signifie que, dans une molécule d’ADN, nous retrouvons :

autant de bases azotées adénines que de thymines et autant de cytosines que de guanines.
Malheureusement pour Franklin, qui avait été la première à réaliser des clichés de la diffraction
des rayons X sur ADN, c’est à Watson et Crick que revient la découverte de la structure moléculaire
des acides nucléiques, et particulièrement la découverte de la structure en double hélice de l’ADN.
Watson et Crick ont également publié des articles dans lesquels ils énoncent des lois importantes
concernant l’ADN :
§ les « chaînes » de l’ADN sont complémentaires impliquant qu'avec la séquence d’un des deux
brins, nous pouvons déduire la séquence en bases azotées de l’autre brin ;
§ le sucre présent dans l’ADN est forcément un ribose sous sa forme 2’-désoxyribose car l’atome
d’oxygène supplémentaire rendrait trop proche une force de Van der Waals ;
§ un mécanisme de copiage précis du patrimoine génétique existe certainement.
Voici les principales caractéristiques de la forme B de l’ADN selon Watson et Crick :

ÙÙ
Nucléoside. – Base purique ou pyrimidique liée de façon covalente à un ribose ou à un
désoxyribose. Nucléoside = base + sucre.
ÙÙ
Nucléotide. – Nucléoside auquel est lié un ou plusieurs phosphates par une liaison ester en 5’ du
sucre. L’ADN et l’ARN = polymères de nucléotides. Nucléotide = base + sucre + phosphate(s).
L’ADN est une structure à deux brins, chaque brin étant une suite de nucléotides. À l’intérieur
de chaque brin, les nucléotides sont reliés les uns aux autres via une liaison phosphodiester 3’-5’. En
effet, la liaison entre les nucléotides se fait via les phosphates accrochés en 5’ sur le sucre sous-jacent
et en 3’ sur le sucre sus-jacent.
Notion fondamentale. – L’ADN n’est pas symétrique, chaque brin possède un sens. L’extrémité
possédant un phosphate seul en 5’ du sucre est dite « extrémité 5’ ». L’autre extrémité possédant
un groupement hydroxyle (OH) en 3’ du sucre est appelée extrémité 3’.
Oligo-désoxyribonucléotide 5'-CAG-3'.
Oligo est un terme venant du grec « oligos » signifiant « peu nombreux », « petit ».
19 Année 2017 - 2018

Sur une molécule d'ADN, nous pouvons différencier :

§ le squelette de l’ADN invariable et composé des sucres et des phosphates,
§ les bases qui peuvent être différentes de la précédente à chaque étage au sein d’un
même brin (la présence une suite de 50 adénines n'est cependant pas impossible).
Structure de l'ADN en deux dimensions.
1. Complémentarité des bases et structure en hélice de l’ADN
La molécule d’ADN est bicaténaire c’est-à-dire qu’elle est composée de deux brins de
polynucléotides qui s’enroulent autour d’un axe commun. L’enroulement est tel que nous parlons de
structure en hélice. Cette hélice possède des caractéristiques connues :
§ elle tourne vers la droite,
§ elle fait 2 nm de diamètre.
Précédemment, nous avons vu qu’au sein de chaque brin les nucléotides étaient reliés via une
liaison phosphodiester 3’-5’. Enfin, les deux brins de l’ADN sont reliés par les liaisons hydrogène des
bases de chaque paire de nucléotides.
La complémentarité des bases est telle que :

§ la formation adénine-thymine est faite par deux liaisons hydrogène,
§ la formation guanine-cytosine est faite par trois liaisons hydrogène.
Notion fondamentale. – Il est important de comprendre que les formations A=T au sein d’une
double hélice d’ADN vont être plus faciles à défaire que les formations Gº C au sein d’une même
hélice. Ceci est expliqué par la présence de trois liaisons hydrogène dans la formation Gº C.
Au sein d’une paire de base, les deux bases sont sur un même plan. Les plans des bases sont à peu
près perpendiculaires à l’axe de l’hélice. L’hélice d’ADN présente 10 paires de bases par tour d’hélice
(représentant simplement le fait de faire un tour complet - 360°). Dix pb par tour d’hélice
correspondent à une torsion de 36° par pb (360/10). Puisque les noyaux aromatiques des bases ont
une épaisseur de Van der Waals de 0,34 nm et que les bases sont empilées les unes sur les autres, le
pas de l’hélice (= 1 tour complet d’hélice) est de 3,4 nm.

Structure de l'ADN simplifié en trois dimensions.
2. Antiparallélisme des deux brins d’une molécule d’ADN

Les deux brins de l'ADN sont antiparallèles, c’est-à-dire qu'ils possèdent une orientation inverse
dans l’espace. Ainsi, imaginons que nous attrapons une molécule d’ADN par une de ses extrémités,
nous trouverions sur un brin une extrémité 5’ et sur l’autre une extrémité 3’.
ÙÙ
Antiparallèle. – Se dit de l’orientation inverse des brins complémentaires de l’ADN. Il en résulte
que l’extrémité 5’ d’un brin est en regard de l’extrémité 3’ de l’autre brin.
3. Sillon et charge de la molécule d’ADN

La structure de l’hélice est telle qu’il existe sur l’ADN un grand sillon (lieu majoritaire de fixation
des protéines) et un petit sillon. L'ADN est chargé négativement à cause de ses nombreux
groupements phosphates : ceci va avoir un intérêt dans les liaisons avec des composants externes.
Structure tridimensionnelle de l'acide désoxyribonucléique.
21 Année 2017 - 2018

G. Rappel sur les différentes liaisons rencontrées
ÙÙ
Liaison covalente. – Formée quand deux atomes différents partagent les électrons de l’orbitale
atomique externe. Chaque atome peut former un nombre de liaisons qui lui est propre (par
exemple l’atome de carbone peut former 4 liaisons covalentes). D’une façon générale, dans le
monde du vivant, les liaisons covalentes sont habituellement simples (une paire d’électrons en
commun) ou doubles (deux paires d’électrons en commun).
Liaison ionique. – Complémentarité de charge et de structure.

ÙÙ
Liaison hydrogène. – Une attraction électrostatique entre un atome électronégatif et un atome
d'hydrogène lié de façon covalente à un second atome électronégatif.
ÙÙ
Liaison covalente. – Proviennent de l'attraction électrostatique qui existe entre le noyau d'un
atome, chargé positivement et les électrons d'un autre atome, chargés négativement ; elles
agissent seulement à de très courtes distances.
Il est important de savoir les hiérarchiser de la plus forte à la moins forte. Leurs distances
d’application varient de façon inverse à l’ordre établi ci-dessous.
Liaison covalente > Liaison ionique > Liaison hydrogène >

Forces d’attraction de Van der Waals.
Il existe une dernière sorte d’interaction souvent rencontrée, c’est la liaison dite hydrophobe :
elle ne s’applique que pour les molécules non polaires, insolubles dans l’eau et donc hydrophobes. La
force hydrophobe est la force qui pousse ces molécules à se regrouper (situation énergiquement
favorable).

Transmission des caractères de l’hérédité

I. Mécanismes du maintien de l’information génétique

A. Introduction
Afin de préserver l’espèce, tous les organismes vivants doivent pouvoir répliquer leur ADN avec
précision. La réplication de l’ADN varie selon les organismes, mais elle peut être très fréquente :
certaines bactéries se divisent toutes les 20 minutes ! Cette réplication de l’ADN implique des vitesses
de polymérisation d’environ :
§ 500 nucléotides par seconde chez les bactéries,
§ 50 nucléotides par seconde chez les mammifères.
Tout ceci nécessite donc une machinerie de réplication précise et rapide ainsi qu’un système de
correction des erreurs pour avoir une transmission de l’information génique la plus fidèle possible.
B. Les mécanismes de réplication de l’ADN

1. Appariement des bases : support de la réplication
Notion fondamentale. – Les notions approchées dans cette sous-partie ont déjà été traitées dans
le cours précédent, si certaines vous paraissent encore obscures, mieux vaut retourner s’éclairer
dans le cours 1. Ces notions sont fondamentales.
Base Nucléoside Abréviation

Adénine Adénosine A
Guanine Guanosine G
Cytosine Cytidine C
Uracile Uridine U
Thymine Thymidine T
Adénine Thymine Guanine Cytosine
Base + sucre = nucléoside.

Base + sucre + phosphate(s) = nucléotide.
Structure générale d'un désoxyribonucléotide phosphate.
23 Année 2017 - 2018

ÙÙ
Réplication. – Processus de duplication à l’identique d’1 molécule d’ADN en 2 molécules filles.
Aussi, les deux bases puriques s’accrochent sur le sucre via l’azote n°9 de leur cycle et les deux
bases pyrimidiques s’accrochent sur le sucre via leur azote n° 1. Alors que le numéro de l’azote
accroché sur le carbone 1 du sucre varie, la liaison entre le carbone 5 du sucre et le(s) phosphate(s)
reste invariable (notion de squelette sucre - phosphate des brins, vue dans le premier cours).
Remarque. – Ainsi, si une protéine doit se fixer n’importe où sur la molécule, elle se fixera sur le
squelette de l’ADN ; alors que si une protéine doit se fixer à un endroit précis, elle se fixera grâce à
la séquence de bases.
Rappels. – Les bases des deux brins sont liées entre elles via des liaisons hydrogène (deux pour le
couple A=T et trois pour le couple GºC). Les bases des deux brins sont complémentaires, elles
fonctionnent par couple. L’assemblage des deux brins dans la double hélice est dit antiparallèle. La
double hélice est telle qu’on observe la formation de 2 sillons, un petit et un grand sillon.
Schéma bilan, rappel de la structure globale de l'ADN en deux dimensions.
2. Réplication semi-conservatoire
ÙÙ
Semi-conservatoire (synthèse). – Désigne le fait qu’au cours de la réplication, chaque brin de la
double hélice d’un ADN sert de matrice pour une copie complémentaire.
Matthew Stanley Meselson et Franklin William Stahl sont reconnus pour leurs découvertes en
biologie moléculaire et leurs implications contre le développement d’armes chimiques et biologiques.
Leur expérience concernant la réplication de l’ADN a été la suivante : connaissant la structure de la
double hélice ils ont émis deux hypothèses : soit la réplication de l’ADN est réalisée selon un modèle
conservatoire, soit selon un modèle semi-conservatoire. Leur expérience repose sur le principe de
l’utilisation d'isotopes. Un isotope possède le même nombre de protons que l’atome de référence mais
un nombre de nucléons différents, donc une masse différente.
Exemple. – Le carbone possède normalement 6 protons, 6 neutrons et une masse atomique proche
de 12 g/mol. Il existe un isotope dit carbone 14 car il possède une masse atomique de 14 g/mol. Le
14
C possède donc une masse supérieure au carbone 12 plus fréquemment retrouvé.
Rappels. – Une mole correspond à X grammes d’une substance dont la masse moléculaire (= masse
atomique) est X. Une mole contient 6.1023 molécules de cette substance.

Retour à l’expérience :
Un premier milieu « azote lourd » riche en 15N a été utilisé. Les chercheurs y ont cultivé
1 des cellules durant un nombre de générations élevé. Ils s’assurent ainsi que l’ADN de leurs
cellules est entièrement composé de 15N (l’ADN est riche en azote grâce à ses bases).
Ils transfèrent leurs cellules dans un second milieu riche en azote 14 « classique ». Dans
2
ce milieu, les cellules ont le temps de se diviser deux fois : ainsi, l'ADN est répliqué deux fois.
Les chercheurs ont utilisé une centrifugation du matériel génétique pour déterminer
quelle hypothèse semble véridique :
L’ADN se réplique-t-il selon un modèle conservatoire ou semi-conservatoire ?

3
Rappel. – Dans le cadre d’une réplication conservatoire, les deux brins issus de la cellule
mère sont présents dans la même cellule fille. Ainsi, l’autre cellule possède deux nouveaux
brins, copies des brins parentaux.
Prévisions
Modèle conservatoire Modèle semi-conservatoire
division
Chacune des deux cellules possède un

Nous avons donc une cellule avec deux brin néosynthétisé et un brin issu de la cellule
brins lourds et une cellule avec deux brins mère. Les deux cellules possèdent donc une
ère
légers. La centrifugation nous donne donc situation identique. La première

Après la 1
deux bandes distinctes. centrifugation nous donne une seule bande

commune.
Certaines cellules possèdent un brin issu

ère
de la cellule mère (1 cellule de l’expérience,
15
N) et un brin néosynthétisé. Dans ce cas,
Après la 2 division
après centrifugation, les résultats sont

Nous avons trois cellules avec des brins
comparables à la centrifugation précédente.
légers et une cellule avec deux brins lourds.
nd
Mais certaines autres cellules possèdent un

Nous conservons donc le système en deux
brin « néosynthétisé » de la réplication
bandes différentes.
précédente et un « nouveau » brin
néosynthétisé. Ceci entraîne donc la présence
après centrifugation d’une bande au-dessus
de la précédente (deux brins 14N).
25 Année 2017 - 2018

Schéma bilan de l'expérience Meselson et Stahl.
Remarque. – Le schéma 1 représente l’état des cellules mères composées uniquement d’ADN 15N,
puis 2 et 3 représentent respectivement la première et la seconde réplication.
On aborde ici la notion de brin matrice et de brin néosynthétisé. Dans la réplication de l’ADN,
chaque brin est utilisé comme matrice, c’est-à-dire comme « modèle » pour confectionner un nouveau
brin. Le brin qui sert de base pour être copié est appelé « brin matrice », le brin nouvellement formé
est appelé brin « néo synthétisé ». Dans le cadre de la réplication de l'ADN, les deux brins de la cellule
mère sont utilisés comme matrice. Ainsi, la cellule possède deux brins matrices à partir desquels elle
réalise deux nouveaux brins.
3. Existence d’une fourche de réplication asymétrique

L’ADN présente donc un modèle de réplication semi-conservatif. Comment se fait alors en
pratique la réplication de l’ADN pour aboutir à deux nouveaux brins chacun synthétisés à partir d’un
brin matrice ? La solution se trouve dans l’utilisation d’une réplication avec un système dit de fourches
de réplication asymétriques. Chacune des deux fourches de réplication progresse en sens opposé à
partir d’origine commune.
Schéma représentant les deux fourches de réplication progressant en sens opposés.
Remarque. – Chez les bactéries, les chromosomes sont circulaires.
Afin de mieux comprendre ce phénomène, nous allons nous intéresser à une seule des deux
fourches. Au niveau d’une fourche, concernant la double hélice maternelle (représentée par les deux
brins extérieurs, en jaune sur le schéma) nous nous retrouvons donc dans une situation où l’un des
deux brins est orienté dans un sens 3’"5’ par exemple, et l’autre brin est orienté de façon inverse (les
deux brins sont antiparallèles). Ces deux brins sont ouverts, ce qui permet aux bases d’être accessibles
pour que la réplication de l’ADN puisse se faire.

Hypothèse. – Dans cette situation, nous pouvons penser que chacun des nouveaux brins formés
(à l’intérieur des deux brins maternels, en rouge sur le schéma) va être construit en avançant vers la
fourche de réplication. Ce qui impliquerait qu’un des deux brins nouvellement formés soit construit
depuis son extrémité 3’ jusqu’à son extrémité 5’, et inversement pour l’autre brin nouvellement formé.
Notion fondamentale. – Un brin se construit toujours depuis son extrémité 5’ vers son extrémité
3’. Ainsi seule l’hypothèse de modèle de fourches de réplication asymétriques est validée. Pour que
chacun des deux nouveaux brins soit construit dans le sens 5’"3’, il faut donc qu’un des deux brins
soit construit dans le sens inverse de progression de la fourche.
Schéma bilan de la fourche de réplication asymétrique.
Brin construit dans le sens de progression de la fourche

= RÉPLICATION DIRECTE ou CONTINUE
Brin construit dans le sens inverse de progression de la fourche

= RÉPLICATION INDIRECTE ou DISCONTINUE
(synthèse de petits fragments)
Remarque. – Il est important de ne pas oublier que nous nous sommes intéressés à une des deux
fourches de réplication ; ainsi, le même phénomène est observé sur l’autre fourche de réplication.
Les nucléotides incorporés à l’ADN doivent donc être présentés à la protéine qui les incorpore,
sous leur forme 2’-désoxyribonucléoside-5’-triphosphate, aussi nommé de façon abrégée : dNTP.
L’incorporation des nucléotides aux molécules d’ADN en construction est une étape nécessitant
une protéine spécifique nommée l’ADN polymérase (ADN pol.en abrégé). Mais ce n’est pas si simple,
l’étape d’ajout d’un nouveau nucléotide au brin en construction nécessite de l’énergie pour l’action de
l’ADN polymérase. Cette dernière provient de l'hydrolyse de deux phosphates présents sur les dNTPs
qui sont acheminés vers l'extrémité du nouveau brin en construction. Ainsi, tous les nucléotides sont
incorporés de manière à avoir leur extrémité 3'-OH libre.
Toutes les ADN polymérases polymérisent dans le sens 5’Æ3’.
ÙÙ
Amorce. – Courte séquence d’ADN ou d’ARN, complémentaire du début d’une matrice, servant
de point de départ à la synthèse du brin complémentaire de cette dernière par une polymérase.
27 Année 2017 - 2018

L’ADN pol. ne peut pas commencer seule la polymérisation d’un brin complémentaire au brin
matrice. Il faut au préalable qu’une amorce soit réalisée par une autre protéine.
Ensuite, l’ADN pol. s’occupe de former la liaison du nouvel nucléotide ainsi que de trouver quel
nucléotide placer en face de celui du brin matrice.
Remarque. – Tout comme il existe une ADN polymérase, il existe une ARN polymérase qui
polymérise des brins d’ARN. Une des différences majeures entre ces deux protéines réside dans le
fait que l’ARN polymérase n’a pas besoin d’amorce pour polymériser un nouveau brin.
L'ADN polymérase possède une structure particulière comparable à une main.
PCR : Polymerase Chain Reaction. – Le procédé de polymérisation cité ci-dessus a été découvert
vers 1956 (Arthur Kornberg). Il a donné lieu aux premières synthèses in vitro de brins d’ADN ainsi
qu’aux techniques permettant l’amplification d’un fragment d’ADN, la principale technique étant
la réaction de polymérisation en chaîne (Polymerase Chain Reaction).
L’objectif de la PCR est d’amplifier un fragment d’ADN choisi. C’est-à-dire de créer un grand
nombre de copies semblables d’un morceau d’ADN choisi. En pratique sont nécessaires à la PCR :
§ une ADN polymérase, § 4 dNTPs possibles,
§ une amorce pour chaque brin, § le fragment d’ADN à amplifier
Principe d'un cycle de PCR
Nous chauffons le fragment d’ADN choisi à une température supérieure à 90°C.

1 Cela a pour but de casser les liaisons hydrogène et donc d’ouvrir l’hélice d’ADN, de séparer
les brins.
2 Hybridation des amorces sur les brins « ouverts » grâce à la température.
3 Ajout des ADN polymérases et des dNTP.
4 Diminution de la température, extension des amorces, synthèse des nouveaux brins.

Le problème est que l’ADN polymérase devait être changée à chaque cycle, puisque cette enzyme
est dénaturée par la chaleur. Dans les années 2000 a été découverte dans des bactéries sous-marines
une espèce d’ADN pol qui résiste à des températures supérieures à 90°C (la « Taq Polymérase »).
Problème résolu !
4. Fidélité de la réplication par l’ADN polymérase
Le taux d’erreurs est de

1 pour 1 milliard (109) de nucléotides incorporés.
De façon négative, une mutation génomique peut entraîner l’inactivation d’une protéine. D’une
façon positive, les mutations permettent une diversité protéique, et parfois l’adaptation à un
environnement nouveau.
La fidélité de l’ADN polymérase est due à :

§ une très bonne sélectivité du bon nucléotide par la polymérase,
§ un mécanisme de correction des erreurs.
Ce mécanisme est permis par une fonction de l’ADN polymérase, dite exonucléase 3’"5’. Cette
fonction permet de diminuer les erreurs de réplication de manière directe. En pratique, il existe un site
de contrôle de l’ADN polymérase qui permet de détecter un nucléotide mal apparié. La fonction
exonucléase 3'"5’ de l’ADN polymérase va couper le nucléotide mal apparié (dans le sens contraire
de progression de la polymérisation : 3’"5’), l’éliminer, et ré-apparier le bon nucléotide. L’ADN
polymérase adopte une conformation un peu particulière visible sur le schéma ci-dessous.
Schéma illustrant l'ADN polymérase lors de son activité exonucléasique.
Ainsi, pour que la polymérisation se réalise, il est nécessaire d’avoir une amorce avec son
extrémité 3’-OH appariée. Si ce n’est pas le cas, si l’extrémité 3’-OH de l’amorce n’est pas appariée,
alors l’ADN pol. va utiliser sa fonction exonucléasique 3’"5’, avant de continuer à polymériser.
Remarque. – Il existe des classes d’enzymes qui ont une activité exonucléase, c’est-à-dire qu’elles
ont la capacité de dégrader les acides nucléiques de proche en proche à partir d’une ou des deux
extrémités. Par exemple l’ADN pol. est une enzyme qui possède une fonction exonucléase 3’"5’.
D’autres enzymes possèdent une fonction exonucléase 5’"3’. D’autres encore peuvent avoir les
deux fonctions.
29 Année 2017 - 2018

Nous pouvons maintenant comprendre pleinement pourquoi l’ADN polymérase ne peut

polymériser que dans le sens 5’"3’. C’est tout simplement dû à l’utilisation de son activité
exonucléasique 3’"5’. En effet, si l’ADN polymérase pouvait polymériser dans le sens 3’"5’;
lorsqu’elle retirerait un nucléotide, elle ne pourrait pas en replacer un nouveau car elle ne trouverait
pas l’énergie habituelle, tirée de la coupe des deux phosphates (en effet les deux phosphates ont été
retirés avec le nucléotide retiré).
Schéma explicatif du sens de polymérisation.
5. Amorces initiales nécessaires à l’ADN polymérase

L’amorce est nécessaire à l’action de la polymérase, nous l’avons déjà vu. L’amorce est construite
différemment selon si on s’intéresse au brin polymérisé de façon continue ou discontinue. Cela est dû
à l’activité polymérase, qui se déroule pour toutes les polymérases dans le sens 5’"3’. Par conséquent,
une seule amorce est nécessaire pour la synthèse du brin continu, puisque l’ADN pol. n’aura après
coup, plus qu’à l’allonger. Alors que pour le brin de synthèse discontinue il faudra des amorces très
régulières puisqu’il sera construit dans le sens inverse de celui de progression de la fourche. En théorie,
on observera une amorce tous les 200 nucléotides pour le brin discontinu.
Schéma illustrant la synthèse des deux brins au sein de la fourche de réplication.

6. Nécessité des différents composants pour la réplication chez les eucaryotes
§ Nécessité d'une ARN polymérase
Cette ARN polymérase va réaliser la synthèse de l’amorce. Comme vu précédemment, les ADN
polymérases ont forcément besoin d’une amorce au préalable.
Au contraire, les ARN polymérases peuvent fonctionner sans amorces. Cette enzyme se fixe sur
l’ADN et synthétise un brin d’ARN par polymérisation d’une dizaine de nucléotides. Dans le cadre de la
réplication d’ADN, l’ARN pol. qui réalise les amorces est appelée primase. Une fois que l’amorce est en
place, l’ADN pol. peut polymériser le néo-brin.
RAPPEL : toutes les polymérases, ADN pol. comme ARN pol.,

ont une activité polymérasique 5’Æ3’.
Remarque. – L’ARN pol., par contre, n’a pas d’activité correctrice possible.
§ Nécessité d'une RNase

ÙÙ
ARNase H ou RNase H. – Ribonucléase qui digère l’ARN dans les hybrides ARN/ADN.
Au niveau du brin synthétisé de façon discontinue, une fois l’activité de l’ADN pol. terminée, nous
nous retrouvons dans une situation dans laquelle nous observons une multitude de fragments non
reliés les uns aux autres. Ces fragments, également nommés « fragments d’Okasaki » - d'une longueur
de 1000 à 2000 nucléotides chez les procaryotes et de 100 à 200 nucléotides chez les eucaryotes -
résultent de la synthèse discontinue du second brin d'ADN. Ces fragments sont en partie faits d’hybride
ARN/ADN au niveau de l’amorce, puis d’ADN/ADN sur la partie néosynthétisée.
Intervient ensuite une enzyme nommée

l’ARNase H ou RNase H : elle enlève l’amorce, ce
qui laisse un « trou ». Ce trou est comblé par
l’ADN pol, qui se fixe sur le fragment précédent
et l’allonge jusqu’à ce que les deux fragments
abouchent l’un à l’autre.
§ Nécessité d'une ADN ligase
La ligase ligature l’ADN : elle forme la liaison

manquante entre les nucléotides.
ÙÙ
Ligature. – Union par une liaison 3'-5'
phosphodiester de deux nucléotides
adjacents déjà incorporés dans une chaîne
polynucléotidique.
Pour conclure, ordre d'action des protéines (brin discontinu) :

Primase Æ ADN pol. Æ ARNase H Æ ADN pol. Æ Ligase.
31 Année 2017 - 2018

7. Protéines nécessaires pour ouvrir la double hélice

§ ADN hélicase
Le rôle de cette enzyme consiste à séparer les deux brins d’ADN (déroulement) en consommant
de l’énergie sous forme d’ATP. Cette enzyme, de forme annulaire, travaille devant l’ADN pol.
§ Protéines SSB (« Single-Strand DNA Binding Proteins »)

Lorsque nous séparons les deux brins d’ADN, les nucléotides d’un même brin peuvent s’hybrider
entre eux, si ce brin se replie sur lui-même. Les protéines SSB empêchent ce phénomène. Elle se pose
sur l’ADN pour éviter le repliement intra-chaîne.
8. Machinerie de réplication constituée de protéines associées
Schéma bilan de synthèse des deux brins d'ADN au sein d'une fourche de réplication.
9. Mécanisme similaire pour les procaryotes et pour les eucaryotes

Tout ce que nous avons vu précédemment concerne le monde procaryote, c’est-à-dire celui des
bactéries. La machinerie de réplication de l’ADN des eucaryotes fonctionne selon les mêmes principes
généraux. Seules deux différences persistent :
§ deux ADN polymérases (α et δ) sont utilisées pour la synthèse du brin discontinu (une
seule chez les procaryotes),
§ l’ARN pol. primase est l’une des sous unités de l’ADN polymérase (α) et n’est pas
associée à l’ADN hélicase comme chez les procaryotes.
C. Mécanisme de réparation de l’ADN

ÙÙ
Réparation. – Processus de restauration de l’intégrité d’un brin d’ADN lésé qui, en règle
générale, met en jeu l’utilisation du brin intact comme modèle.
1. Introduction
La réparation de l’ADN est un processus de protection de l’intégrité d’un ADN lésé. Il met en jeu
le brin intact pour corriger l’erreur. La fidélité génétique est issue à la fois de la grande fidélité de la
réplication de l’ADN et des mécanismes destinés à réparer les nombreuses lésions accidentelles de
l’ADN qui affectent l’ADN en permanence. Sur les milliers de changements de séquences qui
surviennent au hasard dans l’ADN d’une cellule humaine, les principales causes d’erreurs sont la
chaleur, les accidents du métabolisme, les radiations et expositions aux substances toxiques de
l’environnement.

2. Conservation et mutations des séquences d’ADN

La fréquence d’erreurs est d’une paire de bases pour 1 milliard (109) de nucléotides formés
correctement. Par conséquent, un gène qui contient 103 paires de bases subirait une modification
toutes les 106 générations.
3. Conséquences différentes des mutations de l’ADN

Notons que presque toutes les mutations qui surviennent dans les gènes des protéines sont
nuisibles mais la plupart des mutations ne touchent pas ces zones-là. La conséquence d’une mutation
est variable selon la cellule touchée. Dans les cellules germinales, la mutation peut être transmise à la
descendance et ceci peut donc compromettre la stabilité du matériel génétique. L’impact peut être
énorme jusqu’à entraîner à très long terme la non-perpétuation de l’espèce. Aucune espèce ne peut
se permettre de laisser accumuler un taux élevé de mutations dans ses cellules germinales, c'est
pourquoi les systèmes de correction des erreurs existent.
Dans les cellules somatiques, la mutation n’est pas transmise et est uniquement présente à
l’échelle de l’individu. Ce qui peut engendrer des événements graves pour l’individu, mais pas pour
l’espèce entière. Les cellules somatiques d’un organisme pluricellulaire doivent être protégées contre
les variations génétiques pour préserver l’individu des proliférations cellulaires non contrôlées qui
entraînent les cancers. La stabilité du matériel génétique des cellules somatiques est indispensable à
la prévention du cancer.
Exemple de syndromes (pas à connaître par cœur, à titre indicatif) :
Nom du syndrome Phénotype Enzyme ou processus en cause
MSH2, 3, 6
Cancer du colon Réparation des mésappariements
MLH1, PMS2
Xeroderma Cancer de la peau, sensibilité aux

Réparation par excision de nucléotides
Pigmentosum UV, anomalies neurologiques
Leucémie, lymphome, sensibilité Protéine ATM, une protéine kinase

Ataxie-télangiectasie
aux rayons X, instabilité du activée lors de la cassure des deux brins
(AT)
génome d'ADN
Réparation par recombinaison

BRCA-2 Cancer du sein et des ovaires
homologue
II. Structure et réplication des chromosomes

A. Introduction
Au vu de l’étendue du matériel génétique que contient un noyau humain, le principal souci va
être un souci de compaction de l’ADN.
ÙÙ
Chromatine. – Structure constituée d’ADN et de protéines qui lui sont associées dans le noyau.
33 Année 2017 - 2018

Nous observons des variations dans l’organisation de la chromatine, selon la cellule mais
également selon l’activité de la cellule (moment du cycle de division par exemple). Par exemple une
cellule neuronale très souvent active aura peu de chromatine condensée. En effet, la chromatine
est une structure extrêmement dynamique, elle n’est pas figée et peut passer d’un état condensé
(= hétérochromatine) à un état décondensé (= euchromatine). L’état de la chromatine est
également lié au niveau de transcription de l’ADN qu’elle contient.
ÙÙ
Hétérochromatine. – Régions du génome où l’ADN existe sous forme très condensée et non
exprimée, et où l’ADN se réplique tardivement.
ÙÙ
Euchromatine. – Régions du génome où l’ADN existe sous forme non condensée et où l’ADN se
réplique en premier.
B. L’ADN au sein du chromosome

1. Longue chaîne d’ADN unique pour chaque chromosome
Un chromosome = une molécule unique d’ADN. L’être humain possède 46 chromosomes donc
46 molécules d’ADN. Les chromosomes sont des structures dynamiques et non figées, la dynamique
des chromosomes est primordiale pour la cellule.
Un chromosome présente :
§ un bras court,
§ un bras long,
Remarque. –Pour le chromosome 22 (48x106 pb), nous estimons que 10 % du bras long représente
40 gènes environ, et qu'1 % du bras long représente environ 4 gènes. Un gène est constitué
d’introns (information génétique non codante) et d’exons (information codante). Chez les
eucaryotes, l’information génétique codante est fragmentée au sein d’un gène. Introns et exons
sont précédés de séquences de régulations.
Pour la réplication de l’ADN sont nécessaires trois éléments :

§ un centromère : constriction des chromosomes qui sépare le bras court (p) et le bras long
(q),
§ deux télomères : extrémités des chromosomes,
§ des origines de réplications : séquence sur laquelle commence la réplication de l’ADN.
La taille de chacune de ces séquences est inférieure à 1000 pb (paires de bases). L’importance
d’une structure n’est pas liée à sa taille.
Le chromosome au cours de différentes phases du cycle cellulaire.

Il n’y a pas de relation entre la complexité d’un organisme et sa quantité relative en ADN. Dans la
nature, certaines espèces, que l’Homme juge comme moins évoluées, peuvent présenter des
caryotypes de 10 à 100 chromosomes.
Il ne faut pas confondre chromosome et plasmide. Un plasmide (= épisome) est un fragment

d’ADN extra-chromosomique circulaire présent dans les bactéries. Il est susceptible de se répliquer de
façon autonome et peut porter des gènes de résistances aux antibiotiques par exemple. Il est
également transférable d’une bactérie à l’autre par réaction de conjugaison. Les plasmides sont utilisés
comme vecteurs en génie génétique, car ils sont manipulables facilement, ils ont la capacité de se
répliquer et peuvent supporter une quantité d’ADN relativement importante. L’utilisation des
plasmides en tant que vecteurs implique une manipulation précise des plasmides pour pouvoir leur
intégrer une information génétique. Ceci est possible grâce aux découvertes sur les enzymes de
restriction (Arber, Nathans, Smith). Les enzymes de restriction sont de petites protéines qui peuvent
couper l’ADN sur des séquences (appelés sites) bien spécifiques. Nous pouvons ainsi en ouvrant un
plasmide à un endroit précis, incorporer les séquences génétiques de notre choix.
ÙÙ
Vecteur. – Séquence nucléotidique capable de s’auto-répliquer, utilisée pour la recombinaison
in vitro de l’ADN et son amplification extra-chromosomique (clonage) (exemples : plasmides,
bactériophages, rétrovirus).
**Épisome : Séquence d’ADN pouvant soit exister sous une forme extra-chromosomique
autonome, soit être insérée dans l’ADN chromosomique. Par extension désigne les formes d’ADN
autoréplicatives et extra-chromosomiques.
2. Majorité de l’ADN chromosomique sans information codante apparente

Un gène est constitué de différentes parties. Les gènes servent de base pour la synthèse de
protéines. Nous passons par une étape intermédiaire qui est l’ARN. Le passage de l’ADN à l’ARN se
nomme transcription. Puis, le passage de l’ARN à la protéine se nomme traduction. Un gène est
principalement constitué d’ADN sans information codante apparente, puisqu’une fois transcrit en ARN
(transcrit primaire), ces séquences sont éliminées.
ÙÙ
Introns. – Séquence d’ARN, faisant partie du transcrit primaire qui est éliminée par épissage au
cours de la maturation de l’ARN. Au cours de ce processus l’extrémité 3’ de l’exon situé en amont
est raboutée à l’extrémité 5’ de l’exon situé en aval (synonyme « intervening sequence »).
ÙÙ
Exons. – Séquence d’ARN qui persiste après excision des introns lors de la maturation du transcrit
primaire.
Transcrit. – ARN produit par la transcription d’un gène (d’ADN), sans préjuger de son degré de
ÙÙ
maturation.
Épissage. – Se dit du mécanisme d’excision des introns et de raboutage des exons au cours de la
ÙÙ
maturation des transcrits (le transcrit dit primaire n’a donc pas subi d’épissage).
3. Chaque gène est une unité fonctionnelle complexe pour la production

régulée d’une molécule d’ARN
Un gène peut se définir comme l’ensemble des séquences d’acides nucléiques qui contiennent
l’information pour la production régulée (des séquences régulatrices engendrent des expressions
différentes des gènes dans les différentes cellules de l’organisme) d’un ARN particulier (transcription).
35 Année 2017 - 2018

Ainsi, les régions régulatrices font partie du gène. Chaque région de la double hélice d’ADN qui produit
une molécule d’ARN fonctionnelle forme un gène.
En 1999, la détermination de la séquence du génome de l’être humain a permis de comprendre

comment les gènes étaient arrangés dans les chromosomes. En 2001 a été publié le premier brouillon
du génome entier et en 2004 la séquence de l’ADN de tous les chromosomes est devenue disponible.
Ce projet est le fameux Human Genome Project.
C. Protéines de structure associées à l’ADN

1. Protéines structurales et non structurales associées à l’ADN
Les histones sont les principales protéines de structure des chromosomes. Elles sont
extrêmement abondantes et représentent environ 60 millions de molécules de chaque type par cellule
pour embobiner l’ADN. Elles ne sont présentes que chez les cellules eucaryotes.
Il en existe deux groupes :

§ histone des nucléosomes (structure de base de la chromatine) : H2A, H2B, H3 et H4 ;
§ histone H1 : il n’est pas dans le nucléosome.
ÙÙ
Nucléosome. – Structure de base de la chromatine constituée d’un octamère d’histone et
d’environ 140 pb d’ADN enroulé deux fois autour de l’octamère (8 histones + 140 pb d’ADN =
Nucléosome). Diamètre du nucléosome : 11nm.
2. Enroulement de l’ADN en une bobine serrée

Pour mettre en évidence la composition des nucléosomes, nous pouvons réaliser :
§ une digestion de l’ADN à l’aide de nucléases ;
Æ nous isolons ainsi les parties de l’ADN non liées au nucléosome.
§ une dissociation (par solution saline à forte concentration) des liaisons ioniques qui
attachent l’ADN du nucléosome ;
Æ nous dissocions donc les restes d’ADN entourant le nucléosome.
§ une dissociation (par un détergent) des interactions hydrophobes entre les histones.
Æ nous individualisons donc les différentes composantes du nucléosome.
3. Histones : principales protéines de structure des chromosomes

Afin que les nucléosomes permettent l’enroulement de l’ADN autour d’eux, les nucléosomes
adoptent une structure particulière. Cette structure est réalisée à l’aide des 8 histones repliées selon
une organisation particulière. Les différentes histones sont des protéines assez proches les unes des
autres. En effet la séquence d’acides aminés qui les composent est assez semblable.
Par conséquent, les acides aminés se replient tous de la même façon et peuvent donc être en
relation les uns avec les autres. On note qu’au sein du nucléosome les parties N-terminales de certaines
histones sont en lien avec le milieu extérieur. Ces parties N-terminales, spécifiques, sont donc
accessibles aux protéines du milieu et sont le siège de modifications.

4. Assemblage de l’octamère d’histones

La structure du nucléosome a été élucidée en 1997. Les 147 pb d’ADN enroulées autour de
l’octamère d’histones lui permettent de tourner environ deux fois autour des histones. Environ 142
liaisons hydrogène sont formées entre l’ADN et l’octamère d’histones dont près de la moitié entre le
squelette des phosphates de l’ADN et le squelette des histones.
Ce sont de nombreuses interactions hydrophobes et des liaisons ioniques qui participent à

l’assemblage du nucléosome, les charges positives des chaînes latérales des lysines et arginines des
histones neutralisant les charges négatives des phosphates du squelette de l’ADN.
En moyenne, nous remarquons des nucléosomes toutes les 200 pb séparés d’un segment d’ADN
entre eux de 0 à 80 pb. Un gène eucaryote de 10 000 pb est associé à 50 nucléosomes. Chaque cellule
de l’être humain contient 6 milliards de pb et 30 millions de nucléosomes.
5. Complexe de remodelage de la chromatine dépendant de l’ATP

La complexité de la structure d’un nucléosome est telle qu’une face particulière des histones n’est
pas accessible. Cette partie, c’est la partie des histones enroulée au cœur de l’ADN.
Comme nous l’avons vu, la chromatine est une structure dynamique. Elle doit pouvoir se
compacter (hétérochromatine) et se décompacter (euchromatine) rapidement. Il existe une
machinerie de protéines capables de déplacer les nucléosomes afin de déplacer l’enroulement de
l’ADN autour de ces nucléosomes et donc de rendre accessibles certaines portions géniques. Dans ce
système certaines sous-unités sont dépendantes de l’ATP (utilisent de l’énergie). Certaines enzymes
fonctionnent un peu comme des hélicases en se fixant devant le nucléosome et en le poussant pour
dérouler l’ADN.
6. Compactage des nucléosomes dans la fibre de chromatine
Image de chromatine condensée et décondensée.
Sur le schéma, nous visualisons une structure appelée « fibre de 30 nm » en A ; pour arriver, après
ajout d’une solution faiblement saline, à une structure décondensée expérimentalement de la
chromatine laissant apparaître les nucléosomes, en B. Pour décrire la condensation de la chromatine,
actuellement, nous hésitons entre deux modèles, le zigzag et le solénoïde.
37 Année 2017 - 2018

7. Participation des histones H1 à l’empilement des nucléosomes

L’histone H1 est une histone un peu spécifique puisqu’elle a la capacité d’interagir avec les
nucléosomes pour compacter la chromatine. Elle participe à l’empilement des nucléosomes en
orientant l’ADN.
8. Modifications covalentes réversibles de la queue des histones

Toutes les histones qui constituent le nucléosome ont une extension N-terminale accessible du
milieu extérieur. Sur cette protrusion viennent se fixer des enzymes qui ajoutent différents
groupements (phosphate, acétyle [CH3-CH2], méthyle, ubiquitine...). La localisation des modifications
diffère selon les histones.
Ces modifications sont gérées par deux familles d’enzymes :
§ les histones acétyltransferases (HAT) : ajout d’un groupement acétyle sur une lysine ;
§ les histones désacétylases (HDAC) : enlèvement d'un groupement acétyle (l’acide

valproïque, utilisé dans les maladies neurologiques, est une HDAC).
Ces modifications de la queue des histones vont avoir des conséquences bien spécifiques
(expliquées plus loin).
D. Diversité de structure et de fonctions de la chromatine

1. Existence de variants d’histones
Nous avons vu que les histones étaient au nombre de 5. Cependant, il existe des gènes qui codent
des histones possédant une fonction particulière que nous nommons « variants d’histones ». Certains
sont des variants de l’histone H3 (H3.3 par exemple). Ces histones sont incrustées dans un endroit
particulier du génome, la présence d’histones H3.3 favorise l’activation de la transcription. CENP-A,
quant à lui remplace H3 au niveau des centromères : il créé une surface d’interaction particulière,
nommée kinétochore.
ÙÙ
Kinétochore. – Structure complexe formée de protéines sur un chromosome en mitose, à
laquelle les microtubules sont attachés et qui joue un rôle actif dans les mouvements des
chromosomes en direction des pôles du fuseau. Le kinétochore se forme sur la partie du
chromosome appelée centromère.
D’autres sont des variants de H2A (H2AX par exemple) que nous détectons lors d’une réparation
de l’ADN ou une recombinaison. Un autre exemple est H2AZ qui joue un rôle dans l’expression génique
(comme H3.3) et dans la ségrégation des chromosomes.
Les nucléosomes ne sont pas seulement l’assemblage de huit protéines.

Conclusion
Ils présentent également des modifications covalentes

au niveau N-terminal ce qui modifie leur fonction.
Il existe également des variants d’histones qui peuvent remplacer les histones
dans la chromatine et conférer des propriétés particulières.

2. « Code des histones »

C’est le fruit de l’action concertée des modifications covalentes réversibles des histones et de la
présence de variants d’histones, pour aboutir à un code histone. Il contribue à déterminer la fonction
biologique de la chromatine. Exemple du code : méthylation de la lysine 9 " signal que la partie du
génome va former de l’hétérochromatine. D’autres exemples sont disponibles sur les diapositives du
professeur.
Hétérochromatine Euchromatine
Chromatine fortement condensée. Chromatine décondensée.
E. Organisation globale des chromosomes

Si le chromosome se présentait au final sous la forme d’une fibre de 30 nm, le chromosome
mesurerait 1 mm de longueur. C’est beaucoup trop gros ! Il faut donc un système de repliement
supplémentaire pour que ces chromosomes prennent moins de place dans le noyau.
1. Repliement des chromosomes en série de domaines en boucle

Prenons le cas des ovocytes amphibiens. Lorsque nous observons des ovocytes à un état
particulier de leur développement, nous remarquons - grâce à un réactif fluorescent - des boucles en
MO. Une boucle mesure autour de 10 µm et est présente à une fréquence d’environ 10 000 boucles
par chromosome. À la base de la boucle est présente une région dont l’ADN est très fortement
condensée, ce sont les chromomères.
Chromomère (terme utilisé en cytogénétique). – Région d’un chromosome où la chromatine est

très fortement condensée.
Schéma illustrant la formation de domaines boucles.
Visualisation du même principe chez l’Homme grâce à l’expérience de Capture de Conformation de

Chromosome = 3C. Nous procédons de la façon suivante : si l’ADN génomique forme une boucle, c’est
qu’il y a des régions de l’ADN topologiquement proches. Pourtant, si nous suivons la séquence la
séquence d’ADN de base, ces régions sont éloignées (c’est le principe d’une boucle).
Nous ajoutons alors du formaldéhyde sur une cellule (pour figer la cellule). Ceci forme des ponts
covalents qui bloquent la boucle. Ensuite, nous utilisons des enzymes (endo- et exonucléases) qui
digèrent la préparation (les enzymes coupent l’ADN en morceau). Enfin, nous utilisons une ligase qui
donne une boucle plus petite. Nous pouvons alors introduire des amorces de chaque côté de la boucle,
nous chauffons pour supprimer l’effet du formaldéhyde et nous faisons une PCR. Nous obtenons un
produit d’amplification seulement si les deux séquences d’ADN sont suffisamment proches. Il y a donc
des protéines impliquées dans la formation de ces boucles dont nous venons de démontrer l’existence
expérimentalement.
39 Année 2017 - 2018

Au cours de l’interphase, la chromatine est organisée sous forme de fibres de 30 nm avec des
domaines en boucles. L’action d’enzymes de modifications des histones, du complexe de remodelage
de la chromatine et la présence de l’ARN polymérase vont aboutir à une expression génique des gènes
situés dans la boucle.
2. Protéines impliquées dans la condensation des chromosomes

Dans une cellule en mitose, le chromosome est plié 10 000 fois plus que si l’ADN était déplié. Les
boucles d’ADN sont accrochées à une armature protéique : les condensines.
Les dimères de SMC forment une pince qui va permettre une compaction supérieure du
chromosome. Ce système est ATP-dépendant. Les dimères de SMC (Smc4 et Smc2) sont une structure
de base du complexe des condensines.
Condensine (complexe de condensines). – Complexe de protéines impliquées dans la

condensation des chromosomes préalablement à la mitose.
Cette pince de SMC est capable d’attraper plusieurs boucles d’ADN et les obliger à rester proches.
La structure finale est donc une organisation en cercles à partir des boucles qui étaient linéaires. Les
cercles regroupés les uns avec les autres forment une macrostructure qui constitue l’armature de la
chromatine. D’autres protéines associées à la condensine permettent de réguler sa capacité à
condenser l’ADN.
Schéma du complexe des condensines constitué de 5 sous unités (seuls les SCM ont été détaillées).
Schéma du complexe de condensine constituant l'armature de la chromatine.

Tout ceci est visualisable grâce à des anticorps « anti-condensine » couplés à de l’immuno-
fluorescence. Grâce à cette méthode, nous pouvons visualiser la localisation des condensines qui est
donc bien au centre de la chromatine.
Remarque. – Nous pouvons également visualiser les protéines de condensines en ME grâce à des
particules d’or.
Il existe un système analogue, celui des cohésines. Mais les complexes de cohésines n’ont pas la
même fonction, ils vont avoir un rôle dans l’association des chromatides sœurs condensées. Ce
complexe est aussi constitué de protéines SMC qui forment également une pince englobant les
chromatides jusqu’à ce que les kinétochores tirent le centromère vers les deux pôles de la cellule. Le
complexe des cohésines est formé de 4 sous-unités, un dimère de SMC (structural maintenance of
chromosomes) et un dimère de SCC (sister chromatin cohesion).
F. Réplication des chromosomes

1. Introduction
L’ADN des procaryotes se réplique à la vitesse de 500 nucléotides par seconde. La réplication est
terminée en 40 minutes avec une seule origine de réplication. L’ADN des eucaryotes se réplique à la
vitesse de 50 nucléotides par seconde. Ainsi, pour répliquer la totalité d’un chromosome de 150
millions de pb il faudrait plus de 800 heures, avec une seule origine de réplication. Il faut aller plus vite.
Deux possibilités existent :
§ augmentation de la vitesse de réplication (augmentation de la fréquence d’erreurs),
§ copie de plusieurs régions différentes simultanément : effective dans nos cellules !
2. Activation des origines de réplications par groupes

L’ADN est donc constitué de beaucoup de régions dites « origines de réplication ».
Comment avons-nous observé ces « origines de réplication » ?

§ marquage à la thymidine tritiée (car c’est le seul nucléotide spécifique de l’ADN ; U dans
l’ARN) durant 10 minutes. La réplication se réalise.
§ lavage et ajout dans le milieu, abondamment, de thymidine classique : réduction du
taux d’incorporation de thymidine tritiée.
§ étalement sur une lame de verre du résultat et exposition aux électrons : nous avons des
marques noires qui indiquent la position de thymidine tritiée.
Nous avons ainsi, sous les yeux, des zones complètement non marquées correspondant à l’origine
de réplication et donc à l’amorce d’ARN (dépourvue de thymidine, car c’est l’uracile qui la remplace),
bordées de zones bien noires qui démontrent le travail de l’ADN pol.et l’ajout de thymidine tritiée.
Puis, comme nous avons rajouté abondamment de la thymidine classique, nous avons ensuite des
zones avec quelques points noirs correspondant à quelques thymidines tritiées, témoignant de
l’élongation du néo-brin par l’ADN pol. Les zones blanches et totalement non marquées mises en valeur
sont donc bien les lieux d’origine de la réplication.
Grâce à cette expérience, nous savons également quel est le sens de progression des fourches de
réplication (en effet trois couleurs : blanche pour l’origine, noire pour le début de l’activité de l’ADN
pol. puis quelques points noirs pour la suite de l’élongation du néo-brin).
41 Année 2017 - 2018

Ce qu’il faut retenir et comprendre c’est que les origines de réplication sont multiples.
3. Origine de réplication constituée de séquences d’ADN spécifiques

L’ADN présent sur les lieux d’une origine de réplication est spécifique à cette fonction. Chez la
levure, l’origine de réplication se manifeste par un site de liaison de ORC, une région d’ouverture facile
de la double hélice (riche en A = T, seulement deux liaisons hydrogène à comparer de G ≡ C qui en a
trois) et un site de liaison pour une autre protéine nommée Abf1 qui facilite la liaison avec ORC.
Il existe différentes stratégies mises en œuvre pour identifier les origines de réplication de la
levure. Nous retenons surtout qu’une ORI de l’être humain est constituée de plusieurs milliers de
nucléotides. De plus, c’est la structure de la chromatine plus que la séquence d’ADN qui définit une
ORI.
Thalassémie. – Maladie génétique, répandue surtout dans le bassin méditerranéen et caractérisée

par la synthèse défectueuse d’une ou de plusieurs chaînes polypeptidiques de l’hémoglobine.

Noyau et nucléole ̶ Relations nucléo-cytoplasmiques

I. De la structure de la chromatine à l’expression des gènes
A. Introduction – Comment passer du génotype au phénotype ?

Comme nous l’avons déjà énoncé dans ces cours, l’expression d’un gène se manifeste par la
synthèse d’une protéine. Cette expression se déroule en deux grandes étapes successives, d’abord la
transcription qui permet la production d’ARN dans le noyau, puis la traduction permet la production
de protéines à partir d’ARN dans le cytoplasme.
Schéma des grands principes menant du gène à la protéine.
Il y a un raisonnement intuitif qu’il faut éliminer de suite, celui concernant la proportionnalité

entre la quantité d’ARN et celle de protéines finalement traduites. Il n’y aura pas autant de protéines
qu’il y aura d’ARN transcrit. Il n’y a pas de relation entre le nombre d’ARN et le nombre de protéines
au final.
Ceci est tout simplement dû aux divers systèmes de régulation qui vont pouvoir modifier
l’expression génique, depuis le début de la transcription jusqu’à la fin de la synthèse protéique. Nous
parlons donc de variabilité dans l’efficacité de l’expression génique.
B. Mécanismes généraux de la transcription

1. Appariement des bases : support de la transcription
Nous avons déjà étudié les différences entre ADN et ARN. Les éléments qui suivent doivent donc
être, à ce titre, des rappels. Un brin d’ARN est monocaténaire, il ne s’associe pas avec un second pour
former une hélice comme l’ADN. L’ARN possède les mêmes bases à l’exception de la thymine
remplacée par l’uracile. Le sucre composant le squelette de l’acide nucléique est sous sa forme ribose
classique, non pas sous sa forme désoxy.
43 Année 2017 - 2018

Les nucléotides dans un ARN respectent les mêmes principes de liaison entre eux, à savoir liaison
phosphodiester 3’-5’.
Structure schématisée de l'ADN.
Lors de création d’un hybride ARN/ADN, la loi d’antiparallélisme des brins est respectée. La loi de
complémentarité des bases est la même que celle appliquée avec l’ADN et elles s’apparient de la même
manière que dans l’hélice d’ADN. Ainsi, un A issu du brin d’ADN s’apparie avec un U issu du brin d’ARN,
en formant deux liaisons hydrogène (identique à la liaison A = T).
2. Élongation de la chaîne d’ARN catalysée par une ARN polymérase

L’enzyme clé de la transcription n’est autre que l’ARN polymérase. Nous l’avons déjà vu,
concernant la réplication de l’ADN, elle permet la création de l’amorce et se nomme alors primase. Elle
transcrit évidemment comme toutes les polymérases dans le sens 5’"3’. Le premier nucléotide
polymérisé par l’enzyme est donc situé à l’extrémité 5’ du brin d’ARN néoformé. Elle se déplace donc
dans le sens 3’"5’ sur le brin d’ADN matrice.
ARN transcrit (en bas en bleu) à partir d'un brin matrice d'ADN.
Il ne faut pas avoir la notion fausse que dans une molécule d’ADN, il y a un seul brin qui est
toujours transcrit et l’autre jamais. Chaque brin peut être transcrit selon les conditions. La
caractéristique transcrit (ou non) du brin dépend du gène à transcrire.
Concernant la transcription, l’ARN pol. n’a pas besoin d’une hélicase et peut - toute seule - ouvrir
la double hélice d’ADN. L’enzyme va ensuite se fixer sur un des deux brins (différents selon le gène) et
commencer la transcription. Au cours de cette dernière, un tunnel d’accès permet aux nucléotides
triphosphates (NTP et non dNTP) de rejoindre le site actif. Puis un tunnel de sortie permet le passage
de l’ARN nouvellement synthétisé. C’est donc au niveau du site actif qu’un hybride ARN/ADN est
présent (assez court : 9 nucléotides environ).

3. Brin à transcrire défini par le sens de progression de la polymérase

Comme la transcription ne s’intéresse qu’à un des deux brins, le sens de progression de l’ARN pol.
nous indique directement quel brin est transcrit. D’où l’importance de l’orientation de cette dernière.
4. Brin transcrit et brin matrice

Nous abordons ici une notion fondamentale dans la transcription, celle de brin transcrit et de brin
matrice :
Brin matrice (aussi appelé brin non codant). – Brin sur lequel l’ARN pol. hybride les nucléotides
d’ARN. C’est celui qui sert de support à la transcription.
Brin transcrit (aussi appelé brin codant). – Brin qui n’a pas joué de rôle dans la transcription, mais
qui a la même séquence nucléotidique que l’ARN nouvellement transcrit.
Quand nous donnons une séquence d’ADN, nous donnons toujours la séquence codante c’est-à-
dire la séquence qui présente les mêmes nucléotides que l’ARN. De plus, nous l'écrivons toujours dans
le sens5’"3’.
Schéma de la différentiation brin codant / brin non codant.
5. Séquence à transcrire définie par des séquences particulières

§ Origine de la transcription
Quand nous copions de l’ADN (réplication), nous allons avoir une ORI (origine de réplication) sur
laquelle va se fixer un ensemble de protéines qui vont permettre l’arrimage de l’ARN polymérase, qui
va créer l’amorce.
D’une manière analogue, quand nous transcrivons l’ADN en ARN, le démarrage de la transcription
est déterminé par une séquence dite « promotrice ».
ÙÙ
Promoteur. – Région d’ADN en amont des séquences transcrites qui comporte le site de fixation
de l’ARN polymérase ainsi que les sites de fixation de protéines régulatrices de la transcription. Le
promoteur comporte toutes les informations nécessaires à la transcription.
Le principe de base du début de la transcription nous est dévoilé par le monde procaryote. En
effet ; chez la bactérie, il n’y a qu’une seule ARN pol. qui permet la transcription et un seul facteur
protéique qui dicte à la polymérase la conduite à tenir (lieu de transcription, positionnement). Ce
facteur se fixe en premier sur l’ADN et ensuite, l’ARN pol. se fixe sur ce facteur et commence la
transcription.
45 Année 2017 - 2018

§ Terminaison de la transcription
Non clairement définie, nous ne savons toujours pas bien comment la polymérase sait lorsqu’il
faut arrêter la transcription. L’unité de transcription c’est le segment d’ADN transcrit.
Vue de microscopie électronique d'ARN en cours de transcription.
C. Trois sortes de transcription chez les eucaryotes

1. 3 groupes de gènes : I, II et III transcrits par trois sortes de polymérase
Un gène code pour un ARN et non pour UNE protéine.
En effet, un gène une fois transcrit, n’aboutit pas forcément à une protéine !
Il existe trois groupes d’ARN polymérases qui ont des caractéristiques différentes. Chaque
polymérase est spécifique d’un type particulier de transcrits.
ARN polymérase ARN transcrit

ARN polymérase I ARN ribosomiques (sauf le 5S).
ARN messager,
microARN,
ARN polymérase II
small interfering RNA,
small nucleolar RNA.
ARN de transfert,
ARN ribosomique 5S,
ARN polymérase III
small nuclear RNA,
Autres petits ARN.
2. Nécessité de facteurs généraux de la transcription

Ces trois ARN pol. ont besoin de facteurs généraux de transcription qui sont des protéines
indispensables à la transcription. Chez les eucaryotes, il y a plusieurs facteurs généraux de
transcription contrairement aux procaryotes qui n’en n’ont besoin que d’un seul.
Ces facteurs généraux de transcriptions sont les TF (Transcription Factor) qui présentent une
nomenclature en fonction de l’ARN polymérase qu’ils recrutent :
§ TF I = TF de l'ARN polymérase I ;
§ TF II = TF de l'ARN polymérase II ;
§ TF III = TF de l'ARN polymérase III.

Remarque et exemple. – Ces facteurs de transcription présentent souvent plusieurs sous-unités,

exemple : TFIID est constitué d'une TATA Box Binding Protein (37 kDa) se fixant sur la boîte TATA
et de 11 TBP Associated Factors.
D. Synthèse et maturation des ARNm par l’ARN polymérase II

1. Anatomie du gène d’une protéine
§ Promoteur
En amont, nous retrouvons toutes les régions régulatrices qui ne produisent pas directement les
ARN. Elles activent la transcription en étant les cibles des facteurs de transcription. C’est la présence
de ces régions régulatrices qui fait que les gènes ne sont pas exprimés de partout dans l’organisme,
mais sont activés spécifiquement dans certains tissus.
À ce propos, nous nommons gènes domestiques ou « house keeping genes », l’ensemble des
gènes nécessaires à la maintenance de l’activité cellulaire de base. Ils sont donc exprimés dans la quasi-
totalité des cellules de l’organisme.
Au sein du promoteur, nous retrouvons le site de fixation de l’ARN polymérase et de certaines

protéines régulatrices de la transcription. Ce lieu est souvent la boîte TATA.
ÙÙ
« TATA » (« TATA Box » ou « Hogness Glodberg Box ») ou boîte TATA. – Séquence de 5 à 7
bases, riche en AT, retrouvée à environ 25 pb en amont du site de début de la transcription de la
plupart des gènes de classe II. Fixe TBP (TATA Binding Factor). Est impliquée dans le calage de l’ARN
polymérase sur le promoteur.
Remarque. – La technique de l’empreinte permet de connaître le lieu d’interaction entre une

protéine et l’ADN. Pour cela, on dispose d’une grande quantité d’ADN dont on a marqué une des
deux extrémités. On sait que cet ADN est le lieu de fixation d’une protéine mais on ne sait pas où.
On place la grande quantité d’ADN et la protéine en question, en solution dans un tube. On suppose
donc qu’au bout d’un certain temps cette protéine se sera fixée. Puis, on applique une DNase I (ou
DMS) qui va avoir effet de couper l’ADN en des fragments aléatoirement. Leurs tailles seront donc
diverses. Après un certain temps d’action de la DNase I, on fait migrer tous nos fragments sur gel.
Ceci va nous permettre de les classer par taille. On observera un trou dans notre classement par
ordre de taille, ce trou est nommé empreinte. Il correspond au lieu de fixation de la protéine, car
celle-ci de par sa présence à empêcher l’ADN de se faire couper à cette endroit. Nous connaissons
donc le lieu de fixation de la protéine.
§ Partie transcrite
Le site « +1 » de la transcription est le point de départ de la transcription, c’est donc sur ce
nucléotide précisément que commencera la transcription.
Il est différent du « +1 » de la traduction (= ATG). Le +1 de la traduction représente

les trois premiers nucléotides traduits en acides aminés. D’une façon analogue le
site de terminaison de l’ARN n’est pas le site de terminaison de la traduction (=
stop).
47 Année 2017 - 2018

Un exon n’est pas forcément codant. Ce qui va coder pour une protéine, c’est la partie conservée
de l’ARN après maturation. Il y a souvent des exons dans les séquences 3’ et 5’ de l’ARN qui vont en
fait ne pas être traduites en acides aminés. Ces exons non codants sont nommés exon 3’UTR et exon
5’UTR.
C’est sur le +1 de la transcription que sera ajoutée une coiffe à l’ARN. Et c’est sur le site de
polyadénylation, en fin d’ARN où nous allons observer la fixation d’une queue de poly-adénines. Cette
queue joue un rôle important dans la préservation de l’ARN. Sans cette queue, l’ARN est dégradé. Cette
polyadénylation est codée par une séquence située dans l’ARN, 10 à 20 nucléotides en amont du site
de la queue à proprement dite. Cette séquence spécifique est riche en T et A.
Schéma général d'un gène codant pour une protéine.
2. Amorçage de la transcription
Pour démarrer une transcription il faut :
§ une boîte TATA qui peut être substituée par d'autres régions de l’ADN comme les îlots
CG, non méthylées quand elles sont dans les régions promotrices qui recrutent TBP ;
§ des gènes de ménages nécessaires à des fonctions communes à toutes les cellules ;
§ des facteurs protéiques additionnels ;
§ une association de facteurs généraux de transcription.
Nom Nombre de sous-unités Rôles dans l'amorçage de la transcription

TBP 1 Reconnaît la boîte TATA.
TFIID
TAF 11 Reconnaît d'autres séquences d'ADN près du +1.

TFIIB 1 Positionne la polymérase II.
Stabilise l'interaction de la polymérase II avec TBP et TFIIB,
TFIIF 3
Aide au recrutement de TFIIE et TFIIH.
TFIIE 2 Recrute et régule l'activité de TFIIH.
Ouvre l'ADN au +1 de la transcription (hélicase), phosphoryle
TFIIH 9
la sérine 5 du CTD (kinase) et détache la pol. II du promoteur.
§ La séquence CTD
C’est une séquence localisée en C-terminal de la polymérase qui présente un motif répété 52 fois.
Cette séquence est indispensable au bon fonctionnement de l’ARN pol. II et à la maturation de l’ARN.
En effet, le TFIIH (le dernier facteur de transcription) au contact de CTD, phosphoryle le domaine C-
terminal (riche en sérines et thréonines) pour fixer la coiffe de l’ARN et désassembler le complexe
d’initiation de la transcription. Dès que nous avons un arrêt de phosphorylation de cette séquence
CTD, l’ARN pol. n’avance plus.

Protéines d’activation, de répression, de médiation et de modification de la chromatine = ces

protéines agissent sur la capacité des facteurs généraux à se fixer ou non. Elles se fixent au niveau des
régions régulatrices en amont de la boîte TATA. C’est grâce à ces protéines que nous arrivons à une
transcription si spécifique, autant grâce aux activateurs qu’aux répresseurs. Ce système permet de
favoriser (ou d’inhiber) la transcription du gène choisi, à certains moments du cycle cellulaire, dans
certains tissus, à certains moments de la journée. Le système devient hyper-modulable et la
transcription peut donc être contrôlée de façon millimétrée.
Bilan : nous avons des énormes complexes multi-protéiques au niveau de l’ARN polymérase
nécessaires pour que la transcription ait lieu. L’ARN pol. II ne peut pas se fixer seule sur l’ADN, elle doit
être recrutée par des facteurs généraux de transcription dont le principal est le TBP qui recrute
d’autres facteurs jusqu’au dernier facteur (TFIIH) qui amène une activité hélicase et kinase. Les
schémas ci-dessous vont vous aider à mieux appréhender ce phénomène complexe.
49 Année 2017 - 2018

Amorçage de la transcription d'un gène eucaryote par l'ARN pol II.
3. Élongation et la terminaison de la transcription

Dès que la transcription démarre, la plupart des facteurs de transcription s’en vont, mais l’ARN
polymérase II garde son domaine C-terminal toujours phosphorylé.
Remarque. – L’élongation et la terminaison de la transcription ne sont pas détaillées dans ce cours,

mais ne vous en faites pas : l’UE1 se chargera de tout vous expliquer en détail. Sachez simplement
que c’est un phénomène très contrôlé et que rien n’est laissé au hasard.
4. Addition de la coiffe en 5’ du pré-ARNm

Chez les procaryotes, nous sommes en présence d’ARN dits polycistroniques. C’est-à-dire qu’avec
le même ARN, nous pouvons produire différentes protéines, selon le nombre de séquences traduites
dans un même ARN.
Chez les eucaryotes, les ARN matures ne peuvent produire qu’une seule protéine différente, ils
sont dits monocistroniques. Nous parlons bien ici de qualité et non de quantité ! Car rappelons qu’à
partir d’un nombre d’ARN nous ne pouvons pas conclure sur un nombre de protéines synthétisées.
Remarque. – La notion d’ARN poly- ou monocistronique est à différencier de celle d’épissage

alternatif que nous verrons plus loin.
Une fois que l’ARN est transcrit, il faut qu’il soit apte à sortir du noyau, cette étape s’appelle la
maturation de l’ARN. Nous passons donc d’un ARN fraîchement transcrit à un ARNm=ARN mature (m
pour messager) prêt à sortir du noyau.
Chez les eucaryotes, les ARNm monocistroniques sont caractérisés par la présence d’une queue
poly-A et d’une coiffe en 5’.
ÙÙ
Coiffe. – Motif de 7-méthylguanosine rattaché par une liaison 5’-5’ triphosphate à la première
base de tous les ARN messagers des eucaryotes. Ce nucléotide modifié va ainsi protéger l’ARNm
notamment de l’action des exonucléases à ARN qui risque de le dégrader.

ARN mature d'une cellule eucaryote comparé à celui d'une cellule procaryote.
La coiffe se fixe de manière dépendante à la polymérase. En effet, la phosphorylation de la sérine

5 de la polymérase II, va participer au recrutement des enzymes qui vont catalyser la production de
cette coiffe.
En même temps que la coiffe s’attache, la sérine 2 de la polymérase va être phosphorylée par une
protéine kinase. Celle-ci va recruter les enzymes qui vont jouer un rôle dans l’épissage de l’ARN.
La sérine 5 phosphorylée pour la mise en place de la coiffe va être dé-phosphorylée par une
phosphatase au cours de l’élongation ce qui va permettre le recrutement de facteurs de maturation
de l’extrémité 3’.
Le domaine C-terminal est très important pour l’ADN pol. II car il recrute les facteurs de la coiffe
(rôle déjà détaillé dans sa définition), les facteurs d’épissage et le facteur nécessaire à la
polyadénylation.
5. Addition d’une queue poly-A

Le signal de coupure du transcrit primaire AAUAAA est localisé APRÈS le codon STOP, à 10 ou 20
nucléotides de l’extrémité 3’ de l’ARN. Une fois coupé, le petit bout d’ARN en 3’ - maintenant seul - est
dégradé par des RNases car il n’a pas de coiffe.
Puis, une poly-adénine polymérase vient polymériser ce que nous appelons la queue poly-A. Elle
n’a pas besoin de matrice, ni d’amorce : elle se fixe sur l’ARN et produit 100 à 200 bases d’adénines
consécutives.
La queue poly-A sert à stabiliser l’ARNm et à faciliter son transport. De plus, elle joue un rôle dans
l’initiation de la traduction.
6. Epissage du transcrit primaire

Découverte en 1977 dans l’adénovirus puis de l’ovalbumine et de la globine.
Épissage. – Se dit du mécanisme d’excision des introns et de raboutage des exons au cours de la
ÙÙ
maturation des transcrits.
Avant, nous pensions que les introns étaient inutiles dans un point de vue de synthèse protéique.
Maintenant, nous savons que les introns possèdent des rôles en lien avec les promoteurs.
51 Année 2017 - 2018

Exemple. – Dans le gène du facteur VIII, nous nous rendons compte que sur 200 000 pb, les exons
sont très minoritaires.
Pour l’épissage, il est nécessaire d’avoir :
§ un site donneur (GU), au DÉBUT de L’INTRON = en 5’.

ÙÙ
Donneur (site). – Point de jonction entre la fin d’un exon (3’) et le début de l’intron consécutif
(5’ GU-). Parfois appelé site gauche.
§ un site accepteur (AG), à la FIN de L’INTRON = en 3’.

ÙÙ
Accepteur (site d'épissage). – Point de jonction entre la fin d’un intron (-AG 3’) et le début (5’)
de l’exon consécutif. Parfois appelé site droit.
§ un site branchement (A dans l’intron du coté 3’), séquence plus flexible mais présence
d’un A obligatoire du côté 3’ de l’intron pour la formation du lasso.
Séquence consensus nécessaire à l'excision des introns pré-ARNm.
ÙÙ
Breathnach et Chambon (règle de). – Présence des di-nucléotides GU et AG, respectivement au
début et à la fin de chaque intron.
Nous assistons ensuite à la formation d’une molécule en lasso par liaison G5’-2’A dans l’intron.
Par la suite, nous avons une réaction de transestérification 3’-5’ pour ligaturer / relier les deux exons.
Lasso par liaison G5' - 2' dans l'intron.

Enfin, un complexe d’épissage [protéines + snARN = snRNP (250 KDa)] intervient.

ÙÙ
snRNA (« small nuclear RNA ») ou snARN. – Petits ARN nucléaires (appelés U1, U2... U10),
impliqués, pour la plupart, dans le mécanisme de l'épissage. Ils sont associés à des protéines, le
tout constituant les snRNP ("small nuclear ribonucleoprotein").
ÙÙ
snRNP. – "small nuclear ribonucleoprotein" = "petite ribonucléoprotéine nucléaire" (250.000 Da).
ÙÙ
hnRNP. – "heterogeneous nuclear ribonucleoprotein particle" = "particule ribonucléoprotéique
nucléaire hétérogène" (ø 20 nm). Ils tapissent l’ARNm et vont être importants pour l’exportation
des ARNm vers le cytoplasme.
ÙÙ
Spliceosome. – Mot anglais pour définir le complexe d’épissage, complexe ribonucléoprotéique
formé au cours de l'épissage du transcrit primaire.
ÙÙ
Protéines Sm. – Protéines constituantes des snRNP.
7. Possibilités d’épissages différents

La cellule peut décider qu'un exon peut être utile ou pas. Chaque gène peut donc donner
différentes protéines par la présence d’un épissage alternatif. Nous estimons que 92 % des transcrits
primaires sont épissés de plusieurs façons.
ÙÙ
Épissages différents (« differential splicing »). – Traduit une différence d’épissage, c’est-à-dire
l’existence de plusieurs patrons d'épissage d'un transcrit primaire qui aboutissent à la formation
de différents ARN messagers, et peuvent donner lieu à la synthèse de plusieurs protéines
différentes.
Exemple Ù Tropomyosine. – Le gène de cette protéine montre, qu’en fonction du tissu, nous
n'allons pas avoir la même utilisation des exons du gène de la tropomyosine.
8. Territoires du noyau occupés par l’ARN poly A et la machinerie d’épissage

En utilisant du DAPI (colorant bleu qui se fixe sur l’ADN) et en ajoutant sur ces cellules un poly dT
en rouge (rhodamine), nous nous rendons compte que l’épissage ne se fait pas de façon homogène
dans le noyau. Les facteurs d’épissage et l’ARN poly A sont même co-localisés.
Au fur et à mesure que l’ARN est synthétisé, il adopte une structure ressemblant à un anneau,
nommé anneau de Balbiani. Cette forme lui permet de sortir par le pore nucléaire, reliant le noyau au
cytoplasme. Lors de son transport, il est accompagné par de nombreuses protéines comme :
§ le CBC sur la partie 5’ de l’ARNm au niveau de la coiffe,
§ la PABP au niveau de la queue poly-A assure protection et contrôle du transport,
§ la hnRNP pour le compactage,
§ la SR,
§ le EJC se fixant sur les jonctions entre deux exons.
Il faut un certain nombre de protéines fixées à l’ARNm pour l’envoyer au cytoplasme (CBS & PABP
notamment, ainsi que le récepteur de transport de l’ARNm hors du noyau). En revanche certaines
protéines notamment d’épissage ne doivent plus y être sinon l’ARN ne peut pas être transféré.
D’autres protéines prennent en charge l’ARNm à la sortie du pore.
53 Année 2017 - 2018

Sur la coiffe en 5’ de l’ARN, à la sortie du pore nucléaire, il y aura les premiers facteurs de
traduction qui vont se fixer et initier la traduction.
E. Synthèse et maturation des ARN de transferts et des ARN 5s et 7s

1. L’ARN polymérase III : son promoteur et facteurs associés
Elle est constituée de 15 sous-unités et transcrit principalement les gènes :
§ de l'ARN 5S de 120 nucléotides,
§ des ARNt de 75 à 80 nucléotides,
§ d'autres petits ARN dont l'ARN 7S.
Information. – L’unité « S » correspond à la vitesse de sédimentation mesurée en Svedberg.

Dalton. – Unité de masse égale au douzième de la masse d’un atome de carbone.
Comme toute polymérase, l’ARN polymérase III fonctionne grâce à des facteurs de transcription
(TFIIIA, TFIIIB, TFIIIC). Ces protéines de transcription sont des protéines en « doigt de zinc » qui sont
capables de se fixer sur l’ADN et de retrouver les nucléotides. Le TBP est nécessaire au démarrage des
trois types de transcription. L’ARN polymérase de type III possède une masse moléculaire de 650.000
daltons (650.000 Da = 650 kDa = poids moléculaire de 650.000).
Le promoteur de l’ARN polymérase III est situé à l’intérieur de la séquence transcrite.
2. Ni coiffe en 5’ ni queue poly-A pour les ARN synthétisés par ARN pol. III
C’est la principale différence avec les ARN synthétisés par l’ARN pol. II. Ainsi l’ARN pol. III n’a pas
de domaine CTD
3. Les ARN 5S et 7S ne sont pas matures, mais maturation des ARNt
Il rentre dans la composition de la grande sous-unité (60S) du ribosome. Les

ARN 5S sont associé à 45 protéines et à 2 autres ARNr synthétisés par l’ARN pol.
ARN 5S I : les ARN 28S et 5,8S. Les gènes de l’ARN 5S sont localisés en plusieurs
exemplaires dans le génome (environ 2000), alors que les gènes concernant les
ARNt sont répartis dans tout le génome.
Il rentre dans la composition de la protéine SRP associé à 6 protéines. Il

interagit avec une séquence peptidique de signalisation présente dans une
ARN 7S chaîne polypeptidique en cours de synthèse et dirige le polypeptide et son
ribosome associé vers le réticulum endoplasmique (RE), ce qui permet le passage
de la protéine en cours de synthèse à travers la membrane de ce RE.

F. Synthèse et maturation des ARNr par l’ARN polymérase I

1. Organisation en tandem des gènes des ARNr
Les gènes précurseurs de l’ARN 45S sont organisés en tandem. À chaque division, la cellule doit
construire 10 millions de ribosomes pour assurer la synthèse des protéines. Comme il y a 400 gènes
d’ARN 45S par génome diploïde, chaque unité de transcription est transcrite 25 000 fois pour fabriquer
10 millions de ribosomes.
2. Synthèse d’un précurseur de 45S par l’ARN pol I en 3 min

L’ARN polymérase I ne peut transcrire qu’un seul type d’ARNr, le 45S. Cet ARNr va être coupé en
trois petits morceaux qui vont constituer les ARNr 18S ; 5,8S et 28S. Les ARNr sont les seuls à subir des
modifications chimiques, à savoir des isomérisations et méthylations sur une partie de leurs riboses.
Synthèse et maturation du précurseur de 45s des ARNr 18S / 5,8S et 28S.
Les snoARN sont des petits ARN nucléolaires qui attirent les enzymes qui vont modifier l’ARNr
des deux manières citées ci-dessus, pour couper le 45S en 28S, 5,8S et 18S.
3. Fabrication des ribosomes dans le nucléole, grâce à des snRNP et d’autres

protéines
Le ribosome est un complexe formé d’ARN et de protéines. Il contient une petite sous-unité 40S.
Les ARNr 18S participent à sa formation. Et une grande sous-unité 60S. Les ARNr 5,8S et 28S participent
à sa formation avec le 5S transcrit par l’ARN polymérase III.
Les ribosomes sont fabriqués dans le nucléole grâce à des snRNP et d’autres protéines dans un
espace de temps de 10 à 30 minutes pour la petite sous-unité, de 30 à 60 minutes pour la grande sous-
unité.
Nucléole. – Zone du noyau sans limites franches, où nous pouvons observer une très forte activité
pour participer à la création des ribosomes. Le nucléole est ainsi formé d’hétérochromatine
associée le long de l’enveloppe nucléaire. C’est une structure dense aux électrons qui ne présente
pas de membrane. Le nucléole présente différentes régions, voir ci-après.
55 Année 2017 - 2018

Fonction du nucléole dans l'assemblage du ribosome et d'autres RNP.
Récapitulatif de la formation d'un ribosome

1 Transcription des précurseurs 45S
2 Maturation des ARNr
Les protéines du ribosome sont synthétisées dans le cytoplasme puis rejoignent les portions
3
18S ; 5,8S et 28S provenant de la coupure du 45S.
Formation d'un précurseur qui forme grossièrement les deux sous-unités de l'ARNr.
4
Obtention d'un « pré »-ribosome.
5 Le 5S, synthétisé dans le cytoplasme, est apporté dans le noyau.
6 Les deux sous-unités du ribosome sortent du noyau vers le cytoplasme séparément.
7 Assemblage des deux sous-unités pour la traduction.
Remarque. – La petite sous-unité (40S) et la grande sous-unité (60S) ont une vitesse de
sédimentation de 80S (et non pas de 60 + 40 = 100 !).
4. Organisation des nucléoles en sous-compartiments du noyau

Le nucléole présente plusieurs parties, une région en forme d’anneau, contenant le composant
fibrillaire (dense aux électrons). Une autre au centre qui correspond au centre fibrillaire où nous avons
la transcription des gènes par l’ARN polymérase I. Et enfin, une structure granulaire qui est le site
d’assemblage des ribosomes.

Schéma représentant l’organisation du noyau (non montré en cours mais pour faciliter la compréhension)
G. Conclusions
1. Territoires séparés occupés par les chromosomes individuels au cours de
l’interphase. Le noyau est individualisé en compartiments.
Mise en évidence par la méthode FISH : nous avons des amorces qui s’hybrident où nous voulons
dans le génome, et nous les rendons fluorescentes.
Les boucles de fibres de 30 nm peuvent se décompacter. Comme les boucles sont grandes, cette
décompaction peut impliquer un déplacement des gènes pour être transcrits plus efficacement. Les
chromosomes et les gènes ne sont pas fixés dans le noyau : ils peuvent se déplacer dans le celui-ci. La
plupart des gènes actifs sont situés à distance de l’enveloppe nucléaire.
Mise en évidence par hybridation in situ par fluorescence : nous devons obtenir normalement
deux marques fluorescentes (pour les 2 chr. homologues). Si nous activons le gène, nous voyons que
les deux points marqués se sont déplacés vers le centre du noyau. Si nous faisions un marquage de
l’ARN polymérase, nous verrions que les gènes se déplacent vers les localisations des ARN pol.
2. Structuration générale du noyau de la cellule en interphase

Il y a différents composants dans le noyau :
§ des corps de Cajal mis en évidence grâce au nitrate d’argent. Ils contiennent des
protéines associées aux snRNP. Pour assembler les deux sous-unités, nous avons action
de ribonucléoparticules impliquées dans l’épissage. Association des snoARN avec des
protéines pour former des complexes de maturation des ARNr. Les corps de Cajal sont
localisés près des nucléoles. Ils sont décrits pour la première fois en 1906 et servent de
lieu de dernière modification des snARN et snoARN et de recyclage après utilisation.
§ des granules inter-chromatiniens possédant une fonction d’épissage active. Ils seraient
des réserves de snRNP prêts à l’usage (20 à 50 par noyau de cellules de vertébrés).
§ des sites de transcription et d’épissage de l’ARN : ils sont au nombre de 2 à 3000 par
noyau dans les cellules des vertébrés. Ces sites de transcription sont visibles dans des
structures au ME : les fibres périphériques de la chromatine (périchromatinfibers).
57 Année 2017 - 2018

§ des GEMS (structures analogues aux corps de Cajal) contiennent la protéine SMN (pour
« Survival of Motor Neurons ») qui est le produit d’expression du gène SMN (localisé en
5q13), responsable de l’amyotrophie spinale ou SMA (« Spinal Muscular Atrophy »).
Lors de la formation du ribosome, nous avons vu qu’il nécessitait des protéines (Sn) qui rentrent
dans le noyau et qui vont s’assembler aux ARNr. Une bonne partie de ces protéines va aller dans les
corps de Cajal et dans les corps de GEMS pour finir leur maturation. Une fois la maturation terminée,
ces protéines vont dans les granules chromatiniens (dans le nucléole) et finissent l’assemblage du
spliceosome.
Vue schématique des sous-unités du noyau.
Pathologie Ù Spinal Muscular Atrophy (SMA). – Cette maladie héréditaire se caractérise par une
mort des neurones moteurs de la moelle épinière, entraînant une atrophie des muscles. Sa
prévalence est de 1 / 6000. La myopathie de Duchenne, la SMA et la mucoviscidose sont des
maladies rares qui sont relativement fréquentes.
II. Du gène à la protéine
L’ADN conserve l’information nécessaire à la synthèse des

protéines.
L’ARN transporte les instructions contenues dans l’ADN. Les protéines exercent la plupart des
activités biologiques. Leur synthèse est au cœur de l’activité de la cellule.
A. Principes du code génétique

1. Colinéarité des gènes et de la protéine
Quand nous lisons un gène, nous lisons la séquence dans laquelle les acides aminés seront
attachés dans la protéine. Les chaînes latérales vont interagir avec d’autres protéines pour que la
protéine puisse exercer son rôle métabolique.

2. Nécessité d’un ARNm

Trois sortes de molécules d’ARN participent à la synthèse des protéines, par des fonctions
différentes mais coopératives :
§ l’ARNm ou ARN messager transporte l’information génétique, transcrite de l’ADN, sous

forme de nucléotides enchaînés qui détermine une séquence d’aminoacides.
§ l’ARNt ou ARN de transfert permet de déchiffrer le code.
§ l’ARNr ou ARN ribosomique : possède des fonctions intrinsèques (interactions avec les
ARNm et formation de la liaison peptidique) et participe à la structure du ribosome au
sein duquel se déroule la synthèse protéique.
La traduction de l’ARNm se fait du 5’ vers le 3’. Le premier acide aminé incorporé utilise la partie
codante de l’ARN.
3. Quatre nucléotides pour 20 acides aminés

Il y a 64 combinaisons possibles, mais pas 64 acides aminés. Ainsi, plusieurs triplets de codon
peuvent coder pour un acide aminé. C’est ce qu’on appelle la dégénérescence du code et c’est une
notion fondamentale.
4. Concerne l’ensemble du monde vivant

Ce sont les mêmes codons qui sont utilisés chez 99,9% des espèces vivantes sur Terre.
B. Caractéristiques du code génétique
1. Dégénérescence du code génétique et codons synonymes

ÙÙ
Dégénérescence (du code génétique). – Définie par l'existence possible de plusieurs triplets qui
spécifient un même acide aminé (61 codons pour 20 acides aminés). La dégénérescence porte
principalement sur la 3ème base du codon.
ÙÙ
Codon. – Triplet nucléotidique de l'ARNm qui spécifie un acide aminé donné (codon signifiant)
ou un signal de fin de traduction (codon non-sens). Sur les 64 combinaisons possibles entre A, U,
C et G il y a 61 codons signifiant les 20 acides aminés précurseurs des protéines, ainsi que 3 codons
non-sens. Plusieurs codons peuvent spécifier un même acide aminé en raison de la dégénérescence
du code génétique
2. Nécessité d’un cadre de lecture ou d’une phase de lecture

ÙÙ
Cadre de lecture. – Une des trois phases possibles de lecture de l'enchaînement des triplets sur
un brin d'ADN. Lorsqu'il ne renferme pas de codon stop, il est dit ouvert ; dans le cas contraire il est
dit fermé.
ÙÙ
Phase. – Dans la séquence nucléotidique : cadre de lecture qui permet d'individualiser la
séquence des triplets. Pour une séquence donnée il y a trois phases possibles sur chaque brin.
59 Année 2017 - 2018

Trois cadres de lecture différents, aboutissant à des protéines différentes.
3. Nécessité d’une ponctuation

Le premier acide aminé est très souvent la méthionine, au démarrage c’est donc le codon AUG
que nous retrouvons. Pour terminer la traduction, il faut un des trois codons STOP : UAA, UAG UGA.
C. Traduction du message génétique

1. Introduction
Nous allons donc passer au cours de la traduction d’une succession de codons à un enchaînement
d’aminoacides.
2. Rôle de l’ARNt
Les ARNt interprètent le code, ils ont la forme d’un trèfle à quatre feuilles avec, à l’opposé du site
de fixation de l’acide aminé, un site nommé anticodon qui va reconnaître le bon lieu de fixation par
hybridation avec l’ARNm.
L'aminoacylation de l’ARNt correspond au chargement des ARNt. Les ARNt sont chargés en acide
aminé par aminoacylation. Cela se fait sur le 3’-OH du ribose et est contrôlé par une aminoacyl ARNt
synthétase. Chaque acide aminé à une synthétase spécifique. L’aminoacide est sélectionné par son
codon.
Sélection de l'aminoacide par un codon via deux adaptateurs qui agissent l'un près de l'autres.
La reconnaissance du codon par l’anticodon se fait grâce au ribosome.

3. Ribosomes et facteurs protéiques

Les ribosomes ne travaillent pas tous seuls, ils nécessitent des facteurs d’amorçage, d’élongation
et de terminaison de la traduction :
§ Facteur d’amorçage ou d’initiation : IF (eIF pour les eucaryotes).
§ Facteurs d’élongation : EF (eEF pour les eucaryotes).
§ Facteurs de terminaison : RF (eRF pour eucaryotes) : décrochage du ribosome.
4. Principe de la croissance de la chaîne polypeptidique

La petite sous-unité du ribosome se fixe directement sur l’ARNm. La grande sous-unité est fixée
au-dessus. Ce ribosome se déplace de nucléotide en nucléotide. À chaque nouveau codon, il y a un
nouvel acide aminé qui arrive par le biais d’ARNt. Les eIF ne servent qu’à démarrer une protéine à
partir d’un ARNm qui possède une coiffe et une queue poly-A.
Nous commençons toujours par une méthionine car elle est le seul AA qui possède un codon
reconnaissable par la petite sous-unité du ribosome, ce qui engendre sa fixation à l’ARNm. Dès lors,
cette petite sous-unité va reconnaitre la coiffe 7-méthylguanosine et les facteurs de traduction. C’est
à partir de ce moment-là que nous avons fixation de la grande SU au-dessus de la petite SU.
Nous ramenons un deuxième ARNt qui va se mettre sur le codon d’à côté. Le ribosome va se
décaler le long de l’ARN et va finir par synthétiser toute la protéine.
Sélection de l’aminoacide ajouté à l’extrémité de la chaîne naissante :
Sélection et incorporation d'un aminoacide dans une protéine.
Lorsque l’ARNt est accroché à l’extrémité C-terminale de l’ARNm et qu’il est contenu dans le site
P de la grande sous-unité, nous parlons de peptidyl-ARNt. Lorsqu’il est contenu dans le site A, nous
parlons d’aminoacyl-ARNt.
Terminaison de la traduction : quand l’aminoacyl-ARNt transférase ne peut plus se fixer au codon

STOP, c’est un eRF qui va se fixer sur ce codon. Celui-ci annonce la fin de la traduction et donc la
dissociation des deux sous-unités du ribosome.
61 Année 2017 - 2018

5. Traduction des ARNm et synthèse des protéines

Chez les procaryotes, tout se passe dans le cytoplasme. Il y a transcription et traduction couplées
car il ne possède pas le système intron-exon. Chez les eucaryotes, comme nous l’avons vu, la
transcription de l’ARN et sa maturation ont lieu dans le noyau. La traduction dans le cytoplasme.
Il existe tout sorte d’inhibiteur de la traduction, qui peuvent agir à différents niveaux présents
dans le tableau qui suit :
Activité sur les bactéries seulement

Tétracycline Bloque la liaison de l'aminoacyl-ARNt au site A du ribosome.
Streptomycine Empêche le passage de l'amorçage à l'élongation : mauvais décodage.
Chloramphénicol Bloque l'activité de la peptidyl-transférase du ribosome.
Erythromycine Bloque la translation du ribosome.
Rifampicine Se lie à l'ARN polymérase et bloque la synthèse d'ARN.
Activité sur les bactéries et les cellules eucaryotes

Entraîne l'avortement de la synthèse prot. par formation d'un peptidyl-
Puromycine
puromycine.
Actinomycine D Se lie à l'ADN et bloque le déplacement de l'ARN.
Activité sur les cellules eucaryotes seulement

Cycloheximide Bloque la transcription du ribosome.
Anisomycine Bloque l'activité peptidyl-transférase du ribosome.
α-amanitine Bloque la synthèse de l'ARNm en se liant de façon.
Dans la cellule les ribosomes peuvent travailler :

§ librement dans le cytoplasme,
§ associés aux membranes du réticulum endoplasmique.
Selon le type de travail, les protéines ne sont pas dirigées vers les mêmes zones pour vivre leurs
vies de protéines

Les méthodes de biologie cellulaire

Rédigé à partir des cours du Pr SCHAEFFER
I. Source du matériel biologique

A. Micro-organismes utilisés dans les laboratoires
Trois types de micro-organismes sont utilisés au laboratoire : les virus, les micro-organismes
procaryotes (bactéries) et eucaryotes (levures, protistes et mycètes).
1. Les virus
Les virus constituent des outils privilégiés pour l’analyse expérimentale de nombreux
phénomènes moléculaires et cellulaires : processus d’auto-assemblage, mécanismes fondamentaux
de la réplication et de l’expression du génome, etc. Certains d’entre eux sont également utilisés en
génie génétique comme vecteurs de clonage ou d’expression. Ils permettent de cibler certaines
cellules afin de leur transférer du matériel génétique.
2. Les procaryotes
Les bactéries sont utilisées en génie génétique mais sont aussi à la base d’études fondamentales.
La principale bactérie utilisée est Escherichia coli (E. coli). Cette bactérie vit normalement dans
l’intestin des Hommes et d’autres vertébrés, mais elle peut être facilement cultivée sur un milieu
nutritif simple. E. coli peut s’adapter aux diverses conditions chimiques de son environnement et elle
se reproduit rapidement (toutes les 20 minutes). Elle permet donc d’amplifier rapidement des
plasmides. Ses instructions génétiques sont contenues dans une unique molécule d’ADN circulaire qui
permet la synthèse d’environ 4000 protéines différentes. Nos connaissances des mécanismes
fondamentaux de la vie, comme la réplication de l’ADN ou le décodage des instructions génétiques
proviennent (pour la plupart) des études conduites sur E. coli.
3. Micro-organismes eucaryotes
Afin de comprendre les principes fondamentaux de la biologie cellulaire des eucaryotes, il est
souvent fait appel à un micro-organisme unicellulaire qui, comme E.coli parmi les bactéries, est simple,
robuste, se reproduit rapidement et présente un génome facilement manipulable. Pour toutes ces
raisons, la levure Saccharomyces cerevisiae constitue un organisme de choix. Les études génétiques et
biochimiques chez la levure ont permis de comprendre de nombreux mécanismes fondamentaux qui
se déroulent dans toutes les cellules eucaryotes.
B. Animaux utilisés dans les laboratoires

1. Drosophila melanogaster
La petite mouche Drosophila melanogaster occupe une place importante en recherche. Elle a fait
l’objet de très nombreuses études en particulier génétiques. Ces études ont permis de découvrir une
partie des mécanismes qui dirigent et contrôlent son développement embryonnaire et larvaire et, plus
précisément, de comprendre comment un zygote, produit de l’union de deux gamètes, se développe
en organisme multicellulaire constitué d’un grand nombre de cellules de types différents.
63 Année 2017 - 2018

2. Caenorhabditis elegans
Le nématode Caenorhabditis elegans est un autre organisme très étudié, plus petit et plus simple
que la drosophile. Ce ver se développe avec une grande reproductibilité depuis l’œuf fertilisé jusqu’à
l’adulte qui contient exactement 959 cellules. La séquence des événements, qui caractérisent ce
développement, a été décrite avec une grande précision.
3. Souris
La souris est utilisée depuis longtemps pour étudier la biologie des mammifères. Les nouvelles
techniques lui ont même donné une importance plus grande encore. En effet, il est possible de
sélectionner et produire des souris qui présentent des mutations ou des délétions de n’importe quel
gène spécifique ou possèdent et expriment des gènes construits artificiellement (souris
transgéniques). De cette façon, il est possible de comprendre à quoi est nécessaire un gène donné et
comment il fonctionne.
Il existe plusieurs types de transgénèse :
§ Transgénèse classique : insertion aléatoire dans le génome ;

§ Recombinaison homologue : insertion ciblée ;
§ Inactivation de gènes (Knock-out, KO) ;
§ Remplacement de gènes (Knock-in, KI).
Transgénèse par recombinaison homologue chez la souris
Les souris sont aussi utilisées pour produire des anticorps après injection d’antigènes.

Enfin, les êtres humains eux-mêmes, souffrant ou non de diverses pathologies héréditaires ou
acquises représentent une source importante de matériel biologique. Beaucoup de ce que nous savons
découle des études conduites sur les cellules humaines.
C. Modification du génome par la méthode CRISPR

CRISPR signifie “Clustured Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats”. Il s’agit de
répétitions situées dans le génome des bactéries. Ces répétitions peuvent être reconnues par une
endonucléase, Cas9. La découverte de ces mécanismes a entraîné il y a peu un énorme engouement
dans le domaine de la génétique et est très prometteur concernant ses opportunités thérapeutiques.
Palindrome : du grec pálin « en arrière » et drómos « course ». Désigne un texte ou un mot dont
l'ordre des lettres reste le même qu'on le lise de gauche à droite ou de droite à gauche, comme
dans la phrase « Ésope reste ici et se repose » ou encore « Elu par cette crapule ».
1. Historique :
§ 1987-2002 : découverte des séquences CRISPR : 5 séquences régulièrement espacées et
partiellement palindromiques chez E. coli, puis dans la plupart des bactéries.
§ 2005 : séquences CRISPR identiques à des séquences de bactériophage.
§ 2007 : découverte du pouvoir protecteur des CRISPR contre les bactériophages de la bactérie
lactique Streptococcus Thermophilus.
§ 2012 : ce système de défense peut être manipulé pour cibler n’importe quel gène.
2. Principe :
65 Année 2017 - 2018

§ Formation d’un ARNsg constitué d’ARN complémentaire à la séquence cible (crRNA) ainsi que
de tracrRNA ;
§ L’ARNsg se lie à la nucléase Cas9 via le tracrRNA ;
§ Cas9 reconnait la séquence cible et la séquence PAM sert d’adaptateur ; elle coupe les deux
brins de l’ADN au sein de la séquence cible.
L’ADN est ainsi clivé au sein de la séquence cible. On peut ensuite utiliser plusieurs techniques.
Il est alors possible de modifier le génome de

deux façons différentes :
- On peut laisser la coupure telle quelle : les
mécanismes de réparation de l’ADN vont
entraîner une insertion ou une délétion de
matériel génétique, ce qui donne un ADN
endommagé. Ce sera équivalent à un KO.
- On peut également mettre l’ADN coupé en
présence d’ADN donneur présentant des
homologies de séquence avec les extrémités
clivées. Ce sera équivalent à un KI car on aura
insertion du fragment d’intérêt.
Il est aussi possible d’utiliser des mutants de

CAS 9 sans activité endonucléase pour cibler
l’expression de protéines dans le génome. Ces
derniers se fixent sur la séquence palindromique
mais ne la clivent pas.
- Cas9 peut être associée à un facteur activateur
de la transcription, entrainant la transcription
d’une séquence protéique adjacente.
- Cas9 peut au contraire être associée à un
répresseur transcriptionnel.
- Elle peut aussi être associée à une protéine
fluorescente, comme la GFP, afin de visualiser
l’ADN.
Il serait possible de réguler quantitativement l’activité de Cas9, permettant une modulation génique
d’autant plus fine.
D. Cellules eucaryotes en culture

Il est possible, plus ou moins facilement, de cultiver in vitro des cellules eucaryotes.
E. Origine des cellules cultivées

Les cellules proviennent d’animaux de laboratoire, mais aussi de l’Homme, sain ou malade.
Beaucoup de types de cellules peuvent être cultivées.

F. Culture en suspension, culture sur support solide

Les cellules peuvent être cultivées en suspension. Ce sont les éléments nutritifs qui limitent
essentiellement leur croissance. Tant que ces éléments ne sont pas en quantité limitante, la croissance
est exponentielle. Certaines cellules ont besoin d’adhérer à une surface pour survivre et se diviser et
doivent donc être cultivées sur support solide en monocouche. Dans ce cas, lorsque ces cellules
arrivent à confluence, leur division s’arrête par inhibition de contact.
Des milieux de culture spéciaux, qui présentent une composition voisine de celle du milieu
intérieur de l’organisme (pH et sels en particulier), sont utilisés pour obtenir la survie et la
multiplication des cellules cultivées. Ces milieux sont le plus souvent additionnés de sérum (la phase
liquide du sang coagulé), qui apporte certains nutriments et facteurs de croissance (connus ou non)
essentiels à la survie et à la division des cellules. Des facteurs de croissance spécifiques des cellules
cultivées peuvent également être ajoutés au milieu. Les cellules doivent être cultivées de façon stérile
(emploi d’antibiotiques, travail dans des locaux confinés). La culture est, en général, menée à bien dans
des étuves à température et atmosphère contrôlées.
G. Les différents types de culture cellulaire

Beaucoup de tissus peuvent être mis en culture, leur structure histologique étant conservée, pour
un temps limité. Nous pouvons également cultiver des cellules issues des tissus.
Cultures primaires : après dissociation mécanique ou enzymatique du tissu (ex : collagénases,

trypsine), les cellules obtenues peuvent être mises en culture pour constituer une culture primaire.
Différents types de cultures cellulaires.
Après une première mise en culture, les cellules qui sont cultivées sur support solide peuvent être
détachées du support (généralement par la trypsine), diluées et remises en culture. Après deux
repiquages, nous parlons de culture secondaire. La même séquence de repiquage (détachement du
support, dilution, mise en culture) ne peut être répétée qu’un nombre de fois limité avant la mort des
cellules. Les caractéristiques des cellules cultivées in vitro peuvent se modifier au cours des repiquages.
Quelques cellules possèdent spontanément ou acquièrent des caractères qui leur permettent de
se diviser indéfiniment et de pousser en suspension, même sans sérum ni facteurs de croissance.
On observe une abolition de l’inhibition de contact. Elles forment alors une lignée cellulaire
continue ou clone cellulaire, ou lignée de cellules immortalisées. Les lignées de cellules immortalisées
sont très utilisées. L’immortalisation peut également être induite soit par mutagenèse chimique, soit
par infection par certains virus, soit par intégration d’oncogènes dans le génome de la cellule.
L’immortalisation peut aussi être naturelle, à partir de cellules cancéreuses.
67 Année 2017 - 2018

Faire entrer de l'ADN dans les cellules
II. Méthodes de séparation

Les méthodes de séparation consistent toutes à fractionner un mélange plus ou moins complexe
en ses constituants à des fins d’analyse ou de préparation. Nous partons souvent d’extraits cellulaires
obtenus en lysant (on pourrait dire en cassant) les cellules à l’aide de détergents ou par des moyens
physiques (ultrasons, broyage, choc osmotique, etc.).
A. La cytométrie en flux
CYTOMÉTRIE EN FLUX

Les cellules peuvent être analysées et isolées en fonction de leurs antigènes de surface et/ou
de leur taille par cytométrie de flux, grâce à des appareils qui analysent les caractéristiques
individuelles des cellules passant à travers un orifice. Les cellules sont emmenées dans un flot de
gouttelettes pour passer une par une devant le détecteur du cytomètre. Nous pouvons mesurer leur
taille, leur granulosité et leur fluorescence. Les cellules de l’échantillon peuvent être marquées avec
des anticorps fluorescents différents, permettant de détecter la présence et de mesurer la densité
d’un ou de plusieurs antigènes. La quantité d’ADN contenue dans chaque cellule peut également
être mesurée. Nous pouvons ainsi mesurer le nombre de cellules ayant doublé leur quantité d’ADN,
c’est-à-dire en train de se multiplier.
En plus de l’analyse des cellules, il est possible de les trier, c’est-à-dire de les séparer en
fonction d’un ou plusieurs paramètres mesurés (présence d’un antigène, quantité d’ADN, taille des
cellules...). En fonction des paramètres choisis, les cellules seront orientées dans différents
récipients collecteurs grâce à un champ électrique qui les orientera dans une direction ou une autre.
Les appareils utilisés pour l’analyse et le tri cellulaire s’appellent des FACS (Fluorescence-Activated
Cell Sorter).
La cytométrie en flux permet ainsi de trier les cellules mais

aussi et surtout de les analyser.
B. Fractionnement cellulaire, ultracentrifugation

Des particules en suspension dans un liquide sont séparées dans un champ de gravité artificiel
(qui est souvent exprimé en nombre de fois l’accélération de la pesanteur g), créé par rotation rapide
d’un tube contenant le mélange autour d’un axe. En général, nous parlons d’ultracentrifugation au-
dessus de 10 000 g.
Matériel d’ultracentrifugation.
1. Principes de l’ultracentrifugation
Lors d’une centrifugation, une particule est soumise à un ensemble de forces (force centrifuge,
force de friction) qui lui confèrent une vitesse de migration dans un champ centrifuge. Cette vitesse
augmente avec la vitesse de rotation, la distance des particules à l’axe de rotation, le diamètre des
particules et la densité des particules. Elle diminue si la viscosité ou la densité du milieu augmente.
Dans le cas particulier où la densité du milieu est supérieure à la densité des particules, elles migreront
en direction de l’axe de rotation. Nous parlons alors d’ultraflottation.
69 Année 2017 - 2018

2. Séparation par centrifugation selon la taille et la forme des particules
ULTRACENTRIFUGATION DIFFÉRENTIELLE : séparation selon la TAILLE
Nous nous plaçons dans des conditions telles que la densité des particules soit grande par
rapport à la densité du milieu. Dans ce cas, la vitesse de sédimentation ne dépend que du diamètre
des particules. La séparation du sérum et des cellules circulantes du sang, effectuée plusieurs
centaines de fois par jour pour les analyses de biochimie dans un hôpital de taille moyenne, en est
un exemple. La séparation est achevée par une centrifugation de 10 min à 1500 g.
L’ultracentrifugation différentielle permet une séparation par la taille.
ULTRACENTRIFUGATION DE ZONE : séparation selon la TAILLE et la FORME
La vitesse des particules est accélérée tout au long de

la centrifugation qui se déroule en milieu homogène. Dans
une ultracentrifugation de zone, la viscosité du milieu
augmente du sommet jusqu’au fond du tube, dans lequel
est constitué un gradient. L’augmentation du champ
centrifuge due à l’augmentation de la distance par rapport
à l’axe de rotation au fur et à mesure que les particules
migrent dans ce gradient est compensée par
l’augmentation de viscosité du milieu dans lequel migrent
les particules. Cependant, la densité du milieu reste
toujours plus faible que celle des particules à séparer. Les
particules sont placées à la surface du milieu de séparation,
dans lequel elles évoluent, dans le champ centrifuge, à des
vitesses différentes. Ainsi les particules se séparent. Si la
centrifugation était poursuivie, l’ensemble des particules
finirait par se rassembler au fond du tube.
L’ultracentrifugation de zone permet une

séparation par la taille ET la forme.

3. Séparation par centrifugation selon la densité
ULTRACENTRIFUGATION À L'ÉQUILIBRE ou ULTRACENTRIFUGATION ISOPYCNIQUE
Dans ce type de centrifugation, un gradient de

densité est formé de façon à ce que la densité au fond
du tube soit supérieure à celle des particules à séparer
et que la densité au sommet du tube soit inférieure à
celle des particules à séparer.
Dans les gradients utilisés précédemment la
densité était inférieure, dans tout le tube, à celle des
particules à séparer. Dans l’ultracentrifugation à
l’équilibre (isopycnique) chaque particule subit un
équilibre entre sédimentation (dans un milieu de plus
faible densité que la sienne) et flottaison (dans un
milieu de plus forte densité). Chaque particule cesse
de migrer dans le tube quand la densité du milieu
correspond à sa propre densité.
Deux utilisations de ce type d’ultracentrifugation

sont fréquentes dans les laboratoires :
§ la séparation de cellules de types différents.
Le gradient est alors constitué d’un sucre en
concentration croissante.
§ la séparation des diverses formes d’ADN ou
d’ARN par l’emploi de gradients de densité de
sels de métaux lourds (Chlorure de Césium).
Remarque. – S est appelée constante de sédimentation et exprimée en unité Svedberg (S). Elle ne
dépend que des caractéristiques de taille, de masse et de densité des particules séparées. Plus S
est grande, plus la vitesse de sédimentation sera élevée.
Tableau : Densités et coefficients de sédimentation de quelques particules et molécules. Les

ribosomes et les polyribosomes sont habituellement purifiés par ultracentrifugation différentielle au
cours du fractionnement cellulaire puis séparés les uns des autres par ultracentrifugation de zone en
gradient de saccharose, leur densité étant identique qu’ils soient sous forme de sous-unités, de
ribosome ou de polyribosomes. En revanche, l’ADN et l’ARN sont purifiés directement, après
extraction, par ultracentrifugation isopycnique.
71 Année 2017 - 2018

C. Chromatographie
CHROMATOGRAPHIE
Une phase mobile traverse une phase
stationnaire. Les molécules à séparer,
mélangées en solution, présentent des
affinités variables pour les deux phases :
mobile et stationnaire. Elles sont donc
entraînées de façon différentielle par le flux
de phase mobile.
Par gel filtration Par échanges d'ions Par affinité
Phase stationnaire : La molécule ayant l'affinité pour

§ chargée + : retiens les charges le ligand est retenue (autres : éluées).
- (échange d’anions) La molécule retenue sera éluée :
§ chargée - : retiens les charges § par compétition avec une autre
La phase stationnaire est + (échange de cations) molécule d’affinité plus grande
constituée de billes poreuses dont § par changement des conditions
La fixation des molécules sur physico-chimiques du milieu
les pores sont calibrés. Les
le support est favorisée par
molécules sont séparées selon
l’utilisation de solutions à faible Le ligand peut être :
leur taille. Les plus grosses
concentration saline
molécules se déplacent plus vite
(chargement). L’augmentation § un oligonucléotide pour retenir les
et sont donc éluées en premier car fragments d’acides nucléiques à
progressive de la concentration en
elles sont exclues des billes séquence complémentaire. Ex :
ion dans la phase mobile rompt les
poreuses et diffusent entre les TTTTTTTTTTTTT retiendra les ARN
interactions ioniques entre
billes. Les plus petites molécules polyadenylés par appariement A-T
support et molécules fixées
sont éluées en dernier car elles et permettra de purifier les ARNm.
dessus.
passent à l’intérieur des billes où § une séquence d’ADN pour purifier
leur migration est retardée. les protéines se fixant à l’ADN.
Plus les interactions ioniques
entre molécules et le support § le ligand naturel d’un récepteur ou
seront fortes, plus il faudra une le substrat d’une enzyme.
concentration saline élevée pour § un anticorps dirigé contre une
l’éluer (la détacher du support). protéine particulière.

D. Électrophorèse
1. Principe
L’électrophorèse est une méthode de fractionnement et d’analyse fondée sur la migration
différentielle de macromolécules biologiques, chargées électriquement, sous l’influence d’un champ
électrique.
Le mélange de molécules chargées sera placé dans un champ électrique créé par un générateur
de courant continu. Elles seront donc soumises à une force motrice qui sera proportionnelle à leur
charge et à la valeur du champ électrique. Le mouvement des molécules dans le champ électrique
sera ralenti par l’utilisation d’un support entre les mailles duquel les molécules seront déplacées. Les
molécules seront soumises à des forces de friction s’opposant à leur déplacement, proportionnelles à
leur taille et à la viscosité du support.
Matériel d’électrophorèse.
2. Séparation en fonction de la charge

Les molécules peuvent être séparées en fonction de leur charge à un pH donné. Les protéines,
par exemple, sont chargées sur leurs fonctions amines et carboxyliques. Chaque protéine présente une
charge globale caractéristique qui dépend du pH de la solution dans laquelle elle est en solution. À un
pH donné, une protéine donnée peut avoir une charge globale nulle (pHi de la protéine).
3. Séparation en fonction de la masse moléculaire (SDS-PAGE)

Les molécules pourront également être séparées en fonction de leur masse moléculaire.
Pour cela, les protéines sont traitées par le dodécyl-sulfate de sodium (SDS), détergent chargé
négativement. Le SDS se fixe sur les protéines par interactions hydrophobes, les recouvrant ainsi de
charges négatives ; les charges négatives ainsi fixées sur les protéines empêchent la renaturation de
ces dernières grâce aux forces de répulsions.
Ainsi traitées toutes les protéines sont chargées négativement et pourront être séparées par
migration dans un gel de polyacrylamide (PAGE ou « PolyAcrylamide Gel Electrophoresis ») en fonction
de leur masse moléculaire exprimée en dalton (Da). La distance parcourue à la fin de l’électrophorèse
sera inversement proportionnelle au logarithme de la masse moléculaire de la protéine ainsi séparée.
(La principale différence entre gel de polyacrylamide et gel d’agarose est la différence de taille des
mailles).
73 Année 2017 - 2018

Le traitement par le SDS sans agent réducteur permet la conservation des ponts disulfures. Dans
ces conditions l’électrophorèse des protéines sera effectuée en condition non réductrice.
Une incubation à 90°-100°C des protéines en présence de SDS et d’un agent réducteur
(généralement le β-mercaptoéthanol) permet de séparer différentes sous-unités d’un complexe fait
de plusieurs protéines liées entre elles par des ponts disulfures : nous parlons alors d’électrophorèse
en condition réductrice.
Electrophorèse de protéines après traitement au SDS.
4. Électrophorèse bidimensionnelle
Elle consiste à faire une première séparation des protéines en fonction de leur charge par
isoélectrofocalisation, puis une seconde séparation perpendiculaire à la première en fonction de la
taille en présence de SDS.
5. Détection des protéines après électrophorèse

Les protéines séparées peuvent être révélées :
§ par divers colorants : bleu de Coomassie, nitrate d’argent ;
§ par des fluorochromes ;
§ par autoradiographie si les protéines ont été préalablement marquées ;
§ par analyse de leur activité si ce sont des enzymes (zymographie). Cette méthode n’est
utilisable que si les protéines ne sont pas dénaturées.

III. Méthodes de quantification et d’analyse

A. Spectrophotométrie
Il existe de très nombreuses méthodes de spectrophotométrie. Parmi ces méthodes, deux
présentent un intérêt fondamental au laboratoire ; ce sont la spectrophotométrie d’absorption, l’une
dans l’UV, l’autre dans le visible.
1. Principe physique
Sous l’influence d’un rayonnement électromagnétique, un électron passe d’une orbitale
moléculaire interne de forte énergie de liaison au noyau, à une autre orbitale, plus externe et de plus
faible énergie.
Dans une molécule, les électrons se trouvent sur des orbitales dont les niveaux d’énergie sont
différents. Les niveaux d’énergie que peuvent prendre les électrons des atomes d’une molécule sont
spécifiques de cette molécule. Le passage d’un électron d’une orbitale interne à une orbitale externe
requiert de l’énergie. Elle est apportée par le rayonnement électromagnétique, dont l’énergie
absorbée est égale à la différence d’énergie qui existe entre les deux orbitales. L’ensemble des
transitions possibles pour une molécule entre les niveaux d’énergie électronique autorisés forme une
série discontinue ou spectre.
2. Utilisation dans un but de dosage

Pour doser une molécule, c’est-à-dire connaître sa concentration en solution, la solution est
placée sur le trajet d’un rayonnement électromagnétique de longueur d’onde fixe telle qu’il peut être
absorbé par la molécule. Dans ces conditions, l’absorption (ou densité optique : DO) est directement
proportionnelle à la concentration de la molécule dans la solution. La DO s’exprime sans dimension.
Un spectrophotomètre est constitué :
§ d’une source de rayonnement,
§ d’un dispositif de diffraction qui permet de produire un rayonnement de longueur

d’onde déterminée,
§ d’un système de mesure des photons transmis après absorption par la substance analysée.
3. Utilisation des radio-isotopes en biologie

Les noyaux de certains atomes ne sont pas stables et se désintègrent spontanément ; on dit qu’ils
sont radioactifs. Il existe environ 70 isotopes radioactifs naturels et il existe aussi des radio-isotopes
artificiels fabriqués par l’Homme.
4. Les rayonnements β et γ
Parmi les éléments d’intérêt biologique, aucun ne possède de radio-isotope émetteur α ; ce type
de rayonnement ne sera donc pas décrit.
§ les rayonnements β- : certains noyaux instables tendent à se stabiliser par la
transformation d’un de leurs neutrons en un proton. La transformation s’accompagne de
l’émission d’un électron chargé négativement que l’on appelle particule β-.
75 Année 2017 - 2018

§ les rayonnements β+ : l’instabilité de certains atomes provient du fait qu’ils renferment

un nombre trop élevé de protons par rapport aux neutrons. L’émission de ces atomes
peut se faire par la transformation d’un proton en neutron avec émission d’une particule
chargée positivement, appelée β+.
§ les rayonnements γ : à la suite de l’émission par un noyau d’une particule β- ou β+, le
noyau final peut se trouver dans un état excité. Le noyau excité perdra son excédent
d’énergie en émettant un rayonnement électromagnétique appelé rayonnement γ.
Les radio-isotopes ou isotopes radioactifs sont très faciles à mettre en évidence et à incorporer à
des substances très variées, dont des macromolécules biologiques (acides nucléiques, protéines...).
Ils présentent des inconvénients : ils sont dangereux pour l’utilisateur et pour l’environnement ;
certains, qui ont une demi-vie courte, ne peuvent être mis en évidence que pendant une durée limitée
après le marquage.
Isotope Demi-vie
32
P 14 jours
131
I 8,1 jours
35
S 87 jours
14
C 5570 années
45
Ca 164 jours
3
H 12,3 années
5. Marquage métabolique
L’activité métabolique des cellules est utilisée pour incorporer de la radioactivité apportée par un
précurseur à un produit du métabolisme. Plusieurs méthodes utilisent le marquage métabolique : la
méthionine (M) ainsi que la cystéine (C) préalablement marquées au [35S], peuvent être utilisées
comme précurseurs dans la synthèse des protéines. La [35S]-M (et/ou [35S]-C) est fournie à une cellule
en culture dans le milieu. La cellule incorpore la méthionine radio-marquée dans les protéines qu’elle
synthétise tant que la méthionine marquée est présente dans le milieu. De l’acide ortho-phosphorique
marqué au 32P est fourni dans le milieu de culture. Cela permet d’étudier les modalités de
phosphorylation des protéines ou d’autres types de molécules. D’autres isotopes, comme le 14C, le 15N
et le 18O, sont couramment utilisés comme traceurs.
6. Le marquage court suivi d’une chasse (Pulse-Chase)

Après avoir appauvri la source d’un précurseur non radioactif dans le milieu, le précurseur
radioactif est fourni à la cellule. Au bout d’un temps plus ou moins long, contrôlé par
l’expérimentateur, le milieu qui contient le précurseur radioactif est éliminé et remplacé par un milieu
contenant le précurseur uniquement sous sa forme non radioactive. Le temps de chasse est également
contrôlé en fonction de ce qui est recherché.
Seules les molécules synthétisées pendant le temps ou le précurseur radioactif était présent
seront marquées. Cette méthode est appliquée pour localiser un lieu de synthèse, suivre le devenir
dans la cellule des molécules synthétisées (calcul de la demi-vie).

7. Marquage in vitro
Une protéine peut être marquée in vitro à l’iode 125 (125I). Ce marquage est souvent utilisé pour
étudier les liaisons entre un récepteur et son ligand. Ceci permet également de quantifier l’affinité du
ligand pour son récepteur (notions de KA et KD).
8. Détection et mesure de la radioactivité

Le 32P, le 35S, le 14C et le 3H émettent des rayonnements β-. Ces rayonnements sont détectés par
impression d’un film dont l’émulsion est sensible à ce type de particule (type film photographique) ou
quantifiés dans un compteur à scintillation liquide ou compteur "β".
Principe du compteur β : l’échantillon à mesurer est placé dans un solvant organique ou une
solution aqueuse, appelé scintillant. Le rayonnement β émis par l’échantillon provoque un
changement d’orbitale des électrons du scintillant. Lorsque ces électrons reviennent à leur orbitale
d’origine des photons sont émis. L’intensité du signal lumineux ainsi produit est mesurée.
À chaque source radioactive correspond une longueur d’onde particulière et l’intensité du signal
est proportionnelle à la quantité de radioactivité contenue dans l’échantillon. En étalonnant l’appareil
avec des sources connues, il est donc possible de quantifier très précisément la radioactivité
incorporée dans un échantillon biologique.
D’autres isotopes utilisés en biologie ne sont détectés que par spectrométrie de masse. En effet,
ces molécules n’émettent pas de rayonnement mais leur masse atomique est modifiée. C’est le cas de
l’18O, de 15N et du 13C.
Enfin, certains isotopes émettent des rayonnements de types γ, comme l’125I ou l’24N. Ces
rayonnements sont aussi détectés dans des compteurs dits γ. Dans ce type de compteur, ce n’est pas
un liquide scintillant mais un cristal sensible, placé au contact de l’échantillon, qui est utilisé pour
amplifier le rayonnement radioactif.
B. Électrotransfert des protéines sur support solide

Après séparation par électrophorèse en gel de polyacrylamide, il est possible de transférer les
protéines sur une membrane afin de procéder à l’analyse d’une protéine particulière. Actuellement,
les supports les plus utilisés sont les membranes de nitrocellulose et de difluorure de polyvinyl (PVDF).
Principe de l’électrotransfert d’une protéine.
Le gel (C) est déposé sur une membrane de nitrocellulose (D). L’ensemble est placé entre plusieurs
couches de papier imbibé de tampon permettant le passage du courant électrique (B et E). Les
protéines, toujours entourées de SDS, migrent vers le pôle positif et sont adsorbées sur la membrane
à la surface de laquelle elles sont retenues par interaction hydrophobe.
La coloration de la membrane, après transfert, par le rouge Ponceau, le noir Amido ou le bleu de
Coomassie permet de vérifier l’efficacité du transfert et la position des protéines. Ces protéines, ainsi
transférées et immobilisées, peuvent être soumises à d’autres analyses impossibles à effectuer dans
le gel de polyacrylamide, comme leur détection par des anticorps (immunomarquage).
77 Année 2017 - 2018

C. Détection des protéines

Cette détection est principalement basée sur la réaction antigène-anticorps. Les anticorps ou
immunoglobulines (Ig) sont des glycoprotéines présentes dans le plasma, les liquides extravasculaires,
les sécrétions. Ils ont un pouvoir de liaison spécifique avec le déterminant antigénique (épitope), qui a
provoqué leur synthèse.
1. Antigène
C’est une macromolécule naturelle ou synthétique qui, reconnue par des anticorps ou des
cellules du système immunitaire d’un organisme, est capable de déclencher chez celui-ci une réponse
immunitaire.
De nombreuses substances sont antigéniques. C’est le cas d’organismes entiers, comme des
bactéries, des virus ou des parasites, ainsi que des cellules. Les macromolécules biologiques (protéines,
sucres complexes...) sont également antigéniques. De petites molécules comme certains médicaments
peuvent également être antigéniques. Des animaux pourront ainsi être immunisés contre des
protéines qui proviennent de microorganismes pathogènes ou non, de cellules de tous types et même
contre des anticorps produits par une autre espèce animale. Dans un antigène, il peut y avoir plusieurs
déterminants antigéniques ou épitopes, qui sont les parties de l’antigène directement reconnues par
un anticorps particulier. Les animaux les plus couramment utilisés sont la souris et le lapin, mais on
trouve également des anticorps produits par des chèvres, des ânes...
2. Anticorps polyclonaux, sérum immun

L’injection d’un antigène donné entraîne la production de nombreux anticorps différents. Ces
anticorps circulent dans le sang. Il est possible d’utiliser comme réactif, le sérum d’un animal immunisé
soit directement, soit après une purification plus ou moins poussée des anticorps qu’il contient.
3. Anticorps monoclonaux
Production d'un anticorps monoclonal
Il est possible d’obtenir un clone de cellules produisant un et un seul des anticorps retrouvés
dans un sérum immun. La procédure consiste à fusionner les lymphocytes producteurs d’anticorps
avec des cellules cancéreuses pour qu’ils acquièrent la capacité à se multiplier en culture en
suspension. Les clones sont ensuite séparés par dilution de façon à avoir une cellule par puits, puis
testés (par exemple en western blot) pour leur capacité à produire un anticorps dirigé contre la
protéine d’intérêt.

4. Utilisation des anticorps

L’interaction antigène-anticorps est très spécifique et de forte affinité. Les anticorps permettent
de purifier et d’identifier des molécules parmi un mélange de molécules, mais également de les doser
et de les localiser.
ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)

ELISA indirecte ELISA par immunocapture ELISA en sandwich
Ces méthodes font appel à la mise en évidence d’une réaction antigène-anticorps grâce à une
enzyme qui peut être couplée soit à l’anticorps primaire soit à l’anticorps secondaire, en fonction
de ce que l’on veut rechercher et éventuellement doser. Par exemple, dans le sang, la présence
d’anticorps spécifiques contre des déterminants antigéniques donnés peut être mise en évidence
par ELISA indirect ou par la constitution d’un « sandwich ». Inversement, il est possible de mettre
en évidence par immunocapture un antigène que l’on recherche dans le sang.
Les protéines après électrophorèse sont fixées sur une membrane (cf. transfert).
Ces protéines sont révélées avec un anticorps primaire et un anticorps secondaire
(immunoblot)
Cas du WB
couplé à une enzyme. Dans cette méthode, l’enzyme réagit souvent avec un substrat
qui permet l’émission de lumière, ce qui permet de visualiser les protéines en plaçant
la membrane sur un film photographique. Parfois, le substrat employé est précipitant
après transformation par l’enzyme et marque donc la localisation de la protéine
directement sur la membrane.
IMMUNOPRÉCIPITATION
Cette technique permet d’isoler et de détecter une protéine au sein d’un milieu complexe mais
elle est également utilisée pour mettre en évidence les interactions entre protéines (co-
immunoprécipitation). Elle repose sur la propriété des protéines A et G (issues de bactéries)
d’interagir avec les anticorps. Ces protéines couplées à des billes de polymères (exemples :
sépharose, agarose) vont permettre la formation d’un complexe avec l’anticorps qui reconnaît
spécifiquement la protéine d’intérêt. Ce complexe de très grosse masse moléculaire (en raison de
la présence des billes) pourra ensuite être récupéré aisément par centrifugation. La protéine
reconnue par l’anticorps ainsi que les protéines qui interagissent avec elle seront ainsi séparées du
reste des protéines du mélange de départ. On pourra ensuite effectuer un Western Blot ou d’autres
techniques d’analyses protéiques pour déterminer la nature des protéines obtenues.
79 Année 2017 - 2018

IMMUNOHISTOCHIMIE
Cette technique est utilisée pour déterminer la localisation cellulaire ou tissulaire d’une
molécule donnée. La coupe tissulaire ou les cellules, préalablement fixées sur un support, sont
incubées dans une solution contenant l’anticorps. Dans le cas de l’immunofluorescence directe, cet
anticorps est directement couplé au fluorochrome (fluorescéine, rhodamine,...). Pour
l’immunofluorescence indirecte, un anticorps secondaire est nécessaire, comme dans le cas du
"western blotting" ou de l’ELISA. Le marquage est observé à l’aide d’un microscope à
épifluorescence.
D. Microscopie
La compréhension de l’architecture et des mécanismes de fonctionnement des cellules est
fondée, en partie, sur la microscopie. Selon les éléments que nous souhaitons observer (tissus, cellules
entières, organites, protéines), différentes techniques de microscopie peuvent être utilisées.
1. Microscopie optique
C’est la technique la plus classiquement utilisée pour observer par exemple des coupes de tissus,
des cellules en culture ou encore des cellules fixées et colorées. Il existe différents microscopes
optiques.
MICROSCOPIE OPTIQUE CLASSIQUE

Le microscope contient une source de lumière qui est
focalisée sur l’échantillon par des condenseurs. La lumière
transmise passe alors à travers un objectif et parvient jusqu’à l’œil
de l’utilisateur via des lentilles optiques. L’échantillon est en
général monté sur une lame de verre après avoir subi plusieurs
étapes : fixation, inclusion dans un bloc de paraffine et coupe au
microtome (pour tissus) puis coloration avec divers colorants
selon les composants cellulaires que nous souhaitons observer
(exemples : la fuschine colore l’ADN, la benzidine colore les
protéines contenant un hème ou les acides nucléiques). Les cellules
fixées sont mortes (par exemple inclusion de cellules dans de la
paraffine), mais ce type de microscopie est possible aussi avec des
cellules vivantes.
La microscopie optique classique a une résolution de 200 nm.

MICROSCOPIE OPTIQUE À CONTRASTE DE PHASE ET INTERFÉRENCE DE NOMARSKI

Contraste de phase Ces techniques sont fondées sur les
phénomènes de diffraction et de réfraction des ondes
lumineuses. Comme les éléments cellulaires ont des
indices de réfraction différents dus à leur densité, ils
apparaîtront avec des intensités lumineuses variables
ce qui permettra de les distinguer. Pour la
Nomarski microscopie à contraste interférentiel de Nomarski,
un prisme permet de produire des interférences entre
les ondes réfléchies ce qui donne une impression de
relief à l’image finale. La microscopie à contraste de
phase est la technique de choix pour visualiser les
cellules en culture.
MICROSCOPIE OPTIQUE À ÉPIFLUORESCENCE

Dans ce cas, le
microscope est muni de
filtres permettant la sélection
de longueurs d’onde
d’excitation et d’émission
précises afin de détecter la
fluorescence émise par
l’échantillon. Dans ce dernier,
une protéine spécifique ou
d’autres molécules auront
été rendues fluorescentes
par couplage covalent à un
fluorochrome.
2. Microscopie confocale
Principe du MICROSCOPE CONFOCAL
Fondée sur la technique de microscopie à épifluorescence, la microscopie confocale diffère par

l’utilisation d’un LASER comme source lumineuse. Ceci permet de cibler précisément un point de
l’échantillon et ainsi de s’affranchir de toutes interférences environnantes. L’observation de
l’échantillon est réalisée par des plans successifs qui peuvent ensuite être superposés pour obtenir
une image en trois dimensions.
81 Année 2017 - 2018

3. Utilisation des protéines de fusion fluorescentes

Le génie génétique permet de produire des gènes chimériques en fusionnant les séquences
codantes de deux protéines. La découverte de protéines fluorescentes chez les méduses (GFP : Green
Fluorescent Protein), a permis de construire des protéines chimériques fluorescentes. Le gène chimère
peut être introduit dans le génome d’un organisme modèle ou dans des cellules en culture par
l’intermédiaire d’un vecteur d’expression (voir notions de génie génétique ci-dessous).
Ainsi, il est possible d’obtenir des cellules exprimant une protéine fluorescente que nous pouvons
visualiser par microscopie à épifluorescence ou microcopie confocale.
Depuis l’identification de la GFP, des protéines fluorescentes de différentes couleurs ont été
identifiées : jaune, bleu, rouge. Outre le fait que ces protéines de fusion permettent de visualiser des
protéines dans les cellules sans utiliser d’anticorps, elles ont des applications particulières :
Vidéo-microscopie
En enregistrant des images des cellules à intervalles de temps réguliers, il est possible de suivre
le déplacement d’une protéine de fusion dans les cellules.
FRET (Fluorescence par Transfert de l'Énergie de Résonance)
Deux possibilités...
Pas d'interaction entre les protéines X et Y Interaction entre les protéines X et Y
Cette méthode permet de détecter l’interaction entre deux protéines de fusion. Les deux
protéines d’intérêt sont fusionnées à des protéines fluorescentes choisies de façon à ce que le
spectre d’émission d’une des protéines chevauche le spectre d’absorption de l’autre. Si les deux
protéines se lient, elles seront suffisamment proches pour que l’un des marqueurs fluorescent
transfère son énergie lumineuse à l’autre (l’excite) afin qu’il émette à son tour de la lumière. Donc,
si le complexe est éclairé à la longueur d’onde d’excitation du premier marqueur fluorescent, il
produira de la lumière à la longueur d’onde du second marqueur fluorescent.

FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching ou Récupération de Fluorescence Après Photoblanchiment)
Une trop forte illumination des protéines fluorescentes (et des fluorophores en général) les
rend incapables de produire de la lumière (photobleaching ou photoblanchiment). À l’aide d’un
LASER, il est possible de pratiquer un photoblanchiment des protéines de fusion fluorescentes dans
une zone particulière de la cellule (de l’ordre du micron), et de suivre par videomicroscopie le retour
de la fluorescence dans la zone blanchie. Le retour de la fluorescence étant dû aux protéines de
fusion situées autour de la zone blanchie, nous pouvons mesurer les paramètres cinétiques de la
protéine de fusion (vitesse de transport, coefficient de diffusion, resynthèse...).
MICROSCOPIE ÉLECTRONIQUE à transmission
Cette microscopie est similaire, dans son

principe, à la microscopie optique, la lumière
étant remplacée par un flux d’électrons. Un
filament de tungstène émet un faisceau
d’électrons et des bobines magnétiques
permettent de faire converger ce faisceau
d’électrons. Afin d’éviter la collision des
électrons avec les molécules d’air, le vide doit
être établi dans la colonne du microscope. La
préparation des échantillons diffère également
puisqu’il faut faire des coupes des échantillons
en section de 50 nm environ puis marquer les
composants cellulaires par des sels de métaux
lourds qui présentent des pouvoirs différents
de diffraction des électrons. Il est possible de
réaliser des immunomarquages en utilisant
des anticorps couplés à des particules d’or.
La microscopie électronique a une résolution inférieure à 1 nm.
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IV. Notions de génie génétique

A. Les vecteurs
Les vecteurs utilisés sont des acides nucléiques qui dérivent de structures qui existent dans la
nature, mais qui ont été modifiées au laboratoire. Les modifications permettent d’adapter les
propriétés de ces vecteurs aux objectifs visés et d’insérer les fragments d’acide nucléique auxquels
nous nous intéressons.
1. Les plasmides
ÙÙ
Plasmide. – Fragment d'ADN extra-chromosomique (épisome) circulaire présent dans les
bactéries, susceptible de se répliquer de façon autonome. Il peut porter des gènes de résistance
aux antibiotiques transférables par conjugaison. Expérimentalement un plasmide peut être utilisé
comme vecteur.
En général, les plasmides contiennent une origine de réplication qui leur permet de se répliquer
indépendamment du chromosome bactérien (épisome).
Naturellement, les plasmides possèdent plusieurs fonctions :

§ Certains plasmides permettent l’échange de matériel génétique entre les bactéries : ce
phénomène est appelé conjugaison bactérienne.
§ Certains plasmides confèrent une propriété de défense vis-à-vis des autres cellules : ils
possèdent des gènes responsables de la synthèse de protéines qui sont excrétées par la
bactérie et qui tuent les bactéries voisines.
§ D’autres plasmides contiennent des gènes de protéines qui confèrent une résistance à
certains antibiotiques. Par exemple la résistance de certaines bactéries envers la
pénicilline provient d’un plasmide responsable de la synthèse de la β-lactamase. Cette
enzyme est capable de dégrader la pénicilline.
Expérimentalement, les plasmides permettent de cloner un fragment d’intérêt, c’est-à-dire de

l’insérer dans le plasmide pour le multiplier de façon à l’obtenir en quantité suffisante et à le conserver.
Surexpression d’un gène : les plasmides utilisés contiennent des éléments supplémentaires par
rapport aux vecteurs de base. Pour une surexpression, un vecteur possède entre autres un promoteur
qui permet la synthèse de l’ARN par transcription de l’ADN inséré. Ce promoteur est choisi en fonction
de la cellule dans laquelle le vecteur sera introduit. Il peut être d’origine virale, procaryote ou
eucaryote. Ces vecteurs permettent donc la synthèse d’une protéine particulière dans la cellule hôte
(par exemple, synthèse dans le but de purifier une protéine avec étiquette).
2. Les enzymes de restriction

Les enzymes de restriction sont des endonucléases qui ont été découvertes chez les bactéries.
Elles constituent un outil fondamental du génie génétique. Pour la bactérie, ces enzymes constituent
un système de défense. Quand un bactériophage infecte une bactérie, celle-ci peut dégrader l’ADN
viral en le coupant grâce à des endonucléases qu’elle produit et qui reconnaissent des séquences
spécifiques. Les enzymes de restriction coupent l’ADN bicaténaire par rapport à une origine précise,
de manière définie et reproductible. Les séquences reconnues peuvent aller de 4 à 8 paires de bases.

Le site reconnu est en général palindromique, c’est-à-dire que la séquence est identique qu’elle soit
lue de gauche à droite sur un brin ou de droite à gauche sur l’autre brin.
Différents types d’extrémités peuvent être obtenues selon le site de coupure :
§ Extrémité cohésive
§ Extrémité franche
B. Les enzymes utilisées le plus couramment en génie génétique

1. Les nucléases DNAse I
Ces enzymes coupent l’ADN après les bases pyrimidiques (C, T).
Applications. – Les enzymes de restriction peuvent être utilisées dans l'élimination d’ADN dans une
préparation, dans l'analyse de gènes actifs ou pour la création de cassure.
Nous retrouvons par exemple la nucléase S1 et les RNases (A : hydrolysent l’ARN après les bases
pyrimidiques / H : hydrolyse l’ARN dans les hybrides ARN/ADN).
2. Les ligases
Elles permettent de ligaturer l’extrémité 5’-phosphate d’un brin d’ADN et l’extrémité 3’-OH d’un
autre brin.
3. Les phosphatases
Elles catalysent l’hydrolyse du 5’-phosphate d’un acide nucléique.
4. Les kinases
Les kinases utilisées sont capables d’effectuer deux types de réactions :
§ Réaction directe : elles peuvent catalyser le transfert du phosphate de l’ATP sur
l’extrémité 5’-OH de l’ADN ;
§ Réaction d’échange : elles sont aussi capables de remplacer le phosphate.
85 Année 2017 - 2018

5. Les polymérases
§ l'ADN polymérase I coupe l’extrémité 5’ de l’ADN par le phosphate de l’ATP. L’ADN
polymérase I peut synthétiser un ADN bicaténaire à partir d’un ADN monocaténaire
contenant une amorce 3’-OH.
§ l’ADN polymérase ARN-dépendante ou "transcriptase inverse" synthétise un ADN
bicaténaire à partir d’un ARN. Cette enzyme requiert une amorce pour synthétiser le
premier brin complémentaire de l’ARN à partir de l’extrémité 3’ de l’amorce. Le deuxième
brin de l’ADN est synthétisé par la même enzyme avec élimination simultanée de l’ARN
grâce à son activité ribonucléase H. Cette enzyme est essentielle pour analyser
l’expression des gènes car elle permet de synthétiser de l’ADN à partir d’ARNm (en
utilisant une amorce de poly-dT qui se fixe au poly-A des ARNm). L’ADN ainsi obtenu (ADN
complémentaire ou ADNc) peut ensuite être amplifié par PCR. La quantification des
fragments d’ADN amplifiés par PCR avec des amorces complémentaires à un gène
particulier donne une mesure de la quantité d’ARN initial issue de ce gène.
§ les ARN polymérases ADN-dépendantes issues des bactériophages T3, T7 et SP6 sont
utilisées pour synthétiser des ARN à partir d’ADN. Chaque enzyme débute la synthèse de
l’ARN spécifiquement et exclusivement à partir de son propre promoteur.
C. Le clonage
ÙÙ
Clonage cellulaire. – Isolement d’une cellule et de sa descendance pour former une lignée
cellulaire qui provient donc d’un unique ancêtre. Toutes les cellules issues de cet ancêtre possèdent
un génotype identique et sont appelées clones.
ÙÙ
Clonage moléculaire. – Recombinaison in vitro d’un gène et, par extension, d’un fragment
d’ADN avec un vecteur qui se réplique de façon autonome à l’intérieur d’une cellule hôte. La culture
de cette cellule qui contient le vecteur recombiné permet l’isolement de l’ADN inséré, à l’état pur
et en quantités illimitées.
Afin de cloner un fragment d’ADN dans un vecteur tel qu’un plasmide, le vecteur et le fragment
à insérer sont digérés par des enzymes de restriction dont les extrémités sont compatibles. Le fragment
à insérer est alors introduit dans le vecteur où il est ligaturé grâce à une ligase. Le vecteur recombiné
est ensuite introduit dans des cellules hôtes.
1. La transformation bactérienne
C’est une technique qui permet de faire pénétrer de l’ADN dans une bactérie. Les bactéries
transformées, qui ont incorporé l’ADN, sont ensuite sélectionnées sur la base des caractéristiques
conférées par cet ADN. Par exemple, un ADN d’intérêt peut être introduit dans un plasmide qui
contient également un gène de résistance à la pénicilline. Ainsi, en cultivant les bactéries transformées
en présence de pénicilline, seules celles qui ont incorporé le plasmide, et donc le gène d’intérêt, se
développeront grâce à la présence du gène de résistance à la pénicilline.
2. La transfection des cellules eucaryotes

Plusieurs techniques sont utilisées pour introduire des molécules d’ADN dans des cellules
eucaryotes (détaillées dans l’I.F).

3. La préparation des plasmides

La préparation des plasmides est effectuée après culture en masse du clone de bactéries
recombinées à analyser. Les bactéries cultivées en masse sont ensuite lysées (détergents, soude), puis
le plasmide est purifié (chromatographie, électrophorèse ou ultracentrifugation).
D. Électrophorèse des acides nucléiques

Les acides nucléiques peuvent être séparés en fonction de leur taille exprimée en paire de bases
(pb) ou kilo-paire de bases (kpb). Leur séparation est effectuée par migration à travers une matrice
sous l’influence d’un champ électrique. La matrice la plus couramment utilisée au laboratoire est
l’agarose. L’agarose est un polysaccharide linéaire (constitué de D- et de L-Galactose) extrait d’une
algue qui forme un gel dans lequel les molécules d’ADN migrent d’autant plus vite qu’elles sont petites.
Les acides nucléiques, chargés négativement du fait de leurs

groupements phosphates, migrent vers le pôle positif du
circuit.
Après l’électrophorèse, les molécules d’ADN peuvent être visualisées par fluorescence : des
substances chimiques (bromure d’éthidium par exemple) interagissent spécifiquement avec la double
hélice d’ADN. Cette interaction rend ces molécules capables, du fait de leur empilement, d’émettre un
rayonnement de fluorescence quand elles sont excitées à une longueur d’onde spécifique (des UV).
Cela est utilisé pour visualiser la présence d’un acide nucléique dans un gel après séparation par
électrophorèse. Si un ADN témoin de quantité connu a été séparé dans le même gel, la quantité d’ADN
de l’échantillon d’intérêt peut être estimée en comparant l’intensité de fluorescence des deux signaux.
Réalisation d’une électrophorèse d’acides nucléiques.
87 Année 2017 - 2018

E. Hybridation moléculaire et sondes

L’hybridation est l’appariement de brins complémentaires ADN-ADN, ADN- ARN ou ARN-ARN. Si
les conditions expérimentales sont correctes, la reconnaissance entre les deux brins est suffisamment
spécifique pour qu’un fragment d’ADN ou d’ARN de quelques dizaines à quelques centaines de bases
s’hybride avec une séquence complémentaire diluée parmi des millions de séquences différentes.
Lorsqu’un double brin d’ADN est chauffé, les deux brins de la molécule se séparent à la suite de
la rupture des liaisons hydrogène qui maintiennent les deux brins appariés.
En sens inverse, lorsque la température diminue progressivement, on observe un ré-appariement

des brins complémentaires. Un refroidissement brutal de la température après dénaturation empêche
la renaturation du double brin.
1. Autres agents dénaturants

Certains agents permettent de déstabiliser la structure en double hélice de l’ADN en rompant les
liaisons hydrogène (urée, pH basiques, formamide).
2. Complémentarité des deux brins

Les liaisons hydrogène peuvent se former au sein des molécules d’acides nucléiques entre
adénine et thymine (ou uracile) d’une part, entre guanine et cytosine d’autre part. Les bases
complémentaires C et G sont appariées par trois liaisons hydrogène. Les bases A et T sont appariées
par deux liaisons. Un ADN riche en C et G sera donc thermodynamiquement plus stable qu’un ADN
riche en A et T.
Deux brins partiellement complémentaires pourront s’hybrider. Cette hybridation sera

d’autant moins stable qu’il y aura plus de mésappariements.
3. Sondes d’acides nucléiques

L’hybridation (en particulier en milieu liquide) permet d’étudier la nature de l’ADN. Cependant,
les sondes d’acides nucléiques sont le plus souvent utilisées pour détecter la présence de la molécule
étudiée, dans un mélange complexe d’ADN ou d’ARN.
Une telle sonde peut être préparée ou isolée sous forme pure (par une synthèse chimique
d’oligonucléotide ou par clonage).
Pour détecter la molécule d’intérêt, la sonde est marquée par un isotope radioactif ou par des
molécules fluorescentes. Les méthodes de marquage peuvent mettre en œuvre de simples réactions
chimiques, une catalyse enzymatique ou la transcription in vitro en présence d’un nucléotide marqué,
d’un ADN cloné destiné à la synthèse d’une sonde.
4. Applications
Les hybridations sur support solide, mises en œuvre très couramment, comprennent 2 étapes :
§ la première étape est une mise en contact de la sonde avec le support (par exemple une
membrane) sur lequel se trouve l’ADN cible, sous forme simple brin. L’hybridation peut
aussi être effectuée sur des coupes de tissus fixées sur lame de verre (hybridation in situ).
La mise en contact est effectuée dans des conditions physico-chimiques (en particulier de
température et de salinité) qui permettent l’hybridation.

§ la seconde étape correspond à l’élimination de la sonde non fixée. C’est une phase de
lavage. Les conditions physico-chimiques sont là aussi essentielles. L’expérimentateur les
fera varier selon qu’il veut obtenir une plus ou moins grande spécificité de l’hybridation.
Si l’objectif est de mettre en évidence une séquence strictement complémentaire de la
sonde, il faudra des conditions plus restrictives que si l’objectif est de mettre en évidence
des séquences de moins forte homologie.
F. Marquage des acides nucléiques - Marquage in vitro

1. Marquage des extrémités de l’ADN
L’extrémité 5’-phosphate de l’ADN peut être marquée à l’aide d’une kinase. La source de
radioactivité est ici le phosphate γ marqué au 32P, de l’ATP.
2. Marquage par PCR

De l’ADN double brin radioactif peut être obtenu au cours de la PCR en utilisant des nucléotides
radioactifs.
3. Synthèse d’ARN radioactif

Il est possible de fabriquer in vitro un ARN complémentaire d’un ADN. Pour cela, l’ADN, servant
de matrice, est cloné dans un plasmide comportant un promoteur de transcription procaryote. L’ARN
est synthétisé en incubant à 37°C le plasmide, une ARN polymérase et des nucléotides radioactifs.
4. Marquage in vivo
Les ADN et les ARN peuvent être marqués au cours de leur synthèse directement dans la cellule.
Pour cela, le nucléotide radioactif (32P UTP pour l’ARN et 3H dTTP pour l’ADN) est ajouté au milieu de
culture pendant un temps déterminé.
G. La PCR
La PCR (abréviation de « Polymerase Chain Reaction » en anglais) est une méthode d’amplification
spécifique d’ADN par synthèse enzymatique itérative in vitro. Nous pouvons l'assimiler à une méthode
de clonage acellulaire. Cette méthode, introduite en 1988, a entraîné une révolution dans le travail
quotidien des biologistes.
1. Description de la méthode de PCR - Activité de l’ADN polymérase

L’enzyme employée est une ADN polymérase thermostable. Pour synthétiser un brin d’ADN, du
5’ vers le 3’, elle requiert la présence :
§ d’une matrice d’ADN,
§ d’une amorce pour chaque brin d’ADN à synthétiser,
§ des quatre désoxyribonucléosides 5’-triphosphate (dATP, dTTP, dGTP, dCTP),
§ de conditions physico-chimiques correctes.
89 Année 2017 - 2018

Description d'un cycle de PCR
Dénaturation par chauffage à haute température permettant la séparation des deux

1
brins d'ADN.
Hybridation des oligonucléotides synthétiques qui serviront d'amorces pour la

polymérase. Cette étape est effectuée à température suffisamment basse pour que les
2
hybrides amorces/ADN soient stables mais suffisamment haute pour qu'il n'y ait pas
renaturation de l'ADN.
3 Extension : l'ADN polymérase synthétise les brins d'ADN complémentaires.
Le même cycle est répété entre 30 et 40 fois. L’ensemble de ces cycles est effectué dans un appareil
dont les variations rapides de température sont programmables au degré près. Après 3 cycles (a fortiori
après 40 cycles), le produit majoritairement formé est limité par les amorces qui restent disponibles.
D’après ce qui vient d’être exposé, il faut disposer d’une enzyme qui fonctionne au-dessus de la
température d’hybridation et qui soit stable à la température de dénaturation.
Une ADN polymérase, qui possède ces propriétés, a été isolée à partir de bactéries vivant dans
des sources d’eau très chaudes : elle est thermophile et thermostable. La bactérie est Thermophilus
aquaticus, l’enzyme est appelée la Taq polymérase.
1. Limites de la PCR
Il est nécessaire de connaître la séquence de la cible :
§ la taille de la séquence amplifiée ne peut pas être très grande (maxi 16 kpb),
§ le nombre de matrices présentes au départ ne doit pas être trop faible,
§ les contaminations constituent en pratique le problème majeur,
§ l’ADN polymérase de Taq manque de fidélité (pas d’activité exonucléase 3'-5’).
2. Applications médicales de la PCR

§ Diagnostic de pathologies dues à des génomes exogènes (bactériologie, virologie,
parasitologie) ;
§ Diagnostic rapide des infections pour lesquelles il fallait, il y a quelques années, plusieurs
semaines de culture (par exemple pour le bacille de la tuberculose) ;
§ Détection directe dans des milieux complexes, sans isolement préalable du germe.
§ Médecine légale, cancérologie, diagnostic prénatal voire préimplantatoire à la

fécondation in vitro.

3. La RT-PCR
La RT-PCR ou "reverse transcriptase"-PCR permet d’amplifier une séquence à partir d’un ARN.
Dans une première étape un ADN complémentaire (ADNc) de l’ARN est synthétisé grâce à une amorce
et à la transcriptase inverse. Ensuite cet ADNc est amplifié par une réaction classique de PCR. Cela
permet d’évaluer la quantité initiale d’ARN issue d’un gène.
4. Southern blotting
Cette méthode mise au point par E. Southern en 1975 permet de répondre à certaines questions
en biologie moléculaire. Par exemple, comment savoir si un virus (comme HIV) a intégré son génome
dans une cellule humaine. Comment savoir si un patient atteint d’une maladie génétique est par
exemple porteur d’une mutation, ou si un de ses gènes a subi un remaniement.
Par la méthode de Southern, une séquence particulière peut être détectée au sein d’un génome.
Pour cela, des fragments d’ADN sont séparés par électrophorèse en gel d’agarose, puis transférés sur
une membrane.
L’ADN à étudier est préalablement digéré par des enzymes de restriction choisies par
l’expérimentateur. Les fragments ainsi obtenus sont séparés par électrophorèse. Après
électrophorèse, les deux brins de l’ADN sont dissociés et l’ADN monocaténaire est alors transféré par
capillarité sur une membrane de nylon de la façon suivante : le liquide dans lequel est contenu l’ADN
au sein du gel est emporté par capillarité par le tampon de transfert. Ce liquide en traversant la
membrane entraîne la fixation de l’ADN sur cette dernière. Lorsque le transfert est terminé, l’ADN est
fixé de façon irréversible sur la membrane, par chauffage à 80°C ou par irradiation aux UV.
Le fragment d’ADN d’intérêt est détecté grâce à une sonde

d’acide nucléique marquée.
5. Northern blotting
Le « northern blotting » est une variante de la méthode développée par E. Southern appliquée
aux ARN. Elle permet de détecter des ARN particuliers parmi l’ensemble des ARN présents à un instant
donné dans une cellule. Le résultat obtenu reflète l’équilibre entre la synthèse et la dégradation des
ARN. En aucun cas, le « northern blotting » ne permet de connaître le taux de synthèse ni la demi-vie
d’un ARN. Les ARN ne sont pas digérés avant la migration. En revanche, ils sont dénaturés afin
d’éliminer les structures secondaires que l’ARN peut adopter in vivo mais aussi in vitro lorsqu’il est
placé dans un milieu dénué de toutes protéines ou agents chimiques. Après dénaturation et migration
en gel dénaturant, les ARN sont transférés sur une membrane de nylon et fixés irréversiblement. Les
ARN d’intérêts sont alors détectés à l’aide d’une sonde d’acide nucléique marquée qui peut être de
l’ADN simple brin ou un ARN anti-sens.
Le Northern Blotting permet de détecter des ARN.
91 Année 2017 - 2018


L’interférence par ARN ou RNAi

Rédigé à partir du cours du Pr SCHAEFFER et du Pr BESSEREAU
Ce cours est en général réalisé avant celui des matrices plus tard dans le semestre, et constitue un
addendum au chapitre sur les méthodes.
ÙÙ
Interférence par ARN ou "RNA interference" (RNAi). – Réponse cellulaire à la présence d’ARN
double brin conduisant généralement à la répression de l'expression génétique lors d’une étape
post-transcriptionnelle. Elle est à la base de techniques permettant d'inhiber la synthèse d'une
protéine donnée pour étudier ses fonctions dans la cellule ou chez l'animal.
I. Un peu d’histoire
La technique d’ARN interférence a été découverte dans le ver C. Elegans. Unc-22 est un gène de C.
elegans codant une grande protéine musculaire nécessaire à la locomotion.
§ Etape 1 : synthèse in vitro d'un fragment d'ARN du gène.
§ Etape 2 : injection dans la gonade de l'animal d'ARN sens, antisens ou double brin.
L’injection d’ARN sens ou antisens n’a aucun effet sur les vers. Au contraire, celle d’ARN double
brin donne une descendance paralysée, ce qui souligne l’importance de l’ARN double brin (ARNdb)
dans la RNAi. L’injection d’ARNdb semble donc permettre de cibler relativement spécifiquement
l’expression de la protéine pour laquelle il code.
II. Mécanismes
1. Un long ARNdb pénètre dans la cellule (infection virale,

transfection, transcription antisens…).
2. Il est découpé en petits ARN interférents (siRNA, Small
Interfering RNA) de 21 à 23 nucléotides.
3. Le brin guide est chargé dans le complexe RISC (RNA-Induced
Silencing Complex).
4. Le complexe RISC coupe les ARN messagers complémentaires
au brin qu’il contient.
Le même complexe RISC peut couper plusieurs copies de son ARN cible.
93 Année 2017 - 2018

Il est possible de faire un parallèle entre miRNA et siRNA. Les miRNA sont de courts ARN
simple brin repliés sur eux-mêmes propres aux eucaryotes et capables de répression
transcriptionnelle. Ils sont formés dans le noyau sous forme de précurseurs, clivés par le complexe
Drosha, transportés dans le cytosol via des exportines, puis clivés une seconde fois par le complexe
Dicer. Ils sont ensuite pris en charge par le complexe RISC. Deux voies de silencing sont alors possibles
selon la composition protéique du complexe : soit la dégradation de l’ARNm cible, soit la répression de
la traduction de ce dernier. Contrairement aux siRNA, qui sont complémentaires à l’ARNm cible sur
environ 21 bases, les miRNA sont imparfaitement complémentaires, sauf dans la région seed
(« graine ») des nucléotides 2 à 7.
Parallèle entre l’action des siRNA et celle des miRNA
Une des hypothèses probables quant au rôle de ce système est qu’il s’agirait d’un mécanisme
de défense contre l’introduction exogène d’ARNdb, ce qui survient notamment en cas d’infection
virale. Cela permettrait de se protéger contre l’introduction d’un génome étranger.
Les miRNA permettent donc une répression endogène de

l’expression de certains gènes. Les siRNA proviennent quant à
eux d’une source exogène.
III. Un outil extrêmement puissant pour inhiber

l’expression d’un gène cible
Contrairement à ce qu’il a été observé chez C. Elegans, l'exposition des cellules de mammifères à
de l'ARN double brin déclenche une réponse globale et une répression non spécifique de la
transcription. Il a en fait été découvert que les mammifères disposent d’un système de protection
supplémentaire détruisant les longs ARNdb en activant la voie interféron. La solution pour y remédier
a été d’introduire directement les siRNA, sans avoir besoin d’être clivés dans la cellule, ce qui permet
de contourner cette réponse non-spécifique. Cela permet de faire de l’ARN interférence en ciblant
l’expression de gènes de manière spécifique.

Il existe deux méthodes en RNAi : l’injection de siRNA synthétiques et les shRNA (Small Hairpin
RNA). Les shRNA sont obtenus par la transfection de plasmides ou de vecteurs viraux et sont ainsi
transcrits par les systèmes endogènes de la cellule. On peut moduler leur expression selon les
promoteurs utilisés dans le vecteur (obtention simultanée de plusieurs shRNA,
shRNApolycystroniques… voir schéma ci-dessous). Les siRNA synthétiques sont modifiés
chimiquement afin de gagner en stabilité.
siRNA synthétiques shRNA
Faciles à utiliser dans des cellules en culture Peuvent être utilisés in vivo
Très difficile à utiliser dans les modèles
animaux
Contrôle des doses utilisées Difficile de contrôler les doses produites
Dégradation dans la cellule plus ou moins Production dans la cellule : effet prolongé
rapide = effet limité dans le temps
La RNAi est donc une méthode puissante pour d’inhiber

partiellement ou totalement l’expression d’un gène.
Exemple de RNAi de COP I dans des cellules épithéliales. SNAP-23 est un contrôle. On remarque la baisse significative de la
protéine, ce qui montre bien un effet de l’injection de siRNA au niveau de l’expression protéique.
95 Année 2017 - 2018

Comme toute méthode, la RNAi possède des limites. Son efficacité peut varier en fonction des
gènes ciblés et de la technique, c’est pourquoi il faut contrôler les niveaux d'expression résiduelle. Il y
a également une possibilité d'effets non contrôlés sur des gènes non ciblés, ce qui nécessite de tester
plusieurs siRNAs ou shRNAs et de sauver le phénotype observé avec une version du gène ne contenant
pas la séquence ciblée par le RNAi.
Représentation schématique des différentes limites pouvant être rencontrées en RNAi
La RNAi reste une piste très prometteuse et de nombreux traitements se basant sur le silencing
de gènes sont envisagés, ciblant des maladies allant de la chorée de Huntington à la grippe.

Le cytosquelette
Le cytosquelette
I. Structuration du cytosol par des filaments constituants

le cytosquelette
Le cytosquelette a été mis en évidence par l’étude de cellules en culture après fixation et
coloration au bleu de Coomassie. Ce réseau est indispensable pour :
§ La détermination de la localisation des organites ;
§ Donner la forme à la cellule ;
§ Assurer une mobilité à la cellule selon une direction particulière.
§ Assurer une protection mécanique à la cellule.
Le cytosquelette comprend trois grandes catégories de filaments, qui diffèrent par leur diamètre,
la nature de leurs constituants protéiques, leur distribution dans le cytosol, leur stabilité et leur
fonction. Nous retrouvons :
§ Les filaments d’actine (en rouge sur le schéma) : ils s'accumulent sous la membrane de
la cellule. Ils donnent les microvillosités (qui bougent) et donnent la forme de la cellule.
§ Les microtubules (en vert sur le schéma) : structure radiante à partir du noyau (= rayon
d’une roue de vélo) qui parcoure toute la cellule. Les microtubules positionnent les
organites et les transportent.
§ Les filaments intermédiaires (en jaune sur le schéma) : ils traversent la cellule en tous
sens, relient les structures d’attachement des cellules et assurent une force mécanique.
Cytosquelette d'une cellule en culture.
L’amibe (cellule eucaryote) utilise les filaments d’actine pour se déplacer. Toutes les cellules
eucaryotes se déplacent de cette façon. La membrane fait des extensions dans le sens de déplacement.
Les filaments d’actine ont un sens de fonctionnement ; ils sont polarisés.
Exemple : Cellule intestinale. – Une partie de la cellule en direction de la lumière (pôle apical) de
l’intestin est chargé de manière opposée avec l’autre partie de la cellule (pôle basal).
97 Année 2017 - 2018

A. Filaments d’actine
ÙÙ
Filament d'actine ou microfilament. – Filament de protéine qui présente la forme apparente
d'une hélice formé par la polymérisation de molécules d'actine globulaire. Il est l'un des
constituants majeurs du cytosquelette de toutes les cellules des eucaryotes et fait partie de
l'appareil de contraction du muscle squelettique.
L’actine est le produit d’un à plusieurs gènes (6 chez l’être humain et jusqu’à 60 chez les plantes),
très conservés dans les différentes espèces animales et végétales. Il n’existe donc pas qu’une seule
actine, même si les séquences sont très similaires.
Les filaments d’actine sont composés de molécules d’actine polymérisées qui s’empilent les unes
sur les autres pour former une structure ressemblant à une hélice à deux brins, sans liaison covalente,
mais avec des liaisons faibles (liaisons hydrophobes, liaisons ioniques). C’est grâce à ces liaisons faibles
que les filaments d’actine peuvent facilement se désassembler.
Polymérisation de l'actine globulaire en filament.
L’actine monomérique est une protéine globulaire possédant la capacité de lier l’ATP.
L’assemblage des monomères d’actine en filaments forme une structure polarisée avec :
§ une extrémité + qui est la plus dynamique et au niveau de laquelle va se faire la
croissance des filaments d’actine ;
§ une extrémité - qui est moins dynamique.
Ces filaments d'actine sont des structures flexibles de 5 à 9 nm de diamètre organisées, soit :
§ linéairement, sous forme de faisceaux (les uns à côté des autres) ;
§ dans un plan, sous forme de réseaux (deux dimensions) ;
§ sous forme de gel (trois dimensions).
Faisceau de filaments d'actine Réseau de filaments d'actine
Son organisation est dépendante des protéines avec lesquelles elle est couplée. Dans une même
cellule, il peut y avoir plusieurs conformations différentes de l’actine. Ces protéines auxquelles les
filaments d’actine sont couplés, sont :

Le cytosquelette
§ la fascine qui rassemble les filaments d’actine en faisceaux serrées.

§ la filamine qui crée des ponts entre les filaments désorganisés (formation d’un réseau).
§ la spectrine : protéine filamenteuse se liant aux filaments d’actine et à d’autres protéines
permettant un ancrage du cytosquelette à la membrane plasmique.
Les filaments d’actine sont dispersés dans toute la cellule, mais la plupart sont concentrés sous
la membrane plasmique. Ils contrôlent la forme et le déplacement de la cellule.
Exemple Ù Globules rouges. – La forme des globules rouges, est aussi donnée par l’actine. Les
câbles de filaments intermédiaires sont fixés à des protéines transmembranaires, qui fixent les
cellules entre elles. Ces points où les filaments intermédiaires se rejoignent sont eux même liés
entre eux. Les filaments intermédiaires donnent la résistance mécanique à la cellule. Ces liaisons
entre filaments se font par des protéines spécifiques. C’est grâce à ça que l’hémoglobine arrive
à conserver sa structure, même après déformation. Le globule rouge est tapissé sur sa
membrane par les filaments d’actine. Quand elle passe dans un capillaire très fin, il faut qu’il y
ait modification de la forme du globule rouge.
Exemple Ù Cellules musculaires. – Lorsque les cellules musculaires se contractent, il y a une

liaison entre actine et filaments de myosine à l’aide d’une protéine liant les deux éléments. Sans
cette protéine, nous avons une myopathie de Duchenne. Dans les cellules musculaires, la
dystrophine est lié à la membrane (par l’intermédiaire d’une protéine transmembranaire) et à
l’actine ; lorsque la myosine remonte le long de l’actine grâce aux têtes de myosine, cela entraîne
la contraction de la cellule. La dystrophine est mutée dans le cas de la myopathie de Duchenne,
ce qui entraîne la non compaction du muscle.
Exemple Ù Plaquettes. – Les plaquettes sont capables de changer de conformation très

rapidement : pour le traitement d’une plaie, la cellule se fixe dessus et s’étale (à l’image d’une
rustine), pour cela elle va créer des filaments d’actine et changer de conformation. Une protéine
transmembranaire à un point d’ancrage fort dans la membrane, interagit avec le réseau d’actine
par des protéines (la filamine, protéine responsable de la conformation du réseau d’actine en
deux dimensions), ramène l’actine à l’endroit de la plaie. Quand la cellule arrive sur le caillot, la
protéine en question se fixe sur le caillot, la filamine se fixe avec la cellule, puis recrute l’actine
qui va s’aplatir l’actine et « boucher » la plaie.
B. Microtubules (MT)
Les microtubules sont les filaments les plus rigides de la cellule, avec un diamètre de 25 nm (2,5
fois plus gros que les filaments d’actine). Ils s’organisent en longs cylindres creux (ce qui les rend solides
et rigides) et sont composés de tubuline. Chaque microtubule est formé de 13 protofilaments que sont
des polymères linéaires de tubuline.
La sous-unité des microtubules est un hétérodimère composé de tubuline α et de tubuline β. La

tubuline α liant une molécule de GTP, et la tubuline β hydrolysant le GTP en GDP + phosphate
inorganique. Les hétérodimères se lient les uns aux autres pour former une structure linéaire polarisée
avec :
99 Année 2017 - 2018

§ une extrémité + où les microtubules s’allongent ou se raccourcissent par addition ou

perte de tubuline;
§ une extrémité - qui est moins dynamique.
Remarque. – Contrairement à l'actine, les microtubules ne se désassemblent pas totalement.
Assemblage de tubulines pour donner les filaments intermédiaires.
Il existe une troisième espèce de tubuline que l’on appelle la tubuline γ. Cette protéine sert au
démarrage de la polymérisation des microtubules.
Les microtubules sont issus d’une structure cellulaire que nous appelons le centrosome (= MTOC
: Centre Organisateur des MicroTubules) et ils se propagent dans toute la cellule. Le centrosome est
formé de deux centrioles perpendiculaires l’un à l’autre.
Deux centrioles perpendiculaires l'un à l'autre dans un chromosome.
Ces centrioles sont composés de tubulines γ (neuf triplets) mais elles ne forment pas de
microtubules, l’arrangement est différent. Chaque centriole est autant de centres de nucléation d’où
la polymérisation des microtubules peut commencer.
Ces microtubules servent au déplacement des organites au sein de la cellule. Ce transport est
permis par des protéines servant de moteur :
• la dynéine pour le transport rétrograde (du + vers le – des microtubules) ;

• la kinésine pour le transport antérograde (du – vers le +).
Ils servent également lors de la séparation des chromosomes au cours de la mitose/méiose

par création du fuseau mitotique.
ÙÙ
Centromère. – Constriction des chromosomes qui sépare le bras court (p) du bras long (q).
Centrosome. – Structure cellulaire qui est le point de départ des microtubules.

Le cytosquelette
Centriole. – Zone du centrosome formée de neuf groupes de trois microtubules. Il est couplé en
général avec un deuxième centriole qui lui est perpendiculaire. On constate, à proximité de ce
centriole, la zone péri-centriolaire qui est dense aux électrons. Cette zone est le lieu de début de
polymérisation d’un microtubule naissant. Dans un centrosome, il y a la plupart du temps des
centrioles, mais ce n’est pas toujours vrai !
C. Filaments intermédiaires : grande famille hétérogène de protéines

Les filaments intermédiaires sont constitués de protéines fibreuses. Ils ressemblent à une corde
ou un câble de 10 nm de diamètre, et forment des réseaux dans les cellules. La nature de ces protéines
dépend du type cellulaire :
§ la lamina : située juste à la face interne de la membrane du noyau, elle confère la forme
et la résistance au noyau.
§ les kératines dans les cellules épithéliales : il s'agit un tétramère formé à partir d’un
dimère acide (type 1) et d’un dimère basique (type 2) de kératine.
§ la vimentine dans les cellules mésenchymateuses,
§ les neurofilaments dans les neurones : ils sont spécifiques des neurones, ils s’associent
différemment. Ils forment l’axone, qui peut mesurer jusqu’à un mètre, donc doivent être
relativement solides.
§ la desmine dans les cellules musculaires,
§ la GFAP dans les cellules gliales.
Ces protéines sont hétérogènes mais s’assemblent de la même façon. Les protéines constituant
les filaments intermédiaires ont une structure allongée avec un domaine central organisé en hélice α
permettant l’association de deux monomères en dimère torsadé, puis de deux dimères en tétramère
de façon antiparallèle. Les tétramères s’associent en protofilaments. L’association de huit
protofilaments forme un filament intermédiaire. La disposition tête-bêche des tétramères fait que les
filaments intermédiaires ne sont pas polarisés.
Certains types de filaments intermédiaires s’étendent à travers le cytoplasme. Ils confèrent une
résistance mécanique à la cellule et répartissent les efforts mécaniques dans un épithélium, en
s’étirant à travers le cytoplasme d’une jonction à une autre jonction de la cellule.
Modèle de construction d'un filament intermédiaire.
101 Année 2017 - 2018

Fiche Résumé Cytosquelette

Type de filament Rôle Taille Polarisée Protéines couplées Composition
ACTINE Forme et 5-9nm Oui - Fascine, Actine globulaire (G) polymérisée en filaments (F).
déplacement de - Filamine,
la cellule. - Spectrine.
MICROTUBULE Déplacement des 25nm Oui - kinésine = Tubuline alpha.

organites, (transport Tubuline béta.
séparation des antérograde) Tubuline gamma (formant centrioles et centrosomes).
chromosomes - dynéine =
lors de la méïose. (transport
rétrograde)
FILAMENTS Résistance 10nm Non Deux monomères formant un dimère torsadé, puis deux
INTERMEDIAIRES mécanique à la dimères formant un tétramère antiparallèle. Les tétramères
différents types selon cellule, s’associent en protofilaments.
la cellule (lamina, répartissent les 9 protofilaments = 1 FI.
kératines, vimentine, efforts
neurofilament, mécaniques.
desmine, GFAP).

Maturation et transport des constituants de la cellule

Rédigé à partir du cours du Pr BESSEREAU
I. Compartimentation des cellules eucaryotes

A. Introduction
La microscopie électronique (ME) permet de voir des entités de moins de 2 µm. Nous avons
beaucoup de membranes dans une cellule et leurs fonctions est de délimiter des compartiments.
**Noyau. – Contient le génome et est le principal site de synthèse de l'ADN et de l'ARN.
**Cytoplasme. – Contient le cytosol et les organites cytoplasmiques en suspension. Le cytosol

aurait la consistance d'un gel.
ÙÙ
Cytosquelette. – Système de filaments qui donne sa forme à la cellule et lui confère la capacité
de diriger ses mouvements. Cf. chapitre 5 pour plus de précisions.
ÙÙ
Mitochondrie. – Organite, de la taille d’une bactérie environ, qui exécute les phosphorylations
oxydatives et produit la plupart de l’ATP dans les cellules eucaryotes.
ÙÙ
Réticulum endoplasmique (RE). – Compartiment labyrinthique entouré d’une membrane, dans
le cytoplasme des cellules des eucaryotes, où sont synthétisés les lipides et où sont fabriquées les
protéines associées aux membranes, ainsi que celles qui seront sécrétées ou envoyées dans les
lysosomes. On distingue le RE lisse, dépourvu de ribosomes et le RE granulaire auquel sont associés
des ribosomes.
ÙÙ
Appareil de Golgi. – Organite des cellules eucaryotes dans lequel les protéines et les lipides, en
provenance du réticulum endoplasmique, sont modifiés et triés. Il est le site de synthèse de
nombreux polysaccharides de la paroi de la cellule des plantes et des glycosaminoglycanes de la
matrice extracellulaire des cellules animales.
ÙÙ
Lysosome. – Organite des cellules eucaryotes qui contient des enzymes de digestion dont
l’activité est maximum au pH acide caractéristique de la lumière du lysosome.
ÙÙ
Peroxysome. – Petit organite qui utilise l’oxygène moléculaire pour oxyder les molécules
organiques. Il contient certaines des enzymes qui produisent et d’autres qui dégradent le peroxyde
d’hydrogène (H2O2).
ÙÙ
Endosome. – Organite des cellules animales qui transporte du matériel nouvellement ingéré par
endocytose, puis passe la plupart de ce matériel aux lysosomes où il sera dégradé.
ÙÙ
Endocytose. – processus général par lequel du matériel est capturé par la cellule au moyen d’une
invagination de la membrane plasmique et de la formation d’une vésicule entourée d’une
membrane.
ÙÙ
Exocytose. – processus général par lequel les molécules sont sécrétées par la cellule eucaryote.
Ces molécules sont empaquetées dans des vésicules entourées d’une membrane qui fusionne avec
la membrane plasmique, ce qui permet la libération du contenu à l’extérieur de la cellule.
103 Année 2017 - 2018

Principaux compartiments à l'intérieur d'une cellule eucaryote.
Ces organites sont entourés par une membrane chez tous les eucaryotes. Le cytosol correspond
à environ 50 % du volume de la cellule, et les organites représentent les 50 % restants.
Les organites comme le réticulum endoplasmique permettent d’augmenter la surface de la membrane.

Il représente 50 % de la surface membranaire contre seulement 15 % du volume de la cellule, car c’est
un organite très replié. Les mitochondries constituent 20 % de la surface membranaire. La membrane
plasmique ne représente que 2 % des membranes de la cellule.
B. Origines possibles de ces organites

Théorie de l’endosymbiose : nous sommes partis d’une cellule primitive eucaryote avec assez peu
de membrane. Progressivement, il y a eu une invagination de la membrane pour faire apparaître le
noyau avec une double membrane. Une sorte de parasite a été phagocyté puis une membrane dérivée
de la cellule eucaryote entoure le parasite phagocyté : ceci permettant de donner naissance aux
mitochondries. Tout cela a donné naissance à une cellule aérobie.
Passage d'une cellule anaérobie à une cellule aérobie.

C. Comment reconnaître la route suivie par les protéines

§ Technique du « Pulse-Chase » : utilisation de la radioactivité incorporée dans la protéine
pour pouvoir la suivre. Pour rendre radioactives les protéines de la cellule, nous utilisons
des acides aminés radioactifs incorporés dans la cellule pendant un temps court. Une fois
les acides aminés radioactifs incorporés dans la protéine, nous pouvons révéler sa
position. Puis, dans un deuxième temps, nous lavons pour éliminer les acides aminés
radioactifs. Une fois ces étapes effectuées, nous pouvons ainsi suivre le trajet de la cellule
depuis sa synthèse jusqu'à son élimination.
Ce sont des images successives de différentes cellules mortes

car nous avons dû fixer la cellule pour obtenir l’image.
Marquage court suivi d'une chasse (3, 20 et 90 min) et d'une autoradiographie (cellule du pancréas exocrine).
Cette méthode était utilisée auparavant, maintenant nous utilisons le génie génétique pour
pouvoir suivre la protéine en temps réel.
§ Technique du génie génétique : la GPF est une petite étiquette qui est une courte
séquence de quelques acides aminés, fusionnée en N-terminal ou en C-terminal de la
protéine d’intérêt (rarement à l’intérieur de la protéine). Nous formons un ADNc avec la
séquence de ces deux protéines, qui sera transcrit puis traduit. La protéine ainsi formée
se comportera comme la protéine endogène. La fluorescence de la protéine chimère
pourra être suivie par vidéo-microscopie sur des cellules vivantes.
Attention. – Dans certains cas, la GFP altère la fonction de la protéine et la protéine se retrouve
dans le compartiment de dégradation et les profils de fluorescence n’auront alors plus de sens.
D. Deux routes divergentes

La traduction des protéines s’effectue grâce aux ribosomes qui sont :
§ soit libres dans le cytoplasme,
§ soit dans la membrane du réticulum endoplasmique.
105 Année 2017 - 2018

Nous retrouvons ainsi deux voies de synthèse des protéines.
1. Via le cytosol
Ces protéines sont produites par les ribosomes libres et peuvent rester dans le cytosol ou aller
dans les mitochondries, le noyau (par les pores nucléaires) ou les peroxysomes.
2. Via le réticulum endoplasmique

Ces protéines sont produites par les ribosomes du réticulum endoplasmique. Elles peuvent rester
dans le RE ou être envoyées vers le Golgi. Une fois dans le Golgi elles peuvent soit y rester, soit aller
vers les lysosomes ou encore dans des vésicules de sécrétion puis à la surface de la cellule.
E. Trois façons différentes d’aller d’un compartiment à l’autre

Nous distinguons trois modalités de transport intracellulaire des protéines :
§ le transport via les pores entre le cytosol et le noyau ;
§ le transport par des vésicules : ceci concerne tous les transports entre RE et appareil de
Golgi, lysosome, vésicules de sécrétion, membrane plasmique ;
§ le transport à travers la membrane, dans les cas d’adressage vers le RE, les
mitochondries ou les peroxysomes.
Les trois voies du transport intracellulaire.

F. Ce qui détermine le destin d’une protéine

Les protéines destinées à un compartiment ou un organite particulier possèdent dans leur
séquence un peptide signal. Nous avons :
§ soit une séquence de signalisation en région N-terminale de la protéine ;
§ soit plusieurs séquences distribuées sur toute la protéine qui - lorsque la protéine est
repliée dans sa structure finale - forment un domaine de signalisation.
Deux façons de construire un(e) séquence/domaine de signalisation.
II. Le compartiment cytosolique

A. Modifications des protéines dans le cytosol, réversibles ou non
La conformation tridimensionnelle des protéines est cruciale pour qu’elles puissent exercer leurs
fonctions. Le repliement des protéines s’effectue pendant et après leur synthèse. À cela s’ajoute
différentes modifications co- et post-traductionnelles et des associations avec d’autres protéines.
Principales étapes de la création d'une protéine fonctionnelle.
La chaîne polypeptidique naissante n’est pas fonctionnelle. Elle doit se replier pour le devenir.
Dans un premier temps, elle se replie et se lie à un cofacteur grâce à des interactions non covalentes.
Ensuite, elle subit des modifications covalentes comme la glycosylation, l’acétylation ou la
phosphorylation (une des plus importantes modifications covalentes).
107 Année 2017 - 2018

Modification covalente réversible Modification covalente irréversible

Modification covalente qui permet d’attacher
§ Phosphorylation de la fonction OH des
la protéine à la face interne de la membrane
sérine/thréonine ou tyrosine par une
plasmique par un acide gras (AG) ou par un
protéine kinase (active / inhibe la protéine).
groupement prényle :
§ Déphosphorylation de la fonction OH des § myristoylation : liaison amide en N-term.
sérine/thréonine ou tyrosine par des § palmitoylation : liaison thioester.
protéines phosphatases.
§ farnesylation : groupement prényle.
Pour finir, la protéine se lie à d’autres sous-unités. Toutes ces étapes permettent d’arriver à une
protéine fonctionnelle mature avec une structure quaternaire.
Attention. – Une protéine phosphorylée n'est pas forcément activée.
B. Attachement à la membrane de certaines protéines du cytosol

Elles peuvent s’attacher à la face interne de la membrane, par exemple à l’aide d’une chaîne d’acide
gras ou un groupement phényl.
C. Adoption d'une conformation par les protéines en cours de synthèse

Au fur et à mesure que le ribosome progresse le long de l’ARN, nous avons un repliement du
domaine N-terminal, puis du domaine C-terminal. Nous arrivons ensuite à un état de repliement final
dans lequel la protéine sera fonctionnelle.
D. Rôle des protéines chaperons dans la conformation des protéines

ÙÙ
Protéine chaperon. – Protéine qui aide d’autres protéines pour leur éviter une mauvaise
conformation qui entraînerait la formation de polypeptides inactifs ou agrégés.
Vue actuelle de la voie de repliement des protéines.
Chacun des compartiments cellulaires contient des protéines chaperons. Lors de la synthèse de
la protéine, nous pouvons avoir des erreurs de repliement qui aboutissent à des mauvaises protéines.
Les protéines chaperons reconnaissent la structure anormale et vont la remettre dans son état normal
pour aboutir à la protéine correcte. Les protéines chaperons encadrent donc les protéines pour être
sûr qu’elles restent dans la bonne voie.

Si, malgré l’intervention des protéines chaperons, nous aboutissons à un mauvais repliement des
protéines, alors elles seront détruites par le protéasome (usine de destruction des protéines de la
cellule). Il existe deux grandes familles des protéines chaperons.
1. Familles des chaperons de type hsp70 et hsp40 associés

Ce sont des protéines de choc thermique (« heat schock proteins ») composées d’acides aminés
hydrophobes. Une protéine mal repliée expose à sa surface des acides aminés hydrophobes, qui en
temps normal devrait être cachés : cela la rend insoluble. Les protéines chaperons sont donc capables
de détecter cette protéine insoluble en reconnaissant les AA hydrophobes à sa surface. Il y a une
interaction directe entre ces deux protéines. Le fait de cacher les AA hydrophobe permet à la protéine
chaperonnée de se replier correctement, grâce à l’ATP.
Remarque. – Les protéines insolubles donnent des agrégats protéiques dangereux et toxiques.
La famille hsp70 de chaperon moléculaire fonctionnant en association avec hsp40.
2. Familles des chaperons de type hsp60

Il s'agit d'un complexe capable de créer un environnement particulier autour de la protéine qui
facilitera le repliement de la protéine. Le haut de la protéine hsp60 interagit avec les bouts
hydrophobes de l’AA, hsp60 entoure la protéine la plaçant dans l’environnement le plus propice, puis
vient un chapeau (GroES), qui reste 15 secondes, enfin la protéine est remise dans une bonne
conformation, et libérée.
Structure et fonction d'un chaperon moléculaire de type hsp60.
109 Année 2017 - 2018

E. Protéolyse sélective par les protéasomes, dépendante d’une étiquette

ÙÙ
Protéasome. – Grand complexe constitué de protéines, situé dans le cytosol (et dans le noyau),
qui possède une activité de protéolyse responsable de la dégradation des protéines qui ont été
marquées par l’ubiquitine ou selon d’autres modalités.
Nous distinguons quatre cas après la synthèse de la protéine :

§ normal : la protéine a un bon repliement ;
§ remise dans le droit chemin par le chaperon si mauvais repliement de la protéine ;
§ mauvais repliement : si elle n’est pas prise en charge par le chaperon, la protéine est
envoyée vers le protéasome pour être détruite et ensuite réutilisée ;
§ dans certains cas pathologiques, si la forme de la protéine empêche sa destruction par
le protéasome, alors nous aboutissons à des pathologies assez graves (exemple : maladie
d'Alzheimer).
F. Deux façons d’induire la dégradation spécifique d’une protéine

La destruction par la voie ubiquitine-protéasome permet d’éliminer les protéines incorrectement
repliées mais permet également de réguler la concentration en protéines dans la cellule :
§ par activation d'une nouvelle ligase de l'ubiquitine ;
§ par création d’un signal de dégradation de protéines (phosphorylation / démasquage).
G. Différentes sortes d’ubiquitinylation pour des rôles différents de

l’ubiquitine
Les mono-ubiquitinylations sont souvent des modifications régulatrices des histones. Les multi-
ubiquitinylations vont favoriser l’endocytose. Selon le résidu poly-ubiquitinylé, la protéine sera
dégradée par le protéasome ou bien pourra stimuler son activité vis-à-vis de la réparation de l’ADN.
Pathologie : Maladie de Parkinson. – La mutation de PARKIN (une E3-ligase) est responsable de

formes génétiques de la maladie de Parkinson par agrégats dans les neurones.
H. Résistance aux protéases de certaines protéines de conformation

anormale
Il y a agrégation des protéines qui résistent aux protéases par un changement de conformation.
Exemple : maladie d’Alzheimer, Huntington ou encore Creutzfeldt-Jacob)
III. Le transport cytoplasme – noyau

A. Transport à travers les pores du noyau
1. Perforation de la double membrane par les pores du noyau
Le noyau est limité par l’enveloppe nucléaire, qui est composé d’une membrane externe en
continuité avec la membrane du RE, et une membrane interne du côté du nucléoplasme. Les
membranes externes et internes sont en continuité et se rejoignent au niveau des pores nucléaires.

Les pores nucléaires (3 000 à 4 000 par noyau soit 10 pores/µm2) sont un assemblage de protéines
traversant l’enveloppe nucléaire : le transport entre le cytosol et le noyau se fait entre les pores
nucléaires.
Enveloppe du noyau.
Dans le noyau, nous retrouvons une importation de 106 molécules d’histone toutes les 3 minutes
soit 100/pores/min dans une cellule en phase S et jusqu’à 500 macromolécules par seconde dans un
sens comme dans l’autre.
Lorsque le pore est fermé, il possède un diamètre de 9 nm ce qui autorise la libre diffusion des
petites molécules si leurs poids moléculaire est < 5000 Da (voire jusqu’à 30 000 Da).
§ Structure des pores nucléaires
Les complexes du pore nucléaire sont constitués de plus de 50 protéines différentes : des
nucléoporines principalement, associées aux protéines des fibrilles qui sont vers le cytoplasme. Les
nucléoporines et protéines des fibrilles contiennent des répétitions FG (phénylalanine – glycine).
Ces répétitions ont un rôle très important pour le transport actif des protéines. En effet, elles
permettent le déplacement des importines dans les pores nucléaires. L’importine aura passé le pore
nucléaire en se fixant sur ces répétitions FG.
Organisation des complexes du pore dans l'enveloppe du noyau.
111 Année 2017 - 2018

2. Transport par diffusion et transport actif à travers les pores

Les protéines destinées à résider dans le noyau possèdent un signal de localisation nucléaire(NLS).
Ce signal est une courte séquence d’AA (5 à 6 AA), codée par un virus SV-40, et est suffisant pour le
transport intranucléaire. Si nous mutons un seul AA de cette séquence, nous modifions ce signal.
La séquence étant reconnue par des récepteurs au niveau du noyau, il y a nécessité de présence
de récepteurs d’importation nucléaire (importine). L’importine permet le transport de la protéine
portant le signal NLS du cytosol vers le noyau.
Il existe plusieurs récepteurs capables de reconnaître le NLS, et différents types de NLS.

L’interaction entre des répétitions FG des nucléoporines et les importines permettent à celle-ci de
traverser les complexes des pores nucléaires. L'interaction entre l’importine et la protéine transportée
(que l’on appelle aussi cargo) peut être directe ou indirecte.
Différentes sortes de récepteurs de protéines à importer dans le noyau.
Ce transport actif et unidirectionnel des protéines entre le cytosol et le noyau est assuré en
grande partie par la petite GTPase Ran. Il n’y a pas de moteur nucléaire. C’est la répartition
asymétrique de Ran-GDP (cytosol) et Ran-GTP (noyau), qui est responsable de la force motrice.
Il existe deux formes de la Ran :

§ Ran-GDP présente dans le cytosol ;
§ Ran-GTP présente dans le noyau. (C’est la forme active car elle est capable de se lier à
l’importine ou à l’exportine.)
La phosphorylation est portée par le GTP. Donc la phosphorylation ou la déphosphorylation du

GTP va changer la conformation de la protéine et son activité.
Localisation de Ran-GTP dans le noyau et de Ran-GDP dans le cytosol.

Ran-GEF est un facteur d’échange de la guanine qui est situé dans le noyau puisqu’elle interagit
avec la chromatine. Elle permet d’échanger du GDP contre du GTP, et donc de rendre / maintenir Ran
actif.
Ran-GAP permet l’inactivation de Ran car elle permet d’échanger du GTP contre du GDP. Ran ne
peut plus se fixer à l’importine ou l’exportine.
Modalité de transport : l’importine se fixe à la protéine dotée d’un NLS, le complexe interagit
avec les pores (grâce aux répétitions FG), passe dans le noyau. Puis le Ran-GTP, après fixation à
l’importine, dissocie le complexe importine/protéine (règle du « soit l’un, soit l’autre »). Une fois la
protéine déchargée, la Ran-GTP reste liée à l’importine, ils ressortent du noyau. Une fois dans le
cytosol, il y a hydrolyse du GTP en GDP et donc dissociation du complexe. L’importine est alors prête à
être réutilisée.
Rôle de Ran-GTP/Ran-GDP dans l'importation des protéines entre le cytosol et le noyau.
3. Le trafic dans l’autre sens (sortie de la protéine hors du noyau)

Nous utilisons non plus une importine mais une exportine. Le principe est le même sauf que
l’exportine liée au Ran-GTP fixe la protéine, tandis que l’exportine non liée au Ran-GDP se débarrasse
de la protéine. L’importine et l’exportine sont des caryophérines.
1. Signaux d’exportation (NES au lieu du NLS) et récepteurs de protéines à exporter
Rôle Ran-GTP/Ran-GDP dans le transport des protéines entre noyau et cytosol pour l'importation et l'exportation.
113 Année 2017 - 2018

4. Régulation de ce transport : exemple de NF-AT

NF-AT qui est un facteur de transcription qui active l’expression de gènes quand les lymphocytes
doivent s’activer pour participer à la réponse immunitaire.
Lymphocyte T. – Type de lymphocyte responsable de la réponse immunitaire adaptative.
À l’état de base, le NF-AT est phosphorylé. Nous retrouvons une entrée de Ca2+ qui active la
calcineurine : elle enlève les groupements phosphates à ce FT ce qui va l'activer. Il interagit avec les
importines, rentre dans le noyau et y agit.
Pour revenir à l’état basal, nous avons un arrêt de production importante de Ca2+, perte de la
calcineurine et phosphorylation de la protéine qui découvre le signal NES, la protéine sort donc du
noyau.
Cyclosporine A et FK506. – Ce sont des inhibiteurs de l’action de la calcineurine. Ce sont des agents
qui sont prescrits après une greffe afin d’éviter son rejet par des lymphocytes.
Contrôle du transport de NF-AT entre le cytoplasme et le noyau au cours de l'activation des cellules T.
ÙÙ
Ionophore. – Petite molécule hydrophobe qui se dissout dans les bicouches lipidiques et qui
augmente la perméabilité de ces dernières à des ions inorganiques spécifiques.
IV. Le transport à partir du réticulum endoplasmique (RE)
A. RE endoplasmique granulaire et RE lisse

Le REG est le lieu de synthèse des protéines sécrétées ou membranaires, grâce aux ribosomes
associées à la membrane du REG. Le REL est le lieu de synthèse de lipides et de molécules hydrophobes
comme le cholestérol, que l’on trouve fréquemment dans le site de production des hormones
stéroïdiennes. Il est aussi est le lieu de détoxification des molécules liposolubles.
Le RE se présente comme un réseau qui prend beaucoup de place dans la cellule. Il est associé
aux microtubules (eux même associés à des moteurs moléculaires – dynéine et kinésine – qui
permettent les mouvements du RE).

B. RE lisse dépourvu de ribosomes et abondant dans certaines c.

Le REL (ou réticulum sarcoplasmique) est un lieu de séquestration du Ca2+ donc important dans
la communication cellulaire. Il est visualisable en microscopie électronique.
C. Séparation possible du RE lisse et RE granulaire

Nous pouvons séparer les composants du RE par ultracentrifugation. Nous allons donc casser une
cellule, ce qui va fragmenter nos composants en microsomes.
ÙÙ
Microsomes. – Petites vésicules d'environ 100 nm de diamètre produites par la dislocation du
RE lors du fractionnement cellulaire. Ils peuvent se présenter sous deux formes :
§ les microsomes granulaires sont des vésicules provenant du REG et peuvent être purifiés.
§ les microsomes lisses ont la même densité que d'autres vésicules qui ne proviennent pas
du REL (vésicule de sécrétion, mitochondrie) et sont hétérogènes. Les microsomes lisses
sont constitués d'un mélange de vésicules d'origines différentes.
D. Transport des protéines à travers la membrane du RE granulaire

La majorité des membranes lipidiques (cellulaires, des organites) sont synthétisées par des lipides
provenant du RE. Les lipides constituent 50 % de la masse totale d’une cellule animale. Nous estimons
à un milliard le nombre de lipides dans une cellule animale.
1. La membrane du RE est une barrière hydrophobe

Les lipides des membranes, comme celle du RE, sont amphiphiles. Ils possèdent une partie
hydrophobe et une partie hydrophile. En milieu aqueux, ceux-ci s’organisent spontanément en
bicouche, où l’eau est exclue de leurs portions hydrophobes. Les interactions impliquées dans cette
organisation sont de type hydrophobe.
2. Les protéines membranaires interagissent avec la partie hydrophobe des

membranes
§ Différentes associations possibles d’une protéine à la membrane
Les protéines membranaires s’associent à la bicouche lipidique de différentes manières :

- protéines à un ou plusieurs passages transmembranaires (souvent des hélices α
riches en résidus hydrophobes, des feuillets β) (1, 2 et 3) ;
- protéines à hélice α qui interagit avec un seul feuillet de la membrane (4) ;
- protéines possédant un ancrage lipidique au feuillet cytosolique de la membrane
(5) ou au feuillet extracellulaire de la membrane à l’aide d’une ancre GPI (6) ;
- protéines associées à des protéines membranaires (7 et 8).
Différentes associations des protéines avec la membrane.
115 Année 2017 - 2018

§ Prédiction de ces séquences par étude de la répartition des acides aminés
L’analyse de l’index d’hydropathie d’une séquence protéique (caractère hydrophile ou

hydrophobe de la chaîne latérale d’un AA) permet d’identifier les domaines compatibles avec la
formation d’une hélice hydrophobe et de prédire le ou les passages transmembranaires potentiels.
Index d'hydropathie pour localiser les hélices α potentielles des segments TM d'une chaine polypeptidique.
§ Solubilisation des protéines membranaires par utilisation de détergents
Les protéines membranaires sont très souvent phosphorylées. Des sucres sont accrochés aux
membranes externes. Les protéines sur lesquelles il y a un sucre sont placées à l’extérieur de la cellule.
Ces modifications apportées à la protéine lui confèrent une solubilisation plus importante.
Les détergents peuvent former des micelles.
Solubilisation des membranes avec un détergent doux.

3. Mécanismes du transport des protéines à travers la membrane du RE
§ Preuves du passage dans la lumière du RE
Expérience : nous modifions l’ARNm d’une protéine sécrétée afin qu’elle soit marquée. Le RE est
ensuite homogénéisé et fractionné pour former des microsomes, composés donc du cytoplasme du
REG. Ceux-ci sont récupérés et traités ou non par détergents pour ouvrir le microsome, puis par la
protéase. Si les protéines détectées sont résistantes à la protéase et marquées, alors ce sera une
preuve que les protéines sont bien localisées dans le RE juste après leur synthèse, signifiant le passage
d’un ARNm cytoplasmique à une protéine présente dans le RE.
Quand le microsome n’a pas été traité par le détergent, on retrouve sur une immunoprécipitation une
seule marque, alors qu’avec détergent on en retrouve plusieurs. Ainsi ces résultats montrent que le
détergent rend accessible les protéines aux protéases, alors que sans le détergent (donc lorsque le
microsome reste fermé) les protéines ne sont pas accessibles. Conclusion : les protéines sécrétées sont
dans le microsome et donc dans le RE après leur synthèse.
Démonstration expérimentale de la localisation des protéines destinées à être sécrétées juste après leur synthèse.
§ L’hypothèse d’un peptide de signalisation
Ce signal est porté par la protéine destinée à être envoyée vers le RE. En présence de microsomes,
les protéines sont plus courtes, ce qui va dans le sens de la présence d’un peptide signal clivé lors de
la translocation de la protéine à travers la membrane. On peut encore le confirmer via la seconde
expérience : les protéines déjà traduites avec le peptide de signalisation ne peuvent pénétrer dans le
microsome, ce qui montre la nécessité d’une translocation contemporaine à la traduction afin d’avoir
un clivage du peptide signal.
117 Année 2017 - 2018

Les protéines sécrétées contiennent un peptide signal, coupé pendant la traduction au niveau du microsome.
§ Nature du peptide de signalisation
Peptides de signalisation de trois protéines de cellules eucaryotes.
Le peptide de signalisation est le plus souvent constitué par un peptide hydrophobe non chargé
en position N-terminale sur la protéine (15-20 AA), et est capable d’interagir avec d’autres AA.
§ Nécessité d’une particule de reconnaissance du peptide de signalisation
Cette séquence est reconnue par une particule de reconnaissance du peptide signal (= SRP pour
Signal Recognition Particle). La SRP est une ribonucléoprotéine (ARN 7SL + 6 protéines), qui se lie au
peptide signal de la chaîne polypeptidique en cours d’élongation.
Interaction de la SRP avec le ribosome.
§ Nécessité d’un récepteur de la SRP et du translocon dans la membrane
L'interaction entre la SRP et le peptide signal induit une pause dans la traduction et permet
l’arrimage du ribosome à la membrane du RE à l’aide la SRP et de son récepteur. Ceci permet le
positionnement de la chaîne peptidique à proximité d’un canal de translocation (= le translocon) de la
membrane du RE. Le canal protéique du ribosome s’aligne alors sur le translocon, qui reconnaît le
peptide signal et s’ouvre. Cela permet l’internalisation de la chaîne polypeptidique dans la lumière du
RE au fur et à mesure de sa synthèse. La SRP se détache ensuite dans le cytosol et peut être recyclée,
tout comme son récepteur membranaire après utilisation.

Translocation à travers la mb. de la protéine en cours de synthèse grâce à un récepteur de la SRP et au translocon.
§ Structure et rôle du translocon dans la membrane du RE
Il existe deux sites dans le translocon :

- un site fixant le peptide signal ;
- un site fixant le ribosome.
Lorsqu’il y a interaction avec le ribosome, le translocon change de conformation et le bouchon présent

au niveau du canal se déplace, remplacé par la protéine en cours de synthèse.
Attention. – Le translocon est uniquement présent au niveau de la membrane du RE.
Structure du complexe Sec61.
§ Association du ribosome et du translocon
Association du ribosome et du translocon.
119 Année 2017 - 2018

§ Translocation des protéines à travers la membrane du RE
Les protéines solubles sont libérées dans la lumière du RE par clivage du peptide signal par une
peptidase. Le peptide signal reste alors associé à la membrane du RE. L’enzyme responsable est
associée au feuillet interne (= exoplasmique) de la membrane (= peptidase). Le peptide signal possède
une double fonction :
- reconnaissance du translocon ;
- signal d’initiation de transfert de la chaîne polypeptidique du cytosol vers la
lumière du RE.
Modèle de translocation d'une protéine soluble à travers la membrane du RE.
§ Redistribution éventuelle des ribosomes en fin de traduction des ARNm
Redistribution éventuelle des ribosomes en fin de traduction des ARNm.
4. Les protéines membranaires

Les protéines membranaires peuvent être ancrées à la membrane par un ou plusieurs passages
transmembranaires.
Différentes topologies possibles des protéines transmembranaires synthétisées sur les membranes du REG.

§ Peptides de départ et d’arrêt du transfert à travers la membrane
Nous avons besoin de peptides signaux et de peptides d’arrêt du transfert à travers la membrane.
De la position et du nombre des séquences hydrophobes dépendent l’orientation et le nombre de
segments de la protéine à travers la membrane.
- C-terminal dans le cytosol et N-terminal dans la lumière du RE
Protéine à un passage transmembranaire avec le N-terminal dans la lumière du RE.
La protéine possède un peptide signal en N-terminal et un peptide d’arrêt au milieu de la chaîne

polypeptidique. La translocation s’arrête au niveau du peptide d’arrêt. La protéine résultante est une
protéine à un passage transmembranaire et dont l'extrémité C-terminale est cytosolique. Une
peptidase vient cliver le peptide signal, pour libérer l'extrémité N-terminale dans la lumière du RE.
- N-terminal dans le cytosol et C-terminal dans la lumière du RE
L'utilisation d'une séquence signal interne permet d'orienter l'extrémité N-terminale vers le compartiment cytosolique.
Mais l'orientation de la séquence signal dépend des acides aminés chargés qui entourent le cœur hydrophobe.
121 Année 2017 - 2018

Le peptide signal est situé à l’intérieur de la chaîne polypeptidique. Le ribosome commence à

traduire la protéine dans le cytosol, mais lorsqu'il atteint le peptide signal, il y a arrêt de la
traduction. Le ribosome interagit physiquement avec le translocon à l’aide du SRP et son récepteur.
La chaîne polypeptidique reprend sa traduction dans la lumière du RE. L’orientation des différentes
parties dépend des AA chargés adjacents au cœur hydrophobe. Le côté (C-term ou N-term) où ces AA
sont chargés + se retrouve dans le cytosol.
Attention. – Il n'y a pas de coupure du peptide signal.
§ Protéines à plusieurs segments transmembranaires
Certaines protéines possèdent plusieurs passages transmembranaires : elles possèdent un ou

plusieurs signaux d’initiation de transfert interne en alternance avec un ou plusieurs signaux d’arrêt
de transfert, dont le nombre total conditionne le nombre de passages transmembranaires. Les signaux
d’initiation de transfert et d’arrêt de transfert sont riches en résidus hydrophobes et s’organisent le
plus souvent en hélice α transmembranaire.
Protéine à deux PTM avec le N et le C-term dans le cytosol grâce à un peptide de signalisation de départ interne.
§ Déduction des modalités d’insertion des protéines à partir de leur séquence
Nous utilisons les profils d’hydropathie pour savoir si une séquence est transmembranaire, dans
le cytosol, ou encore dans le RE. Mais ne nous permet pas de dire comment les domaines seront
orientés.
Déduction des modalités d'insertion de la rhodopsine à partir de sa séquence.

E. Ce qui se passe dans la lumière du RE

1. Obtention de la bonne conformation des protéines dans le RE
Nous avons interaction avec les protéines chaperons qui aident à la conformation, plutôt les hsp70
(ex : la protéine Bip). Nous avons aussi formation de ponts disulfures entre deux cystéines.
L’environnement d'oxydoréduction est différent dans le cytoplasme (milieu réducteur), ils vont rester
alors sous forme SH, et dans le RE (milieu oxydant), cela oxyde les groupements SH et entraîne la
formation de ponts disulfures, stabilise la structure de la protéine. Les ponts disulfures sont
catalysés par des enzymes PDI. Il y a aussi assemblage des protéines en oligomères.
Le milieu cytosolique est réducteur. L'intérieur du RE et des compartiments de sécrétion est oxydant.
2. N-glycosylation
Certaines protéines transloquées dans le RE ont pour destinée d’y rester. Elles possèdent alors
un signal de rétention dans le RE : la séquence KDEL en C-terminal. Une fois dans la lumière du RE, les
protéines peuvent subir un certain nombre de modifications post-traductionnelles (la plupart des
protéines produites au niveau du RE sont glycosylées).
Une des plus importantes est la N-glycosylation (une modification co-traductionelle), c’est-à-dire
la greffe d’une chaîne oligosaccharidique de 14 résidus glucidiques sur la chaîne latérale d’une
asparagine, si celle-ci se trouve dans une séquence Asn-X-Ser ou Asn-X-Thr (avec X n’importe quel AA
sauf la proline). La chaîne oligosaccharidique (composée de résidu N-acétylglucosamine, mannose et
glucose) est déplacée en un bloc d’une molécule de dolichol-pyrophosphate membranaire vers la
protéine cible par une oligosaccharide-transférase.
N-glycosylation par liaison du précurseur oligosaccharidique à une asparagine.
123 Année 2017 - 2018

La chaîne oligosaccharidique est également un marqueur de l’état de repliement de la protéine.

Il y a trois résidus de glucose qui sont progressivement enlevés. Une glucosidase clive les 2 premiers
glucoses, ce qui permet la reconnaissance de la protéine par une protéine chaperon (calnexine ou
calréticuline ; donne le temps de se replier). Le troisième et dernier glucose est éliminé par une
glucosidase, pour permettre à la glucosyl-transférase d’intervenir et d’analyser la conformation de la
protéine. Si cette dernière est correctement repliée, elle sort du RE. Au contraire, si elle est
incomplètement repliée (= exposition de résidus hydrophobes), la glycosyl-tranférase remet un
glucose au bout de ce bloc de sucre et la protéine recommence le cycle. Dans 10 % des cas la protéine
retrouve une bonne conformation et sort du RE. Dans les 90 % des cas restant, la protéine est toujours
dans une mauvaise conformation.
Rôle de la N-glycosylation dans le repliement des protéines dans le RE.
3. Élimination des protéines mal repliées par transport dans le cytosol : ERAD
Malgré tout cela, si la protéine est toujours mal repliée, elle est reconnue par une protéine
chaperon qui la conduit jusqu’au translocon de la membrane du RE par lequel elle est expulsée. La
protéine rétro-transloquée dans le cytosol est ensuite dé-glycosylée par une N-glycarase puis poly-
ubiquitinylée et envoyée vers le protéasome où elle est dégradée.

Élimination des protéines mal repliées (rétro-translocation ou dislocation) et dégradation par le protéasome.
4. Activation d’une réponse à l’accumulation de protéines mal repliées : UPR

Le principe est le suivant : nous augmentons la transcription des gènes codant les chaperons, les
protéines de la rétro-translocation (protéines responsables de débobiner les protéines mal repliées)
et les protéines impliquées dans la dégradation des protéines mal repliées. Aussi nous diminuons
globalement la traduction (donc diminution de la surcharge du RE).
Il existe trois détecteurs de protéines mal repliées :

§ IRE1 régule la maturation et la traduction de l’ARNm ;
§ PERK réduit la synthèse des protéines qui entrent dans le RE et augmente la traduction
des ARNm impliqués dans l’UPR pas affectée ;
§ ATF6 induit la libération activée par protéolyse.
Ils vont induire la formation d’ARNm chaperon, donc des protéines de régulation de
l’expression des gènes.
125 Année 2017 - 2018

Réponse de la cellule à l'accumulation de protéines mal repliées (levure).
5. Attachement de certaines protéines à la membrane par un GPI
Attachement de certaines protéines à la membrane par un GPI.
6. Maladies associées au système de contrôle de qualité du RE

De nombreuses maladies sont associées à un défaut du système de contrôle qualité des protéines
au niveau du RE :
§ Mucoviscidose, la protéine en cause est CFTR, 4 % de la population présente une
mutation, mais il faut être homozygote pour la mutation pour être malade. ΔF508 est
responsable de plus de 70 % des cas.
§ Diabète de type 2 (mutation du récepteur à l’insuline).
§ Hypercholestérolémie (mutation du récepteur des LDL).
§ Diabète insipide (mutation de l’aquaporine-2).
§ Maladie de Parkinson du jeune (mutation du récepteur Pae-1).

F. Synthèse des lipides au niveau du RE

1. Quatre phospholipides majeurs dans les membranes plasmiques
Quatre phospholipides majeurs de la membrane plasmique des cellules du mammifère.
Les phosphatidyléthanolamine, phosphatidylsérine et phosphatidylcholine sont synthétisés de la

même manière dans la membrane du RE. La sphingomyéline est synthétisée à moitié dans le RE et à
moitié dans l’appareil de Golgi.
2. Synthèse et assemblage de la monocouche cytosolique sur le RE
Synthèse de la phosphatidylcholine ou lécithine.
Les lipides ne passent pas d’une couche à l’autre comme ça. Il existe un système pour le faire.
La séquence des événements est la suivante :

§ incorporation d’AG dans le feuillet cytosolique de la membrane du RE ;
§ activation de deux AG par greffage d’un coenzyme A par une coenzyme A-transférase ;
§ estérification d’une molécule de glycérol-3-phosphate par deux chaînes d’AG par une
acyl-transférase : génération d’acide phosphatidique ;
§ déphosphorylation par une phosphatase : génération d’un DAG (diacylglycérol) ;
§ greffage d’un groupement variable : phosphocholine (PC), phospho-éthanolamine (PE),
phosphosérine (PS).
Remarque. – Les enzymes de la membrane utilisées ont leur site actif du côté cytosolique.
127 Année 2017 - 2018

3. Basculement asymétrique d’une couche à l’autre
Translocation des phospholipides lors de la synthèse de la bicouche lipidique de la membrane du RE.
La composition lipidique de la membrane plasmique est asymétrique, alors qu’elle est alimentée
par des vésicules d’exocytose, qui dérivent du RE. D’autres enzymes spécialisées maintiennent
l'asymétrie, notamment une flipase qui catalyse le mouvement de basculement des phospholipides
possédant une ou plusieurs fonctions amines libres (PS, PE) vers le feuillet cytoplasmique (interne). Les
glycolipides sont exclusivement dans le feuillet non-cytosolique. Si la membrane plasmique n’est pas
asymétrique, la cellule se suicide.
Translocation sélective des phospholipides dans la bicouche lipidique de la membrane plasmique.
4. Synthèse de cholestérol et de céramide

Le cholestérol est réparti à peu près uniformément entre les deux feuillets.
5. Le REL est le siège de transports électroniques

§ Il contient le cytochrome P450 dont le site d'action est cytosolique ;
§ Le cytochrome P450 est capable d'hydroxyler des molécules variées ;
§ Il participe à la synthèse des hormones stéroïdes ;
§ Il participe à la détoxification des molécules exogènes (toxiques, médicaments).

Rôle du cytochrome P450 dans la détoxification de drogues exogènes ou de métabolites endogènes.
V. Mécanismes moléculaires du transport par des vésicules

et maintien de la diversité des différents compartiments
A. Principe du transport, problématique et questions

Le transport entre deux compartiments se fait par l’intermédiaire de vésicules, qui bourgeonnent
du compartiment donneur et qui fusionnent avec le compartiment accepteur.
Le principe du transport par des vésicules.
Au moins dix compartiments chimiquement distincts avec une membrane :

§ Comment chaque compartiment maintient-il son caractère spécialisé ? Marqueurs
spécifiques insérés dans la membrane.
§ Comment la membrane peut-elle bourgeonner ? Couverture spécifique, du côté du
cytosol, de la membrane qui bourgeonne.
§ Comment voyagent les vésicules ? Câbles de transport des vésicules.
§ Comment les vésicules de transport accostent-elles à la membrane cible ? Molécules de
reconnaissance entre vésicules et compartiments cibles.
§ Comment se fait la fusion des membranes ? Molécules spécialisées dans la fusion des
membranes.
129 Année 2017 - 2018

Dix compartiments chimiquement distincts avec une membrane.
B. Stratégies d’étude du transport par les vésicules

1. Approche génétique
2. Approche biochimique

C. Plusieurs types de couverture des vésicules

1. Vésicules recouvertes de clathrine
Clathrine. – Protéine qui s'assemble avec ses homologues pour former une cage polyédrique à la
face cytosolique d'une membrane de façon à former une dépression recouverte de clathrine qui
bourgeonne pour former une vésicule intracellulaire recouverte de clathrine. Elle sert dans le
transport des vésicules post-golgiennes.
2. Vésicules recouvertes de COPI ou COPII

Ces couvertures sont utilisées pour le transfert entre différents compartiments de la cellule,
comme du RE vers le Golgi :
§ COPI sert dans le transfert rétrograde ;
§ COPII sert à la sortie du RE.
3. Différentes couvertures selon l’origine et la destination des vésicules
Différentes couvertures selon l'origine et la destination des vésicules.
D. Mécanismes de formation des vésicules recouvertes

1. Structure de la couverture de la clathrine
La clathrine forme un triskélion. Elle est formée par trois chaînes légères et trois chaînes lourdes.
Cette protéine forme avec ses homologues un environnement (une cage), un réseau de pentagones et
d’hexagones. L’assemblage de ces protéines est un autoassemblage.
Structure de la couverture de clathrine.
131 Année 2017 - 2018

2. Assemblage et désassemblage de la couverture de clathrine

La clathrine n’interagit pas directement avec la membrane, mais avec l’adaptine. Cette dernière
interagit aussi avec le récepteur de la protéine à transporter dans la vésicule. La vésicule est libérée,
ainsi que la clathrine, par les protéines chaperons hsp70. La clathrine peut ainsi être utilisée de
nouveau.
Assemblage et désassemblage de la couverture de clathrine.
Chaque face de la membrane est hydrophile. Une protéine appelée la dynamine est une protéine
GTPase qui se fixe et entoure le col de la vésicule. Elle utilise le GTP pour resserrer le col et libérer la
vésicule de la membrane sur laquelle elle s’est formée. Si cette protéine est mutée la libération de
vésicules sera impossible (mutation thermosensible).
Rôle de la dynamine dans le pincement de la membrane des vésicules recouvertes de clathrine.
E. Vésicules recouvertes de COPI et COPII

Il y a une importance du PI et des PIP de la membrane dans la formation des vésicules. On a
différents PIP selon le lieu et le nombre de phosphorylations. Ces PIP seront reconnus par des protéines
cytosoliques différentes permettant ainsi de transmettre des messages. Il y a un code permettant de
définir l’identité de la membrane grâce à la composition des PIP.

F. Mécanismes moléculaires du transport par les vésicules

1. Assemblage des couvertures contrôlé par des GTPases monomères
Les GTPases monomériques sont responsables de la régulation de certaines protéines. Elles
passent sous forme GDP ou GTP grâce à des GAP et GEF. Les GAP font transiter la GTPase de GTP à
GDP. Les GEF font l’action inverse.
Cycle de fonctionnement des GTPases monomères ou petites protéines G.
La protéine Sar1 est une des protéines responsables de la formation de vésicules recouvertes de
COPII. Elle est liée au GDP. Lorsque ce GDP passe sous forme GTP (sous l’action de GEF), la protéine
Sar1 change de conformation et fait apparaître, à l’extérieur, une hélice amphiphile ; la protéine va
alors s’ancrer dans la membrane.
Formation d'une vésicule recouverte de COPII grâce à la protéine Sar1 GTPase de recrutement de la couverture.
Ensuite, Sec23 est recruté se liant à la protéine Sar1, puis Sec24 arrive et se lie à la fois à Sec23 et
au récepteur de la molécule à transporter dans la vésicule (récepteur de la cargaison).
Formation d'une vésicule recouverte de COPII grâce à la protéine Sar1 qui s'associe à 2 protéines de COPII.
133 Année 2017 - 2018

Enfin, viennent se fixer deux nouvelles protéines, Sec13 et Sec31, qui forment une cage autour
de la vésicule.
Formation d'une vésicule recouverte de COPII grâce à la protéine Sar1-GTP.
2. Guidage des vésicules par les protéines Rab

Protéine Rab. – Toute protéine appartenant à une grande famille de protéines à activité GTPase
sous forme de monomère, présente dans la membrane plasmique et celle des organites qui est
impliquée dans la spécificité de l’arrimage des vésicules. Plus de 60 protéines Rab sont
actuellement décrites et répertoriées
Fonctionnement : la protéine Rab-5 est liée au GDP, intervient alors la Rab5-GEF, donnant ainsi
la protéine Rab5-GTP sous sa forme active. Rab5 s’introduit dans la membrane grâce à sa nouvelle
conformation. La protéine PI3 a été auparavant phosphorylée par une PI3 kinase, donnant du PI3P. PI3P
et Rab5-GTP sont donc tous les deux fixés à la membrane et forment à eux deux un micro-domaine
pour l’interaction avec des protéines filamenteuses d’attachement.
Formation d'un domaine de Rab5 sur la membrane de l'endosome.
Ces protéines servent donc pour la fusion de vésicule avec la membrane. Les protéines de la
vésicule, filamenteuses et Rab, interagissent avec d’autres protéines présentes sur la membrane : les
protéines SNARE.

Attachement d'une vésicule à la membrane cible.
3. Fusion des membranes grâce aux protéines SNARE

C’est une protéine que l’on retrouve à la fois sur la vésicule et sur la membrane :
§ v-SNARE (v pour vésicule) : sur la vésicule ;
§ t-SNARE (t pour target) : sur la membrane.
Il existe plus de 35 protéines SNARE différentes dans une cellule animale.
Modalités d'appariement des protéines SNARE dans l'accostage et la fusion des vésicules synaptiques.
Le complexe est formé au total de quatre hélices α qui s’enroulent entre elles, avec une très haute
stabilité, pour former une super-hélice :
§ 1 hélice par la v-SNARE ;
§ 3 hélices par le compartiment cible.
Ce complexe résiste à la dénaturation avec une température de 100°C ! Il existe des toxines qui
bloquent les protéines SNARE, ce sont des toxines tétaniques. Ces toxines sont critiques pour la
transmission synaptique.
Fonctionnement : le problème de la fusion des membranes est que nous devons mettre en
contact deux surfaces hydrophiles et réussir à les mélanger. Les protéines SNARE de par la stabilité de
leurs hélices qui s’enroulent les unes aux autres, permettent la production spontanée d’énergie. Cette
énergie permettra alors le rapprochement des membranes, par déshydratation. Ce processus de
rapprochement des membranes est une hémisynthèse :
§ les feuillets externes fusionnent en premier ;
§ les feuillets internes fusionnent en deuxième.
135 Année 2017 - 2018

Les protéines SNARE permettent la fusion vésiculaire.
Modèles de fusion des membranes grâce aux protéines SNARE.
4. Dissociation des protéines SNARE par NSF pour de nouveaux transports

Après fusion, les protéines sont toutes du même côté de la membrane (à l’extérieur). La protéine
NSF (NSF = N- éthylmaleimide Sensitive Factor) en présence de protéines accessoires et de l’ATP
permet la dissociation des SNARE pour les régénérer et permettre le déroulement d’un nouveau cycle.
À la fin d'un cycle de fusion des membranes, dissociation par NSF des protéines SNARE appariées.

VI. Transport des protéines à travers l’appareil de Golgi

A. Organisation de l’appareil de Golgi
1. Face d’entrée ou cis, face de sortie ou trans, citernes entre les deux
Schéma de l'appareil de Golgi.
L’appareil de Golgi est composé d’une série de citernes (jusqu’à 40). Elles forment un véritable
réseau de tubules et de vésicules. Elles sont encadrées par la face de sortie, ou trans et la face d’entrée,
ou cis.
2. Empilement en citernes d’activités distinctes
Compartimentation fonctionnelle de l'appareil de Golgi.
B. Principes généraux du transport dans le Golgi par des vésicules

1. Départ du RE dans des vésicules recouvertes de COPII
La première étape est donc la sortie du RE ; elle se fait par le biais de vésicules recouvertes de
COPII. Les vésicules formées à partir du RE se déplacent vers le Golgi.
137 Année 2017 - 2018

Recrutement des molécules à charger à partir du RE dans les vésicules de transport.
2. Contrôle de la qualité de repliement des protéines embarquées

Le principe a déjà été expliqué. Certaines protéines ont un signal de rétention dans le RE, elles ne
sont pas envoyées dans les vésicules tant qu’elles ne seront pas dans leur configuration correcte.
Rôle de la N-glycosylation dans le repliement des protéines dans le RE.
Exemple d’un anticorps : tant que la chaîne légère est manquante (schéma ci-après), la protéine
chaperon BiP restera fixée à celui-ci l’empêchant d’être incorporé dans la vésicule. Une fois la protéine
BiP enlevée et l’anticorps fonctionnel, il peut être envoyé vers l'appareil de Golgi.
Rétention dans le RE des molécules d'anticorps incomplètement assemblées.
3. Transport du RE vers l’appareil de Golgi dans des vésicules regroupées

Pour rappel, les vésicules portent des protéines SNARE. Elles fusionnent alors pour former des
tubules, qui forment le compartiment intermédiaire entre le RE et Golgi. À ce moment, il existe un
transport bidirectionnel. En effet, nous pouvons observer le trajet inverse : tubules à RE. Ce transport
bidirectionnel est nécessaire pour que le RE ne soit pas en déficit de membrane (le transport
tubules " RE se fait grâce à COPI).

Fusion homotypique des membranes pour regrouper les vésicules de transport.
4. Transport des vésicules et des tubules le long des microtubules

Le transport des vésicules se fait donc le long des microtubules, grâce à des moteurs moléculaires
comme la kinésine.
Le compartiment d'agrégats de vésicules et tubules (VTC) ou ERGIC (ER-Golgi intermediate compartment) joue un rôle
essentiel dans le tri des protéines qui quittent le REG.
5. Récupération par le RE des protéines solubles qui en sont parties

Les protéines devant résider dans le RE portent une étiquette en C-terminal : KDEL. Si par erreur
elles se retrouvent dans les vésicules en direction du Golgi, elles sont reconnues par des récepteurs de
KDEL présents au niveau de la membrane du tubule, lui-même reconnu par COPI. Tout cela entraîne le
bourgeonnement d’une nouvelle vésicule qui est dirigée vers le RE.
Bourgeonnement d'une vésicule destinée au retour dans le RE des protéines du RE qui en sont parties.
139 Année 2017 - 2018

Récupération par le RE des protéines solubles qui en sont parties.
6. Deux modèles pour expliquer le transport à travers l’appareil de Golgi

§ Modèle du transport par des vésicules : les différents compartiments du Golgi
communiqueraient entre eux par voie vésiculaire (et ce, aussi dans le sens rétrograde).
§ Autre modèle : stipule que les compartiments cis, intermédiaire et trans représentent en
fait différents états de maturation des citernes de l’appareil de Golgi.
C. Modifications des chaînes N-oligosaccharidiques dans le Golgi

Dans le RE, cette modification se fait sur un Asn, et ce, de manière co-traductionnelle. Les résidus
glucidiques sont enlevés avant la sortie du RE de la protéine, puis une fois dans le Golgi, des sucres
pourront être rajoutés.
§ Élimination initiale de quelques Glc et Man dans le RE ;

§ Il peut y avoir des protéines avec un contenu élevé en mannose ;
§ Enfin, certaines protéines possèdent un oligosaccharide complexe lié à l’Asn.
Dans l'appareil de Golgi a lieu la maturation des chaînes oligosaccharidiques greffées sur des
résidus Asn dans le RE.

Oligosaccharide à contenu élevé en mannose.
Oligosaccharide complexe.
Comparaison entre les oligosaccharides complexes et ceux à contenu élevé en mannose.
D. Modification des chaînes O-oligosaccharidiques dans le Golgi

L’O-glycosylation est catalysée par une série de glycosyl-transférases qui transfèrent les sucres un
par un, les uns après les autres à partir de nucléotides sucrés présents dans la lumière du RE sur des
groupements hydroxyles des chaînes latérales de sérine, thréonine et d’aminoacides modifiés. Les
liaisons O-glycosidiques sont nombreuses et variées, présentes sur de très nombreuses protéines,
formées selon des processus encore mal compris.
1. Addition d’autres oligosaccharides à la N-acétylgalactosamine initiale

Cette modification se fait majoritairement dans l’appareil de Golgi, sur un groupement hydroxyle
: sur la sérine, la thréonine, mais elle peut aussi se faire sur la proline ou la lysine. On rajoute donc,
comme dit précédemment à la N-acétylgalactosamine initiale des phosphorylations, ou encore des O-
glycosylations (sérine ou thréonine), le greffage de GAGs sur des protéines, formant ainsi des
protéoglycanes, ou encore la sulfatation de certains sucres et de résidus tyrosines.
141 Année 2017 - 2018

N- et O-glycosylations.
2. Assemblage des protéoglycanes

ÙÙ
Protéoglycane. – Molécule qui consiste en un ou plusieurs glycosaminoglycanes attachés de
façon covalente à une protéine.
La formation des protéoglycanes se fait dans un premier temps par polymérisation de chaînes de
GAGs. Ils seront ensuite liés au groupement hydroxyle d’une sérine via un tétrasaccharide de liaison
formé d’un xylose, de deux galactoses et d'un acide glucuronique puis vient la répétition de
disaccharides que constitue le GAG. Ils formeront alors l’essentiel de la MEC.
3. Nature des glycosaminoglycanes
ÙÙ
Glycosaminoglycane. – Longue chaîne linéaire de polysaccharides chargés, composée de paires
de sucres répétés, dont l’un est toujours un sucre aminé. Les glycosaminoglycanes sont libres ou
attachés de façon covalente à la partie protéique des protéoglycanes de la matrice extracellulaire.
Exemple : l’héparine, l’acide hyaluronique, le sulfate de chondroïtine.

E. Modifications séquentielles dans des compartiments spécialisés
Maturation de l'oligosaccharide dans le RE et dans l'appareil de Golgi.
On peut utiliser l’Endo H et la PNGase pour suivre le trafic des protéines.
F. Conséquences pour les protéines modifiées

1. Rôle de la glycosylation
Le rôle de la glycosylation n’est pas complètement connu. Elle n’est pas impliquée dans le
transport sauf pour celui vers les lysosomes. Elle participe au repliement des protéines et au système
de contrôle de qualité, de protection vis-à-vis de la dégradation par les protéases, la solubilisation des
protéines et sert à l’adhérence intercellulaire via les sélectines.
VII. Transport à partir de l’appareil de Golgi

A. Différentes voies possibles à partir de la face trans du Golgi
1. Vers les lysosomes
Les éléments transportés vers le lysosome passent par l’endosome terminal et rejoignent ensuite
le lysosome.
Route suivie par les protéines qui vont dans les lysosomes via les endosomes terminaux.
143 Année 2017 - 2018

2. Vers une voie de sécrétion constitutive
Route suivie par les protéines qui sont sécrétées de façon constitutive.
3. Vers une voie de sécrétion régulée
Route suivie par les protéines qui sont sécrétées de façon régulée.
B. Vers les lysosomes

Lysosome. – Structure entourée d’une membrane, présente dans toutes les cellules. Sa forme peut
varier d’une cellule à l’autre. Nous pouvons visualiser les lysosomes en ME par méthode
histochimique grâce à leur composition : ils sont riches en hydrolase acide.
1. Lysosomes : principaux sites de digestion intracellulaire
Lysosome.

Le pH est très acide dans ce compartiment. Ce pH est dû à un transporteur particulièrement actif

à leur surface : une pompe à protons. Cette pompe utilise l’énergie de l’ATP pour faire entrer des
protons dans le lysosome (baisse du pH). En effet, les hydrolases dans le lysosome fonctionnent
uniquement dans des milieux acides. Heureusement, ces enzymes ne sont presque pas actives au pH
du cytosol, et la cellule ressort intacte d’une éventuelle rupture du lysosome.
pH des différents compartiments intracellulaires.
2. Trois voies de capture du matériel digéré par les lysosomes

§ Endocytose : cette invagination de la membrane cellulaire se referme pour former une
vésicule et un endosome initial. Soit ce dernier est en partie recyclé dans la membrane
de la cellule ; soit il y a formation d’un endosome terminal qui est reconnu par le lysosome
et ces deux structures fusionneront ensemble.
§ Autophagie ou cannibalisme cellulaire : cette voie est particulièrement importante pour

la survie de la cellule. Elle permet de digérer des constituants internes de la cellule, des
parties du cytoplasme qui ne sont pas fonctionnelles comme la mitochondrie. Lors d’une
carence, l’autophagie permet de digérer une partie de la cellule pour essayer de
renouveler la cellule dans de bonnes conditions. L’autophagosome est formé avec une
membrane qui entoure l’organite ciblé, puis fusionne avec le lysosome pour être détruit.
§ Phagocytose : la phagocytose existe dans des cellules spécialisées. C’est un processus par
lequel du matériel sous forme de particules subit une endocytose par une cellule. Cette
dernière peut phagocyter une bactérie (assez importante : de l’ordre du micron),
présente en dehors de la cellule.
Confluence dans les lysosomes du matériel capturé selon les trois voies de capture.
145 Année 2017 - 2018

Nous parlons d’abord d’endosome terminal, puis lors de la fusion d’endolysosome, et enfin le
lysosome intact à la fin.
De l'endosomes terminal au lysosome en passant par l'endolysosome.
3. Origine des enzymes destinées aux lysosomes

§ Marquage et tri dans le réseau cis de l’appareil de Golgi : cela se fait au niveau de
l’appareil de Golgi à travers ses différents compartiments.
§ Addition de M6P à un mannose terminal d’un N-oligosaccharide : les protéines destinées

aux lysosomes ont un sucre phosphorylé (Man-6P), sur un N- oligosaccharidique. Par
exemple, sur une hydrolase destinée aux lysosomes, dans le RE a eu lieu l’ajout du N-
oligosaccharidique avec un mannose terminal, puis dans le Golgi, on ajoute le 6P dans le
cis-Golgi pour que la protéine soit reconnue.
Structure du mannose 6-phosphate lié à une enzyme des lysosomes.
Dans le Golgi, l’hydrolase est reconnue par une Nac-Glc-phosphotransférase. Un UDP-Nac-Glc se

lie au site actif de l’enzyme et il y aura un transfert du groupement phosphate + sucre. Puis le sucre
est supprimé et ne restera que le phosphate. Le Man-6P apparaît vers la citerne trans.
Reconnaissance d’une hydrolase des lysosomes par une N-acétylglucosamine phophotransférase (CGN).

4. Reconnaissance par un récepteur du M6P dans le réseau trans du Golgi
Reconnaissance par un récepteur du M6P dans le réseau trans de l'appareil de Golgi.
5. Transport par une vésicule recouverte de clathrine à partir du trans Golgi

Après la formation de la vésicule, on enlève le manteau de clathrine puis on utilise les protéines
SNARE et Rab, pour cibler la vésicule vers le lysosome.
Transport par une vésicule à partir du réseau trans de l'appareil de Golgi.
6. Fusion des membranes entre la vésicule et l’endosome

L’endosome et la vésicule fusionnent, les pompes à protons de l’endosome acidifient le milieu.
Fusion des membranes entre la vésicule et l'endosome initial.
147 Année 2017 - 2018

7. Libération du chargement par abaissement du pH

L’acidification de l’endosome entraine la dissociation de la cargaison et de son récepteur, puis la
dissociation du phosphate présent sur l’hydrolase.
Libération du chargement par abaissement du pH.
8. Recyclage du récepteur du M6P

Rétromère : formé de SNX1 qui se dimérise et s’allonge autour de la vésicule. Le domaine BAR de
cette protéine permet la liaison avec une autre protéine sur la membrane. La cargaison est reconnue
par une autre protéine : VPS35.
Recyclage du récepteur du M6P.
Les récepteurs du M6P ressortent par une vésicule couverte de « rétromère ».
Recyclage du récepteur du M6P.

9. Maladies de surcharge des lysosomes

Le dysfonctionnement des lysosomes peut être le résultat de nombreux défauts :
Pathologie Ù Maladie de Hurler. – Une enzyme lysosomale manque ou présente un défaut de

fonctionnement, ce qui empêche la dégradation des glycosaminoglycanes, qui s’accumulent dans
les lysosomes. Ces anomalies sont très rares et touchent tous les systèmes, en particulier le SNC et
le squelette, mais aussi le foie et la rate. Tout cela entraîne des troubles mentaux. Les patients
décèdent avant d’atteindre l'âge de 20 ans. Nous pouvons leur perfuser une forte concentration
des enzymes déficitaires. Malheureusement, cette enzyme ne passe pas la barrière hémato-
céphalique. Le retard mental est toujours là, même si les autres symptômes sont moins présents.
Pathologie Ù Maladie de Tay-Sachs. – Déficit de l’enzyme qui dégrade les glycolipides. Les
personnes atteintes de cette maladie souffrent de problèmes de rétine et de SNC.
Pathologie Ù Altération de la N-acétylglucosamine phosphotransférase. – L’altération de la N-

acétylglucosamine phosphotransférase est une maladie monogénique récessive. Il n’y a plus
d’hydrolases dans les lysosomes, puisqu’elles ne sont plus porteuses de Man-6P, à la place elles
sont sécrétées, et envoyées vers l’extérieur. Les lysosomes sont non fonctionnels et gonflent à
cause du matériel qui aurait dû être dégradé par les hydrolases. Il s'agit d'une maladie létale de
façon précoce.
C. Vers les vésicules de sécrétion et la surface de la cellule : exocytose
Principe de l'exocytose du contenu des vésicules de sécrétion.
149 Année 2017 - 2018

1. Voie de sécrétion constitutive et voie de sécrétion régulée

Ces deux voies divergent dans le réseau transgolgien :
§ la voie sécrétoire constitutive est fonctionnelle dans toutes les cellules. Beaucoup de
protéines solubles sont continuellement sécrétées à partir de la cellule par cette voie, qui
fournit aussi les lipides et les protéines néosynthétisées.
§ Les cellules sécrétoires spécialisées présentent en plus une voie sécrétoire régulée, dans
laquelle des protéines sélectionnées dans le réseau transgolgien sont dirigées dans des
vésicules sécrétoires où elles se concentrent et sont mises en réserve jusqu’à ce qu’un
signal extracellulaire stimule leur sécrétion.
Exemple. – Sécrétion d’insuline dans le sang par les cellules β des îlots de Langerhans du pancréas.
Voie de sécrétion constitutive et voie de sécrétion régulée.
2. Transport automatique des lipides et de nombreuses protéines

Le transport automatique des lipides, certaines protéines et des sucres est leur libération non
contrôlée par une signalisation cellulaire. C’est ce qu’on a vu dans la voie de sécrétion constitutive.
3. Transport régulé dans les cellules polarisées par des mécanismes variés
Le lysosome peut fusionner avec des endosomes (formation d’endolysosome). Sécrétion rapide,
à la demande des produits comme des hormones, neurotransmetteurs ou enzymes digestives.
Tri et transport des protéines selon la nature des séquences de signalisation qu'elles comportent.

4. Bourgeonnement des vésicules de sécrétion à partir du trans Golgi

Il y a une véritable concentration du matériel d’exocytose à l’intérieur de la vésicule et ce, selon
deux mécanismes :
§ Premièrement la cargaison forme des agrégats dans le trans-Golgi. La condensation va
augmenter avec la maturation des vésicules ;
§ Puis les excédents en contenu membranaire présents dans les vésicules de sécrétion
immatures sont recapturés dans des vésicules recouvertes de clathrine ;
§ Les vésicules matures ne contiennent donc plus la couverture de clathrine (qui était nécessaire
seulement lors du bourgeonnement).
Concentration du matériel d'exocytose à l'intérieur des vésicules.
5. Maturation protéolytique lors de la formation des vésicules de sécrétion

Les protéines ne font pas que se condenser dans les vésicules de sécrétion, elles subissent aussi
une maturation.
Exemple. – L’insuline, est synthétisée sous forme de proinsuline, puis digérée par deux enzymes
différentes. Elle est à la fin composée de deux ponts disulfures inter-chaînes.
Maturation protéolytique de la proinsuline en insuline par des endopeptidases sur la voie de la sécrétion régulée.
Les hormones peptidiques sont d’abord synthétisées sous forme de pré-pro-hormone, puis quand
nous coupons le peptide de signalisation, nous tombons sur la pro-hormone. Le clivage commence
dans le trans-Golgi, puis se termine dans les vésicules sécrétoires et parfois même dans le liquide
extracellulaire.
151 Année 2017 - 2018

Différentes voies de maturation d'une pro-hormone, la proopiomélanocortine.
6. Transport des vésicules d’exocytose le long des microtubules

L’élongation des tubes se fait à partir de la partie distale des citernes. Ils interagissent avec les
microtubules grâce à des moteurs moléculaires, les kinésines, qui tirent sur ces tubes. À force de tirer,
il y aura clivage du tube par une dynamine et d’autres protéines, qui permettent de les couper.
7. Attente d’un signal près de la membrane plasmique (ex : mastocyte)

Le mastocyte contient de l’histamine (responsable des allergies). Une fois la vésicule chargée, elle
doit rejoindre le site de sécrétion, qui n’est pas toujours près de l’appareil de Golgi (comme dans les
cellules nerveuses).
Les vésicules une fois arrivées au niveau de la membrane, ne fusionnent pas directement avec
elle, mais attendent que la cellule reçoive un signal pour le faire et être sécrétées. Ce signal est souvent
une augmentation transitoire de la concentration en Ca2+ libre dans le cytosol.
8. Recyclage des composants de la membrane

Il y a équilibre entre l’apport de membrane par exocytose et la réimportation de ces membranes
par endocytose. Dans une cellule pancréatique qui sécrète les enzymes nécessaires à la digestion, les
membranes apportées par les vésicules peuvent atteindre 900 μm2, alors que la surface de la
membrane de la cellule tout entière au repos n’est que de 30 μm2.
9. Transport dirigé aux domaines appropriés de la membrane plasmique dans

les cellules polarisées
Les cellules des épithéliums comportent des arrangements géométriques particuliers. Nous
retrouvons par exemple les épithéliums de revêtement (peau, trachée, intestins) qui possèdent une
face vers le milieu extérieur (domaine apical), et l’autre vers l’intérieur de l’organisme (domaine
basolatéral).
Comparaison de deux types de cellules polarisées.

Les cellules nerveuses sont un autre type de cellules polarisées avec le corps de la cellule, suivi
d’un long axone, pouvant atteindre jusqu’à un mètre. Ces différentes parties ont aussi une composition
différente.
10. Membrane apicale et membrane basolatérale de composition différente

Il y a une différence de composition des membranes : GPI, glycolipides, glycosphingolipides sont
à l’extérieur. Les lipides délivrés à la face apicale et basolatérale sont différents.
Les domaines apicaux et basolatéraux sont physiquement séparés par les jonctions serrées dans un épithélium.
Les radeaux lipidiques sont préférentiellement envoyés vers le pôle apical.
Structure d'un radeau lipidique délivré à la membrane apicale.
11. Membranes apicale et basolatérale séparées par des jonctions serrées

Les épithéliums sont compartimentés, grâce aux jonctions serrées, qui leur donne aussi une
grande étanchéité.
153 Année 2017 - 2018

12. Deux voies de sortie des protéines de la membrane plasmique dans les
cellules épithéliales
Les protéines synthétisées peuvent atteindre leur domaine propre dans la membrane plasmique
par une voie directe ou indirecte :
§ dans la voie indirecte, la protéine est recapturée depuis le domaine inapproprié de la

membrane plasmique par endocytose, puis transportée dans le domaine correct par les
endosomes précoces : la transcytose.
§ dans la voie directe, les protéines suivent une exocytose simple à partir du Golgi.
Deux voies de sortie des protéines de la membrane plasmique dans les cellules épithéliales.
13. Cas particulier : vésicules synaptiques formées à partir des endosomes

Lors de la dépolarisation, nous avons un signal de formation de vésicules qui vont dans le bouton
post-synaptique. Les vésicules synaptiques ont un processus de formation différents de toutes les
autres vésicules :
§ Pour commencer, les vésicules ne sont fusionnées à la membrane que lorsque la cellule
reçoit un signal de Ca2+ ;
§ La plupart des vésicules synaptiques ne sont pas générées à partir du Golgi, mais par un
recyclage local à partir de la membrane plasmique ;
La fusion correspond à la transmission du signal. Elle met en jeu des protéines SNARE
particulières aux synapses v-SNARE (ou synaptobrévine) et 2 t-SNARE (la syntaxine et la
SNAP25) dont une SNAP25 qui interagit avec la bicouche lipidique.
Les protéines SNARE permettent la fusion vésiculaire.

§ D’autres protéines sont nécessaires à la fusion de la vésicule avec la membrane ; ces

protéines sont sensibles aux concentrations de calcium. Lors de l’entrée de Ca2+, les
SNARE changent de conformation accentuant leur resserrement, entraînant la fusion des
membranes.
La fusion est déclenchée par des protéines accessoires sensibles au calcium.
Formation des vésicules synaptiques.
Cycle de la vésicule synaptique : la vésicule est ramenée de la membrane dans le neurone,

chargée de neurotransmetteur. Le neurotransmetteur entre par gradient de protons. Puis exocytose
et nous sommes prêts pour un nouveau cycle.
Le cycle des vésicules synaptiques.
Les vésicules synaptiques sont riches en cholestérol, en phospholipides, en v-SNARE

(synaptobrévine) et en protéines ATPase. Les toxines botuliques sont des protéases spécifiques des
SNAREs. Ces toxines ont des applications thérapeutiques variées (>100 indications). Le botox est une
toxine de type A entraînant la paralysie, utilisée en chirurgie esthétique pour cibler l’innervation des
muscles peauciers.
155 Année 2017 - 2018

VIII. Transport à partir de la membrane plasmique :

endocytose
A. Introduction et définitions
1. Phagocytose
La phagocytose est une forme spéciale d’endocytose dans laquelle des grandes particules tels que
les micro-organismes et les cellules mortes sont ingérées via de grandes vésicules d’endocytose
appelées phagosomes (> 250 nm). C’est une forme d’alimentation pour les protozoaires.
Dans les organismes pluricellulaires, peu de cellules sont capables d’ingérer de telles particules
de grande taille avec efficacité. Les animaux pour la plupart, utilisent des cellules spécialisées pour
assurer une phagocytose à des fins autres que l’alimentation. Ces phagocytes professionnels sont les
macrophages, les cellules neutrophiles et les cellules dendritiques qui dérivent des cellules souches
hématopoïétiques et assurent la défense de l’organisme contre les infections.
Les macrophages jouent aussi un rôle important dans l’élimination des cellules sénescentes. C’est
ainsi qu’ils phagocytent plus de 1011 globules rouges sénescents tous les jours.
Les anticorps fixés sur la bactérie à endocyter sont reconnus par des récepteurs présents sur la
membrane. (Le signal spécifique présent sur la cellule à endocyter peut, par exemple, être des lipides
présents sur la membrane externe alors qu’ils ne devraient pas être sur cette face).
2. Endocytose
ÙÙ
Pinocytose. – Ingestion continue de liquide par la cellule via de petites vésicules de 100 nm de
diamètre environ.
Endocytose par récepteur interposé : sélection de molécules ou de particules par des récepteurs
présents à la membrane plasmique, suivie d’une concentration dans une cavité provenant de
l’invagination de la membrane recouverte de clathrine, et d’une entrée dans la cellule sous forme de
complexes macromoléculaires enfermés dans une vésicule recouverte de clathrine.
B. Pinocytose
§ Caractéristiques générales de la pinocytose
La pinocytose est un phénomène continu et permanent, très actif. Un macrophage ingère 25 % de

son propre volume toutes les heures, c’est-à-dire 3 % de sa membrane plasmique toutes les minutes,
soit la totalité en environ 30 minutes.
La formation de vésicules recouvertes de clathrine se fait au rythme d’environ 2 500 par minute
dans un fibroblaste en culture. La perte de la couverture de clathrine se fait en une minute et la fusion
avec des endosomes en quelques secondes.
§ Pinocytose indépendante de la clathrine : les cavéoles
Les cavéoles sont présentes à la membrane plasmique de la plupart des cellules. Elles seraient
formées à partir des radeaux lipidiques qui contiennent une protéine plusieurs fois transmembranaire,
la cavéoline.

Les cavéoles collectent une cargaison qui dépend de la composition de leur membrane
(interaction préférentielle avec les radeaux lipidiques). Elles ne sont pas recouvertes et délivrent le
contenu de leur cargaison à des structures du type de l’endosome.
ÙÙ
Radeau lipidique. – Petite région de la mb plasm. enrichie en sphingolipides et en cholestérol.
C. Endocytose par récepteur interposé

1. Principes de fonctionnement
La sélection du chargement se fait par des protéines transmembranaires dans des vésicules à
clathrine.
2. Exemple de l’endocytose des LDL

L’endocytose des LDL est impliquée dans le transport du cholestérol. Cette apolipoprotéine est
composée d’une protéine, à l’extérieur, enchevêtrée dans la membrane, composée elle, de
phospholipides (augmente la solubilité). À l’intérieur, les LDL sont composés de molécules d’ester de
cholestérol (insoluble).
Les récepteurs des LDL sont des glycoprotéines à un seul passage transmembranaire, composées
de 840 acides aminés dont 50 seulement sont dans le cytosol (nous retrouvons particulièrement
l'asparagine, la valine, la proline et la tyrosine).
Particule de lipoprotéine de basse densité (LDL).
3. Des LDL extracellulaires au cholestérol et acides gras intracellulaires

Les LDL se fixent à leur récepteur coté extracellulaire, qui interagit avec l’adaptine qui elle-même
interagit avec la clathrine du côté intracellulaire. Après que le ligand se soit fixé, endocyté, puis libéré
de la couverture de clathrine, il y a formation d’un endosome dont le pH diminue (5). Le LDL est alors
vidé dans l’endosome. Le récepteur est recyclé est renvoyé vers la membrane grâce à une vésicule.
157 Année 2017 - 2018

Voie d'endocytose qui conduit à l'internalisation des LDL.
Surface de la cellule à pH 7,0.
Modèle de liaison dépendante du pH par un récepteur des LDL des particules de LDL.
4. Déficits génétiques en récepteur de LDL

Lorsqu’il n’y a pas de récepteur des LDL (même s’il ne manque que la partie C-terminale qui
interagit avec l’adaptine), cela suffit pour ne pas endocyter le cholestérol. Du coup, la cellule ne trouve
pas de cholestérol, et en synthétise. Le cholestérol augmente à l’intérieur de la cellule et à l’extérieur
de la cellule, car il n’est pas endocyté.
Récepteurs des LDL normaux et présentant une mutation.

D. Quelles routes après l’endocytose ?
L'endosome précoce / initial est le compartiment de triage.
1. Endocytose et recyclage à la membrane
Absorption du cholestérol à partir des LDL.
2. Endocytose et dégradation dans les lysosomes

À partir de l’endosome initial, on a maturation pour aller vers l’endolysosome puis le lysosome.
Voie d'endocytose de la membrane plasmique aux lysosomes.
Maturation de l’endosome initial vers l’endosome terminal : formation de corps multi-vésiculaires

qui correspondent à l’invagination de la membrane.
159 Année 2017 - 2018

Séquestration des protéines ayant subi l'endocytose dans des membranes internes de corps multi-vésiculaires.
Nous marquons les protéines membranaires des vésicules avec l’ubiquitine (pour les protéines
qui viennent d’être endocytées). Il s’agit d’une multi-ubiquitinylation.
L’ubiquitinylation est un signal d’endocytose et de dégradation dans les lysosomes.
3. Transcytose et passage de barrières cellulaires

Les IgG se fixent à un récepteur au domaine apical. À partir de cette endocytose, la vésicule
fusionne avec l’endosome initial dont le pH est acide. Ensuite, il y a passage de ce récepteur lié à l’IgG
depuis l’endosome initial vers l’endosome de recyclage. Depuis ce dernier, il y a bourgeonnement
d’une vésicule contenant le récepteur et l’IgG. Cette vésicule se dirige alors vers la membrane
basolatérale et fusionne avec.
Exemple Ù Allaitement. – Lait riche en immunoglobulines G (IgG).
Un endosome de recyclage peut être utilisé comme réserve (stockage de glucose près de la
membrane par exemple).
Transcytose des IgG maternelles à travers les cellules épithéliales de l'intestin.

4. Stockage de protéines de la membrane dans un endosome de recyclage
Stockage de protéines de la membrane plasmique dans des endosomes de recyclage.
E. Dans les c. épithéliales : 2 compartiments distincts d’endosome initial

Les deux faces n’ont pas la même activité. Les endosomes des deux faces peuvent fusionner pour
connecter les deux faces de la cellule.
Deux catégories distinctes d'endosome initial dans les c. épithéliales, un compartiment commun d'endosomes tardif.
IX. Transport vers les mitochondries

A. Structure générale de la mitochondrie et problèmes de transport
Mitochondrie. – Centrale énergétique de la cellule, impliquée dans la production d’ATP,
fournissant l’énergie à la plupart des réactions de la cellule.
La structure tridimensionnelle de mitochondries est composée de plusieurs compartiments :
§ la membrane externe et la membrane interne délimitent un espace inter-membranaire.

La surface de cet espace inter-membranaire est augmentée grâce aux crêtes
mitochondriales, et permet à la mitochondrie d’avoir de la place pour les réactions de la
chaîne respiratoire.
§ la matrice mitochondriale, qui est l’équivalent du cytoplasme pour les cellules
161 Année 2017 - 2018

Coupe d’une mitochondrie.
Forme et localisation des mitochondries très variables.
Principe de la production d’ATP :
§ Utilisation d’électrons de forte énergie. Le transport des électrons active des pompes
créant un gradient de protons de part et d’autre de la membrane interne.
§ Les protons accumulés repassent dans la matrice mitochondriale à travers l’ATP synthase
activant ainsi la production d’ATP. L’entrée de protons par cette enzyme lui permet de
synthétiser de l’ATP.
Cela signifie que les membranes interne et externe sont extrêmement imperméables aux protons.
Elles doivent avoir des caractéristiques différentes au niveau du transport des molécules. Ces électrons
de haute énergie viennent de l’alimentation.
Il y a trois grandes fonctions du gradient de protons :

§ Production d’ATP ;
§ Mise en mouvement des flagelles pour les spermatozoïdes ;
§ Transport actif à travers les mitochondries.

Les acides gras et le pyruvate rentrent dans la mitochondrie, dans la matrice mitochondriale. Dans
la matrice mitochondriale, il y a le cycle de Krebs, qui fournit du NADH. Il y a création du gradient de
proton qui se termine par le retour de protons dans la cellule permettant la production d’ATP. Avant
le pyruvate, les acides gras passent par la ß-oxydation, dans les mitochondries ou les peroxysomes.
La mitochondrie peut faire d’autres choses :

§ en condition de carence : elle utilise les acides aminés pour la production d’ATP, lorsqu’il
n’y a ni graisses, ni sucres ;
§ en condition d’excès : l’excès en citrate sort de la cellule pour la synthèse des acides gras,
puis utilisation de ceux-ci dans la production d’ATP.
Pour passer du cytosol à la mitochondrie : la membrane externe est relativement étanche et les
protéines traversent cette membrane qui est relativement hydrophobe.
B. Moyens d’étude de la mitochondrie

Pour passer du cytosol à la mitochondrie, nous avons un passage des molécules par des passages
hydrophobes.
Techniques d’observation et d’analyse :
§ Nous cassons au préalable de la membrane externe en mettant la mitochondrie dans une

solution hypotonique. Nous effectuons par la suite une centrifugation différentielle.
§ En utilisant le ME, nous pouvons reconstruire des images 3D : nous faisons plein d’images
en tournant notre mitochondrie dans l’espace.
Par des calculs mathématiques poussés, nous créons une image 3D : le tomogramme.
§ les microtubules sont liés à la mitochondrie car les ils permettent le déplacement des
organites au sein de la cellule ;
§ les mitochondries ont des formes différentes selon leur localisation.
163 Année 2017 - 2018

Fractionnement de la mitochondrie en ses différents constituants.
C. Génome de la mitochondrie, sa réplication et son expression

Le génome mitochondrial est circulaire, comme les génomes bactériens. C’est le plus petit génome
chez l’Homme (16 500 pb). Il se réplique à partir d’une seule origine de réplication, donc deux fourches
de réplication. En faisant du sport, nous pouvons augmenter jusqu’à 5 fois la quantité de
mitochondries cellulaire normale. Il y a plusieurs dizaines de copies d’ADN par mitochondrie
regroupées en nucléoïdes, il n’y a pas d’histones.
Productions des protéines de la mitochondrie par deux systèmes génétiques différents.
Organisation du génome de la mitochondrie de l'être humain.
La mitochondrie est une structure qui se modifie soit par fusion de plusieurs mitochondries, soit
par fission en donnant plein de petites mitochondries. C’est le même mécanisme chez les bactéries.
Ce sont donc des structures extrêmement dynamiques.
ÙÙ
Hétéroplasmie. – Coexistence de mitochondries normales et porteuses de mutations au sein
d'une même cellule ou d'un même tissu.
Fission et fusion des mitochondries.

L’expression du génome mitochondrial est particulière : il n’y a pas d’introns (chez l’Homme). Il y
a un seul promoteur. L’ADN mitochondrial est transcrit en ARN et produit deux ARN car chaque brin
est transcrit et chaque transcrit représente la totalité du génome mitochondrial. Ces ARN sont clivés
au niveau du signal pour séparer les séquences codantes. 90 % de l’ADN transcrit n’est pas codant. Ces
90 % seront par la suite dégradés.
Les protéines synthétisées par la mitochondrie sont au nombre de 13 et vont être amenées pour
la plupart dans l’espace inter-membranaire pour la chaîne respiratoire. Les autres protéines présentes
dans la mitochondrie viennent donc du cytosol (environ 2000 - 13).
Synthèse de protéines dans la mitochondrie.
D. Démonstration du transport par des méthodes biochimiques
Comment démontrer le transport des protéines du cytosol dans la mitochondrie ?
Nous prenons un extrait de protéines de levures par exemple. Si nous ajoutons des mitochondries
purifiées à ces protéines, elles rentreront à l’intérieur. Pour vérifier si les protéines sont bien rentrées,
nous mettons des protéases, qui digèrent ces dernières. Si nous analysons les protéines non rentrées,
nous ne retrouverons pas de fragments de l’extrait de protéines.
Par génie génétique, nous pouvons modifier une protéine et voir si en rajoutant une séquence
particulière, la protéine en question rentrera à l’intérieur de la mitochondrie. Si cette protéine
modifiée rentre dans la cellule, cela signifie que la séquence rajoutée est un peptide signal.
Le peptide signal nécessaire à l’entrée de la protéine dans la mitochondrie se trouve en N-

terminal. Il est clivé une fois la protéine à l’intérieur de la mitochondrie. Les protéines traversent la
membrane mitochondriale, le font à un endroit où les deux membranes sont très proches. Si la
protéine ne rentre pas dans la mitochondrie, elle subit une modification par la trypsine.
165 Année 2017 - 2018

E. Translocation dans la matrice de la mitochondrie
Séquence de signalisation en hélice α amphipathique du cytochrome oxydase transportée dans la mitochondrie.
Les protéines reconnaissent le récepteur à surface de la mitochondrie grâce au peptide signal

(mélange d’AA polaires et chargés positivement) qu’elles possèdent en N-terminal. Une fois le
récepteur reconnu, elles passent à travers des canaux de translocation. Ces derniers permettent à la
protéine de passer à travers la membrane sans entrer en contact avec elle. C’est le même principe
qu’un pore nucléaire en plus petit.
Il existe plusieurs types de complexes de translocation dans les membranes mitochondriales :
§ TOM et SAM, qui sont localisés dans la membrane externe. Ils permettent l’entrée de
protéine cytosolique dans l’espace inter-membranaire ou l’insertion de protéines dans la
membrane externe, comme les porines.
§ TIM22, TIM23 et OXA, qui sont localisés dans la membrane interne
- TIM23 permet l’entrée de protéines situées dans l’espace inter-membranaire
dans la matrice mitochondriale ;
- TIM22 permet l’insertion des protéines dans la membrane interne ;
- OXA permet la sortie de la matrice de certaines protéines d’origine
mitochondriale.
Protéines de translocation à travers la membrane de la mitochondrie.
1. Mécanisme de transport des porines

Les porines sont des protéines transmembranaires de la membrane externe mitochondriale qui
favorisent la diffusion des petites molécules et des ions à travers cette membrane. L’importation de
ces protéines requiert la participation du :
§ complexe TOM pour le passage du cytosol vers l’espace inter-membranaire ;
§ complexe SAM pour l’insertion dans la membrane externe mitochondriale.

Intégration des porines dans la membrane mitochondriale externe.
2. Mécanisme de transport des protéines du cytosol vers la matrice

§ Fixation d’une protéine sur un récepteur de la membrane externe mitochondriale ;
§ Prise en charge par le complexe TOM : elle défile à travers cette translocase de la
membrane externe. Dès que la protéine est sortie du complexe TOM, elle rentre dans le
complexe TIM 23 (nous pouvons considérer ça comme une seule étape). Elle passe alors
à travers la membrane interne et arrive dans la matrice mitochondriale.
§ Le peptide signal est clivé par une signal peptidase pour générer une protéine mature.
3. Mécanisme de transport des protéines qui restent accrochées sur la

membrane interne et qui restent dans l’espace inter-membranaire
Il y a deux possibilités:
§ la protéine est importée par la voie TOM-TIM23 : une fois la protéine dans la matrice
mitochondriale, le peptide signal est clivé. Ce clivage démasque un second peptide
signal, qui est reconnu par le complexe OXA. Ceci permet l’ancrage dans la membrane
interne par cette nouvelle extrémité et le retour de la majeure partie de la chaîne
peptidique dans l’espace intermembranaire.
Importation des protéines du cytosol dans la membrane mitochondriale interne.
167 Année 2017 - 2018

§ La protéine est importée par les complexes TOM-TIM23 mais la présence d’une
séquence d’arrêt de la translocation en aval du peptide signal arrête la
translocation à ce niveau dans la membrane interne.
Importation des protéines du cytosol dans la membrane mitochondriale interne.
4. Mécanisme de transport des protéines qui sont libérées dans l’espace inter-
mbr
Libération des protéines dans l'espace intermembranaire.
5. Mécanisme de transport des protéines à segments transmembranaires

multiples dans la membrane mitochondriale interne
Importation des protéines à segments transmembranaires multiples dans la membrane mitochondriale interne.
6. Transport des lipides du RE vers la mitochondrie

Ils sont d’abord synthétisés dans le RE et transportés jusqu’à la membrane via des protéines
d’échange, et non synthétisés de novo.
Transport des phospholipides du RE dans la mitochondrie.

X. Le cas des peroxysomes

A. Introduction
Le peroxysome est riche en enzymes d’oxydation et ne contient pas d’ADN ou de ribosomes
B. Ce qu’il se passe dans les peroxysomes

Les peroxydes n’ont qu’une simple membrane relativement imperméable. Il faut donc un
transport pour passer de part et d’autre de la membrane. Les ROS (Reactive Oxygen Species) sont des
molécules réactives qui sont capables de faire des dommages dans la cellule (par cette production de
peroxyde d’hydrogène). Il faut donc des moyens de dégradation de ces peroxydes !
Cependant, ces peroxydes ne sont pas que des dangers potentiels. Nous avons des enzymes (très
présentes dans les peroxysomes) qui sont des sites essentiels d’utilisation de l’oxygène, où il y a la
réaction d’oxydation avec le dioxygène et de peroxydation avec H2O. Les enzymes présentes dans les
peroxysomes sont la catalase et de l’urate-cyclase. Ces oxydations se font sur des groupements
phényles, acide formique, formaldéhyde et éthanol. L’éthanol est oxydé en acétyl-aldéhyde (25 %).
La production d’acétyl-coA se fait dans la mitochondrie généralement mais peut se faire dans les
peroxysomes.
Dans les peroxysomes des cellules de Schwann, nous avons fabrication des plasmalogènes qui
sont des phospholipides particuliers abondants dans les gaines de myéline.
C. Importation de tout le contenu à partir du cytosol

Le peptide signal d’adressage vers les peroxysomes est très simple : « S-K-L » – PTS1 (majorité des
cas) - Localisé en C-terminal. (PTS2 : localisé dans la partie N-terminale).
Consommation d’ATP pour le transport.
Pathologie Ù Syndrome de Zellweger. – Maladie héréditaire mortelle dans laquelle un défaut

d’importation des protéines dans les peroxysomes.
Le peptide signal d’adressage au peroxysome est reconnu par une protéine soluble qui va aller se
fixer sur la membrane du peroxysome et se fixer à une troisième protéine.
Quand le peptide est retiré, dans le peroxysome, la protéine soluble est libérée dans le peroxysome.
D. Biogenèse et division des peroxysomes

Nous pensons que les peroxysomes viennent du RE parce que nous avons des protéines similaires
dans les membranes des deux organites. Stress oxydant : nous avons plus de peroxysomes.
Modèles pour la formation et la production de peroxysome.
169 Année 2017 - 2018

Fiche résumé Maturation et Transport des constituants de la cellule
Généralités § Pulse Chase : usage de la radioactivité sur une protéine. On suit le déplacement de la protéine dans la cellule à l’aide d’images de cellules
mortes.
§ GFP : étiquette en N ou Cterm. On forme un ADNc qui sera traduit. La protéine produite est endogène. Il y a un suivi possible de la
fluorescence sur des cellules vivantes.
- La traduction a toujours lieu dans le cytoplasme.
- Les protéines disposent de signaux d’adressage.
- Les protéines sont des structures qui se replient progressivement (souvent à
l’aide de protéines chaperons hsp70/40/60) et subissent des contrôles de
qualité.
ð Si elles sont mal repliées elles ont tendance à s’agréger et sont toxiques.
- Les protéines peuvent être modifiées de façon covalente réversible ou
irréversible.
- La poly-ubiquitinylation marque les protéines vers la dégradation par le
protéasome.
ð Attention ! Pas de corrélation systématique entre la quantité d'ARNm et la quantité de la protéine correspondante.
- Les pores nucléaires (composés de nucléoporines principalement et d’autres protéines) empêchent la diffusion de molécules de poids
Noyau
moléculaire >30kD.
- NLS est le signal de localisation nucléaire.
ð L’importine permet le transport de la protéine portant le
signal NLS du cytosol vers le noyau = transport régulable.
ð L’exportine permet le transport inverse.
- La direction du transport dépend de l'asymétrie de
concentration de Ran-GDP (cytosol)et de Ran-GTP (noyau).
- Les membranes biologiques sont des barrières
hydrophobes.

Réticulum - REL = lieu de séquestration du Ca2+.

Endoplasmique - La protéine dispose d’un "peptide signal" hydrophobe, qui est reconnu par une protéine SRP, elle-même reconnue par son récepteur.
Ce complexe permet de mettre la protéine dans le translocon (un canal à travers la membrane du RE) et permet cotraductionnellement
une translocation des protéines vers le RE.
- La topologie d'une protéine transmembranaire est conditionnée par la succession de

peptides de départ et d'arrêt de transfert à travers la membrane.
- L'exoplasme (dont l'intérieur du RE) est oxydant : conséquence sur les ponts disulfures qui
peuvent se former.
- Il y a une maturation et un contrôle de qualité dans le RE. Le contrôle de qualité est permis
à l’aide de la calnexine et l’utilisation d’oses comme signaux de bons ou mauvais
repliements.
- Les protéines mal repliées sont rétro-transloquées et dégradées dans le cytoplasme par le
protéasome (système ERAD).
- L'UPR est une réponse à l’accumulation de protéines mal repliées.
- Ancre GPI (attachement des protéines au feuillet exoplasmique de la membrane).
- Le RE a un rôle dans la détoxification.
- Il est possible de synthétiser une protéine dans un système in vitro.
- Il y a un contrôle de la sortie du RE à l’aide du signal de rétention KDEL.
- Le transport entre les différents compartiments de la cellule se fait par l’utilisation de vésicules entourées de manteaux dont il faut
savoir la localisation.
- La dynamine est une GTPase permettant de libérer la vésicule du compartiment initial.
171 Année 2017 - 2018

- Sar 1/ Sec 23 et24 permettent de former des manteaux.

- Les protéines Rab permettent de guider les vésicules.
- Les protéines SNARE permettent la fusion vésiculaire par un complexe de 4 SNARE.
Appareil de - L'appareil de Golgi est un organite polarisé et dispose de deux modèles pour expliquer le transport en son sein.
Golgi - Il a différents rôles comme la maturation des protéines.
- Il y a une acidification progressive dans les compartiments intracellulaires :
- Les lysosomes fusionnent avec les endosomes tardifs, les autophagosomes et les phagosomes.
- La voie de ciblage vers le lysosome dépend du mannose-6-phosphate.
- La sécrétion est constitutive (matériel extracellulaire, protéines membranaires et non membranaires, lipides) et régulée.
- On trouve maturation protéolytique dans les vésicules de sécrétion.
- Les vésicules de sécrétion permettent de concentrer leur cargaison.
- Exocytose, endocytose, transcytose.
- Immunomarquage en microscopie électronique utilisant des anticorps couplés à des billes d'or.
Mitochondries - Elles ont un rôle dans la production d’ATP.

- Elles disposent d’un génome circulaire à un seul promoteur.
- Pour la translocation dans la matrice usage de complexes : TOM : passage du
cytosol vers espace intermembranaire ; SAM : entrée dans la membrane
externe ; TIM 22 : insertion dans la membrane interne 23 : permet l’entrée dans
la matrice ; OXA : sortie de la matrice.

Matrice extracellulaire et adhésion cellulaire

I. MEC : ensemble structuré de macromolécules mis en place

par les cellules dans leur environnement immédiat
Épithélium. – Tissu mince formé d'une ou de plusieurs couches de cellules jointives, reposant sur
une lame basale. On distingue les épithéliums de revêtement qui constituent la couche superficielle
de la peau [épiderme] et des muqueuses, et les épithéliums glandulaires qui ont une fonction de
sécrétion.
Tissus conjonctifs. – Tissus constitués de cellules séparées par de la MEC et faisant jonction entre
les autres tissus. Cette définition est suffisamment large pour rendre compte des divers aspects
retenus par cette classification : la MEC peut être souple et fibreuse (tissus conjonctifs lâches,
réticulaires, denses, élastiques) ou très cellulaire (tissu adipeux) ou bien solide (cartilage) ou même
solide et minéralisée (tissu osseux).
Deux mécanismes principaux de résistance aux stress mécanique.
Le tissu épithélial repose sur une lame basale et, en dessous, sur un tissu conjonctif. Ils sont
capables de résister aux contraintes mécaniques. Il est essentiel de séparer les différents
compartiments. Le tissu conjonctif résiste aux phénomènes de compression et d'étirement.
Les tensions mécaniques sont transmises de cellules en cellules par des filaments du
cytosquelette ancrés à la matrice extracellulaire et aux sites d’adhésion intercellulaire. La matrice
extracellulaire supporte directement les contraintes mécaniques de tension et de compression.
La matrice extracellulaire contient schématiquement des protéines fibreuses et des molécules

saccharidiques qui constituent la « substance fondamentale ». Elle est produite et orientée par les
cellules qui l’habitent (fibroblastes).
II. Tissus conjonctifs

A. Des propriétés mécaniques très diverses
Les composants de la MEC forment un gel plus ou moins compact : derme, tendons, os, cartilage,
humeur vitrée.
173 Année 2017 - 2018

B. Les collagènes sont les principaux constituants protéiques EC des TC

Les collagènes sont codés par quarante-deux gènes différents, et il existe le même nombre de
collagènes différents. Le collagène est une triple hélice qui forme des fibrilles reliées les unes aux
autres, enroulées. Les hélices comportent une glycine tous les trois résidus et sont très riches en
prolines. Trois hélices associées en triple hélice. C’est un autoassemblage en fibrilles, de 10 à 300 nm.
Stabilisés pour former une macrostructure, ce sont des câbles très rigides très résistants fabriqués par
la cellule. Les propriétés mécaniques différentes sont dues aux types de collagène et à leur proportion.
Les collagènes constituent 25 % de la masse totale des protéines.
Les événements intracellulaires et extracellulaires conduisant à la formation d’une fibrille de

collagène : notez que le procollagène s’assemble en fibrilles de collagène dans l’espace
extracellulaire, souvent à l’intérieur de grands replis de la membrane plasmique. En exemple de la
façon dont les fibrilles de collagène en rangées bien ordonnées dans l’espace extracellulaire, on les
montre ensuite s’assemblant en grosse fibre de collagène, visibles au microscope optique (MO). Les
liaisons covalentes croisées qui stabilisent les assemblages extracellulaires ne sont pas montrées dans
ce schéma.
C. Structure des collagènes

Ce sont des triples hélices, organisées en fibrilles reliées entre elles par d’autres collagènes.
Événements conduisant à la synthèse d'une fibrille de collagène.

D. Les fibres élastiques sont composées d’élastine

On observe beaucoup de fibres élastiques dans la couche externe de l’aorte. Ces fibres sont
capables de s’étirer et de se relaxer, d’où la notion de vasodilatation et de vasoconstriction pour les
vaisseaux sanguins. Les molécules sont reliées les unes aux autres par des liaisons covalentes (liaisons
croisées) ce qui conduit à la formation d’un réseau entrecroisé. Dans ce modèle, chaque molécule
d’élastine faisant partie du réseau, peut s’étirer et se rétracter d’une façon semblable à celle d’un
ressort si bien que l’ensemble de la structure puisse s’étirer et se rétracter comme un ruban
élastique.
Étirement d'un réseau de molécules d'élastine.
E. La fibronectine est une protéine à multiples domaines qui aide les

cellules à s’attacher et qui organise la matrice extracellulaire
Dimère de grande taille, joints par des ponts disulfures en C-terminal, les fibronectines sont
caractéristiques des protéines de la matrice ; ces protéines présentent des domaines sur lesquels il y a
capacité de liaison avec un ligand (héparine, collagène, auto-association, liaison aux cellules). La
séquence « RGD » et la séquence « synergie » (en rouge) constituent une partie du site principal de
liaison aux cellules et sont très importantes pour la liaison.
Structure d'un dimère de fibronectine.
Déroulement d’un domaine de fibronectine type III en réponse à une tension. L’étirement de la
fibronectine dans le sens des flèches expose des sites de liaison qui provoquent l’assemblage des
molécules de fibronectine ainsi étirées en filaments.
F. Polysaccharides et protéines de la matrice

§ Les glycosaminoglycanes (GAG)
Les GAGs hydratent les matrices, ils forment un gel hydrique. Ils correspondent à une répétition
de disaccharides : N-acétylglucosamine et acide glucuronique (ce dernier est, la plupart du temps,
sulfaté). Il peut y avoir jusqu’à vingt-cinq mille répétitions. Le seul n’étant pas sulfaté est présent dans
l’acide hyaluronique, qui peut occuper un très grand volume.
175 Année 2017 - 2018

Répétition de disaccharides dans un héparane sulfate.
§ Les protéoglycanes : liaison des GAG (O-glycosylation) à des protéines de la matrice
Association covalente entre un ou plusieurs GAGs sur l'O-Glycosylation des protéines de la

matrice, par l’intermédiaire d’un tétrasaccharide de liaison. Cet ajout du tétrasaccharide de liaison se
fait sur la sérine de la protéine.
Schéma d'un protéoglycane.
III. La lame basale

Feuillet fin (généralement 40 à 120 nm), résistant et flexible, constitué de molécules de la matrice,
sous-jacent à tous les épithéliums. Elle entoure aussi individuellement les cellules musculaires,
adipeuses et les cellules de Schwann qui enveloppent les axones des cellules nerveuses.
A. Introduction : des fonctions variées

Nous les retrouvons dans de multiples régions : au niveau du pôle basal des épithéliums pour les
séparer du tissu conjonctif, au niveau du rein pour former la barrière entre le sang et l'urine primitive
(elle a ici une fonction de filtre en plus de sa fonction de support aidant à sélectionner les molécules
qui passeront dans l'urine à partir du sang). Et enfin, au niveau des muscles, les lames basales séparent
les cellules musculaires du tissu conjonctif.
B. Les laminines sont les composants principaux des lames basales

Principale glycoprotéine de la lame basale, elle est composée de trois polypeptides reliés par des
ponts disulfures, un α (possédant des domaines de liaison avec les intégrines, le dystroglycan et le
perlécan), un β (pour l’autoassemblage), et un γ (pour la liaison au nidogène).

Structure de la laminine.
C. Le collagène IV donne à la lame basale sa force élastique

Le collagène IV est responsable de la force élastique de la lame basale. Elle est formée par des
interactions spécifiques entre les protéines, laminines, collagène IV, nidogène, protéoglycane et
perlécan. Les lames basales jouent un rôle dans la reformation des jonctions neuromusculaires après
une lésion.
Expérience : lorsque nous laissons se régénérer le nerf mais pas le muscle, après une lésion à la
fois musculaire et nerveuse, la lame basale jonctionnelle dirige le nerf qui se régénère vers le site
synaptique d’origine. Lorsqu’on laisse se régénérer le muscle, mais pas le nerf, la lame basale
jonctionnelle provoque l’accumulation des récepteurs à l’acétylcholine néoformés (en bleu) au niveau
du site synaptique d’origine. Le muscle se régénère à partir des cellules satellites localisées entre la
membrane basale et la cellule musculaire d’origine. Conclusion : la lame basale contrôle la localisation
des composants synaptiques des deux côtés de la lame.
Rôle de la lame basale dans la reformation de la jonction neuromusculaire après une lésion.
IV. Jonctions cellulaires

Il existe trois types de jonctions dans un épithélium :
§ les jonctions étanches ou jonctions serrées (= zonula occludens) limitent les tissus ;
§ les jonctions d’ancrage assurent une cohésion mécanique forte ;
177 Année 2017 - 2018

§ les jonctions communicantes (gap junctions) sont des structures de communication cellulaire qui
servent d’intégrateurs métaboliques.
Jonctions serrées Jonctions d'ancrage Jonctions communicantes
A. Jonctions serrées
Elles forment une barrière moléculaire entre cellules adjacentes dans un épithélium. Ces liaisons
entre cellules adjacentes sont assurées par des protéines transmembranaires : les claudines et
occludines (quatre passages transmembranaires et domaine extracellulaire court). Ces protéines sont
elles-mêmes liées à des protéines de jonctions ZO1 et ZO2.
Pour la liaison avec la cellule adjacente, les claudines et occludines dans la membrane,
interagissent par leur domaine extracellulaire avec les claudines et occludines de l’autre cellule. Nous
appelons cela un « brin de scellement ».
Un modèle de jonction serrée.
B. Jonctions d’ancrage
cellule / cellule Cellule / MEC
(cadhérines) (intégrines)
contact focal = plaque

Actine jonction adhérente
adhérente
Filaments intermédiaires desmosome hémidesmosome

§ Les jonctions adhérentes

Elles relient les microfilaments d’actine de deux cellules adjacentes par le biais de cadhérines. Il
existe plus de cent-quatre vingt types de cadhérines chez l’Homme. Le domaine extracellulaire d’une
cadhérine classique (cadhérine-C) est présenté ici, deux de ces molécules, sur deux cellules opposées,
contractent des liaisons homophiles queue à queue.
Le domaine extracellulaire de chaque polypeptide consiste en une série de domaines compacts

appelé motif répétitif de cadhérine. Le Ca2+ se lie près de chaque charnière, l’empêchant de se plier.
En absence de Ca2+, la molécule s’effondre et la liaison ne peut se faire. Les chaînes sont organisées
en parallèle ; nous pensons qu’elles n’interagissent pas uniquement avec leur N-terminal, mais aussi
sur leurs côtés.
Les cadhérines classiques sont liées à l’actine, de manière indirecte, par l’intermédiaire de la β-
caténine et d’autres protéines d’ancrage. La caténine p120 se lie à la queue cytoplasmique de la
cadhérine et en contrôle le fonctionnement. La β-caténine possède aussi un rôle important dans la
transmission des signaux intracellulaires.
§ Les plaques d’adhérence, dépendantes des intégrines

La tête de la molécule d’intégrine s’attache directement à une protéine extracellulaire comme la
fibronectine ; la queue de l’intégrine (intracellulaire) se lie à une protéine, elle-même liée à un filament
d’actine.
§ Les desmosomes
À la surface de chacune des membranes plasmiques qui interagissent se trouve une plaque dense
composée d’un mélange de protéines intracellulaires d’ancrage. Les filaments intermédiaires sont fixés
à ces plaques denses. Des protéines de la famille des cadhérines se lient à la plaque et interagissent
par leur domaine extracellulaire.
Mécanisme moléculaire : couplent l’adhésion intercellulaire aux filaments intermédiaires de deux

cellules adjacentes. Leur composition moléculaire est plutôt complexe : les microfilaments
intermédiaires ne sont pas liés les uns aux autres, ils sont ancrés dans une plaque cytoplasmique dense,
constituées de desmoplakine elle-même liée à la desmocolline ou la desmoglénine (qui sont des
cadhérine) par l’intermédiaire de plakoglobine et plakophilline.
179 Année 2017 - 2018

§ Les hémidesmosomes
Les filaments intermédiaires sont liés aux intégrines (par le biais de dystonine et plectine) elles-
mêmes liées à la laminine extracellulaire, composant essentiel de la MEC. Les intégrines peuvent
contrôler l’adhésion cellule matrice. En l’absence de ligand extracellulaire, les molécules d’intégrine
paraissent petites et fortement repliées. Lors de la liaison au ligand, les intégrines se déroulent et
s’ouvrent en une structure étirée comportant deux jambes distinctes.
C. Les jonctions communicantes (gap junctions)

Chaque bicouche lipidique est représentée sous forme de double feuillet rouge. En vert, les
jonctions communicantes, sont formées par la division en vis-à-vis de deux canaux transmembranaires
(connexons, eux-mêmes composés de six connexines). Les molécules pouvant diffuser librement ont
un poids molécules < 1 kDa.
Jonctions communicantes.
V. Conclusion

Communications cellulaires chimiques et leur régulation

I. Introduction
Trois voies de communication :
§ Signalisation à distance par sécrétion de médiateurs chimiques, qui sont soient des
molécules hydrophiles, soient des molécules hydrophobes :
- les molécules hydrophiles ne pouvant rentrer spontanément dans la cellule, se
fixent à des récepteurs de la membrane plasmique.
Médiateur chimique agissant à distance.
- les molécules hydrophobes voyagent dans des transporteurs et sont capables de

diffuser à travers la membrane plasmique. Elles agissent sur un récepteur
nucléaire entraînant des modifications de la transcription par exemple.
Médiateur chimique agissant à distance.
ÙÙ
Récepteur. – Protéine qui lie une molécule de signalisation extracellulaire (ligand) et entraîne
une réponse de la cellule qui en exprime le gène. Les récepteurs situés à la surface des cellules, tels
que le récepteur de l’acétylcholine par exemple ou le récepteur de l’insuline sont localisés dans la
membrane plasmique avec leur site de liaison du ligand tourné vers le milieu extracellulaire. Les
récepteurs intracellulaires, tels que les récepteurs des hormones stéroïdes, lient les ligands qui
diffusent à l’intérieur de la cellule à travers la membrane plasmique.
181 Année 2017 - 2018

§ Signalisation entre cellules par des molécules associées à la membrane. Un ligand est
ancré dans la membrane d’une cellule et le récepteur est présent dans la membrane
d’une autre cellule. C’est ce que l’on appelle la signalisation par contact entre cellules.
Signalisation par contact entre cellules.
§ Signalisation de cellule à cellule via des jonctions ouvertes « gap junction ».
Signalisation de cellule à cellule via des jonctions communicantes.
II. Principes généraux de la communication chimique

A. Classification selon la distance parcourue par la molécule de signalisation
1. Signalisation endocrine
Signalisation à distance par des petites molécules diffusibles (hormones), libérées dans la
circulation, puis reconnues par un récepteur sur lequel elles se fixent induisant un signal.
Signalisation endocrine.
ÙÙ
Endocrine (signalisation). – Mode de communication mettant en jeu la sécrétion d’hormones
dans le sang par des cellules spécialisées, telles que celles de la thyroïde ou de l’hypophyse.

2. Signalisation synaptique
La signalisation synaptique s’effectue par les neurones, qui transmettent des signaux électriques
le long de leurs axones, et libèrent des neurotransmetteurs au niveau des synapses, souvent localisées
très loin des corps cellulaires (nous avons des prolongements de l’ordre du mètre). C’est la base de la
signalisation dans le SNC et SNP.
Signalisation synaptique.
ÙÙ
Synapse. – Jonction qui permet la communication entre une cellule nerveuse et une autre cellule.
Dans une synapse dite chimique, la communication est assurée par une molécule de
neurotransmission diffusible ; dans une synapse dite électrique, une connexion directe est assurée
entre les cytoplasmes de deux cellules via des jonctions ouvertes ("gap junction").
3. Signalisation paracrine et autocrine

ÙÙ
Paracrine (signalisation). – Communication de cellule à cellule, de courte portée, exercée via des
molécules de signalisation sécrétées par une cellule ou un groupe de cellules, qui agissent sur les
cellules du voisinage.
Exemple Ù Coagulation. – La coagulation est activée uniquement de manière locale ; certaines

pathologies entraînent la coagulation dans tout le système vasculaire, pouvant entraîner la plupart
du temps la mort de l’individu.
Signalisation paracrine.
Autocrine (signalisation). – Type de communication au cours de laquelle une cellule sécrète une
ÙÙ
molécule de signalisation qui agit sur elle-même ou sur des cellules du voisinage du même type.
183 Année 2017 - 2018

B. Caractéristiques de la signalisation chimique

1. Signalisation endocrine par sécrétion d’une hormone qui agit sur des cellules
cibles qui portent un récepteur spécifique de l’hormone
Les cellules endocriniennes sécrètent des hormones dans le sang et celles-ci n’agissent que sur
les cellules cibles spécifiques qui portent le récepteur approprié : ces récepteurs lient l’hormone
spécifique que la cellule retire donc du liquide intracellulaire.
Signalisation endocrine.
2. Signalisation synaptique par libération d’un neurotransmetteur qui agit sur

les cellules cibles selon le mode synaptique ou paracrine
Dans la signalisation synaptique, par contre, la spécificité provient des contacts synaptiques entre
une cellule nerveuse et les cellules cibles spécifiques auxquelles elle délivre un signal. En général, seule
la cellule cible qui est en communication synaptique avec la cellule nerveuse est exposée aux
neurotransmetteurs libérés de la terminaison nerveuse.
Signalisation synaptique en une milliseconde.

3. Réponses différentes au même signal chimique par interaction avec

§ Des récepteurs identiques qui activent des modes de réponse différents
Exemple. – L’acétylcholine se fixe sur des récepteurs muscariniques couplés aux protéines G
présents sur les cellules de la glande salivaire. Cela entraîne la sécrétion de salive. Le même
récepteur au niveau des cellules cardiaques entraîne une diminution de la tension, diminution du
rythme cardiaque.
§ Des récepteurs différents exhibés par des cellules différentes
Exemples
§ Cellule du muscle cardiaque : les récepteurs muscariniques stimulés par l’acétylcholine
entraînent une diminution de la force et la vitesse de contraction.
§ Cellule du muscle squelettique : les récepteurs nicotiniques stimulés par l’acétylcholine
entraînent la contraction de la cellule.
§ Cellule de la glande salivaire : les récepteurs muscariniques stimulés par l’acétylcholine
entraînent une sécrétion de salive.
Réponses différentes à la même molécule de signalisation chimique.
4. Plusieurs sortes de molécules de signalisation

§ Molécules hydrophiles.
§ Molécules hydrophobes : stéroïdes (dérivés du cholestérol), vitamine D, acide rétinoïque

(dérivé de la vitamine A utile dans la différenciation cellulaire).
§ Molécules gazeuses (NO, CO) : le monoxyde d’azote est un gaz synthétisé de façon
endogène par beaucoup de cellules, et contrôle le diamètre des capillaires sanguins.
Fonctionnement : la fixation de l'acétylcholine sur son récepteur entraîne l'activation d’une

enzyme qui synthétise du NO. Le NO diffuse très rapidement à travers les membranes, et se fixe sur
un récepteur spécifique, qu’on appelle une guanilyl-cyclase qui va fixer le NO, synthèse de GMPc, dans
la cellule de la paroi du capillaire : la cellule musculaire se relaxe, par phosphorylation de la myosine,
et diminution de concentration intracellulaire en calcium " vasodilatation. Le GMPc produit est
ensuite dégradé dans la cellule musculaire par une phosphodiesterase.
185 Année 2017 - 2018

Mécanisme d'action du monoxyde d'azote dans la relaxation du muscle lisse de la paroi d'un vaisseau sanguin.
Pathologie Ù Angor (ou angine de poitrine). – L’angor (ou angine de poitrine) est dû à une
ischémie du myocarde, généralement secondaire à une sténose coronarienne. Ce rétrécissement
des artères nourricières du cœur est provoqué par la formation d’une plaque d’athérome
entraînant une inadéquation entre les besoins en dioxygène du myocarde et les apports par la
circulation coronarienne.
Il existe des traitements :

§ la nitroglycérine : entraîne l’augmentation de la concentration de NO et donc la
vasodilatation des coronaires et permet l'augmentation de perfusion du cœur ;
§ la trinitrine : production exogène en NO.
Application médicale Ù Viagra. – Le viagra est un inhibiteur de la phosphodiesterase qui prolonge

l’activité du NO, vasodilatation prolongée qui aide à l'érection prolongée.
5. Deux types de récepteurs

§ Récepteur à activité intranucléaire : famille des récepteurs nucléaires.
Super famille des récepteurs nucléaires, récepteur dans sa forme active.

Fonctionnement : les hormones liées à des transporteurs sont transportées dans la circulation
sanguine, puis larguées près de la cellule possédant le récepteur. Elles diffusent à travers la membrane
plasmique et se fixent aux récepteurs nucléaires, possèdent un domaine de liaison à l’ADN. Ce
récepteur nucléaire fixé à l’hormone peut modifier le programme d’expression génique.
Quand le récepteur n’est pas « ligandé » ou lié à des antagonistes, lors de la fixation du ligand au
LBD (Ligand Binding Domain), changement de conformation du récepteur, qui va larguer la protéine
inhibitrice, et activer le DBD (DNA Binding Domain), activateurs ou répresseurs de la transcription.
§ Récepteurs portés par la membrane plasmique
- Canaux ou ionotropes ;
Récepteurs canaux ou ionotropes.
- Récepteur couplé aux protéines G : le plus abondant en terme de diversité

(récepteur à 7 domaines transmembranaires qui active la protéine G pour
transduire un signal par formation d’AMPc par exemple).
Récepteurs couplés aux protéines G.
- Récepteurs à activité catalytique (sérine-thréonine kinase ou tyrosine kinase).
Récepteurs à activité catalytique ou liés à une enzyme.
187 Année 2017 - 2018

6. Activité des récepteurs relayée par des petites molécules et un réseau de

protéines de signalisation intracellulaire
Modèle de voie intracellulaire de signalisation.
7. Désensibilisation des cellules cibles à la stimulation extracellulaire
Différentes voies de désensibilisation à une molécule de signalisation.
III. Transport des petites molécules à travers la membrane
A. Introduction
La bicouche lipidique de la membrane plasmique sert de barrière au passage de la plupart des
molécules polaires. D’où la nécessité de protéines insérées dans la membrane plasmique pour assurer
le transport sélectif des ions inorganiques et des petites molécules organiques solubles. Entre 15 et
30 % des gènes de protéines membranaires sont des gènes de protéines impliquées dans ce type de
transport.

Les mécanismes de transport à travers les autres membranes de la cellule sont similaires à ceux
qui permettent le passage à travers la membrane plasmique.
Pour le calcium et le magnésium, les valeurs ci-dessous ne représentent que le Mg2+et le Ca2+
libres, car ils peuvent être liés à des protéines. Il y a ainsi environ 20nM de Mg2+ et 2mM de Ca2+en
intracellulaire au total.
Concentration intracellulaire Concentration extracellulaire

+
Na 5-15 145
+
K 140 5
cations
2+
Mg (libre) 0,5 1-2
2+ -4
Ca (libre) 10 1-2
+ -5 -7,2 -5 -7,4
H 7.10 (ou 10 ou pH = 7,2) 4.10 (10 ou pH = 7,4)
Cl-
an.
5-15 110
B. Principes du transport à travers la membrane

1. Imperméabilité de la bicouche lipidique aux ions
Perméabilité relative d'une bicouche lipidique de synthèse à différentes classes de molécules.
Pour le calcium libre dans la cellule, sa concentration intracellulaire, est 1000 fois inférieure à sa
concentration extracellulaire. Vu les concentrations ioniques, on pourrait penser que la cellule est
chargée négativement, or c’est faux. En effet, même s’il y a beaucoup d’anions portés par les
constituants cellulaires (protéines, etc.), même si le calcium libre est faible, le calcium est aussi présent
dans la cellule sous forme non libre, notamment stocké dans les mitochondries et RE (R.
sarcoplasmique des cellules musculaires), ou complexés à des protéines empêchant sa forme libre.
Le taux de passage des ions, entre deux compartiments intracellulaires, est proportionnel aux
différences de concentrations entre les deux compartiments.
189 Année 2017 - 2018

2. Deux sortes de protéines impliquées dans le transport

§ Protéines de transport (ou transporteurs ou perméases) ;
§ Protéines canaliculaires : transfert de petites molécules (ions), spécifiques à certaines

molécules.
3. Transport passif et transport actif
Comparaison du transport actif et transport passif de molécules non chargées.
Pour les molécules non chargées :

§ soit nous une diffusion simple ;
§ soit nous avons besoin d’énergie (transport actif).
Entre l’extérieur et l’intérieur de la cellule, nous avons un potentiel de membrane (-60mV) qui est
dû aux ions chargés négativement plus importants d’un côté de la membrane que de l’autre. Pour
déterminer si nous avons un transport actif / passif, il faut tenir compte du potentiel de membrane.
C. Protéines de transport et transport actif à travers la membrane

1. Transport assuré par un changement de conformation du transporteur
La protéine peut être sous deux états : état A et B. La transition se fait de manière aléatoire. Elle
est totalement réversible et ne dépend pas de l’occupation du site de liaison par le soluté.
Transport assuré par un changement de conformation du transporteur.

2. Trois sources d’énergie pour le transport actif

§ Par le couplage avec une autre molécule ;
§ Par la consommation d’ATP ;
§ Par la lumière.
Trois sources d'énergie pour alimenter le transport actif.
3. Trois types de transport : uniport, symport et antiport (échangeur)

ÙÙ
Uniport. – Transport d’un soluté unique d’un côté de la membrane à l’autre par une protéine de
transport (qu’on peut appeler uniporteur).
ÙÙ
Symport. – Transport de solutés de deux types à travers la membrane dans la même direction
par une protéine de transport (qu’on peut appeler symporteur).
ÙÙ
Antiport. – Transport d’ions différents ou petites molécules différentes à travers la membrane
dans des directions opposées par une protéine de transport (qu’on peut appeler antiporteur).
Trois types de transporteur.
4. Transporteur actif actionné par des gradients d’ions

Les ions ont tendance à franchir la membrane à travers des protéines de transport selon :
§ leur gradient chimique (déplacement du compartiment où les ions sont les plus
concentrés vers celui où ils le sont moins).
§ le gradient électrique (un ion chargé positivement aura tendance à vouloir aller vers
un compartiment où la concentration en charge négative est plus élevée, et
réciproquement).
191 Année 2017 - 2018

L’ensemble des deux donne le gradient électrochimique. La différence de répartition des charges
positives et négatives de part et d’autre de la membrane implique une différence de voltage appelée
potentiel de membrane qui influe sur l’efficacité du transport engendré par le gradient
électrochimique.
5. Transport des solutés à travers la cellule grâce à une distribution

asymétrique des transporteurs
+
Transport de glc et Na à travers la cellule grâce à la localisation non uniforme des transporteurs dans la mb.
6. Transport actif avec consommation d’ATP
Trois types de pompes actionnées par l'ATP.
§ Les transporteurs de type P

Ces transporteurs possèdent plusieurs sous-unités : β et α, multiples passages
transmembranaires, « type P » car elles se phosphorylent au cours du pompage. Cette classe implique
beaucoup de pompes ioniques : Na+, K+, Ca2+, H+. Nous les retrouvons dans la membrane plasmique
des plantes, des fongus, des bactéries et des eucaryotes supérieurs (pompes Na+/K+).
Les transporteurs de type P.

- Fonctionnement de la pompe Na+ / K+-ATPase
Il y a maintien de l’équilibre osmotique grâce à la pompe Na+/K+ ATPase. Cette pompe va contre
le gradient grâce à l’énergie apportée par l’hydrolyse de l’ATP. Nous avons un cycle : fixation du Na+"
fixation de l’ATP à hydrolyser " phosphorylation de la pompe qui va s’ouvrir. La pompe libère le Na+
contre la fixation d’un K+. Au changement de conformation, il y a libération d’un phosphate. Puis
libération cette fois par changement de conformation, de K+. Cette pompe permet d’établir les
gradients et a donc un rôle pivot dans la survie et le bon fonctionnement cellulaires.
La pompe NA+/K+ (transporteur de type P) dans la membrane plasmique de toutes les cellules animales.
Cycle de pompage de la pompe Na+/K+/ATPase (3 Na+ contre 2 K+).
Des molécules régulent cette pompe comme l'ouabaïne, extrait des graines de strophante glabre
(liane d’Afrique tropicale) bloquant de la pompe Na+/K+-ATPase, glucoside cardiotonique (augmente la
contractilité de la cellule musculaire cardiaque et diminue son excitabilité).
- Maintien de l’équilibre osmotique grâce à la pompe Na+-K+-ATPase
Réponse des globules rouges au changement de l'osmolarité du milieu extracellulaire.
193 Année 2017 - 2018

- Pompes à calcium : Ca2+-ATPase (importante au niveau du R. sarcoplasmique)
2+
Pompage du Ca du cytosol vers le réticulum sarcoplasmique.
ÙÙ
Réticulum sarcoplasmique. – Réseau de membranes internes dans le cytoplasme des cellules
musculaires qui séquestre du Ca2+ à forte concentration ; ce Ca2+ est libéré dans le cytosol au cours
de la contraction du muscle.
- Acidification de l’estomac par l'H+-K+-ATPase
Acidification de la lumière de l'estomac par les cellules pariétales de la paroi gastrique.
Nous retrouvons une acidification de l’estomac par la pompe à protons H+/K+ au niveau apical des
cellules de la paroi. Nous faisons rentrer des ions chlorures, et nous avons formation d’acide
chlorhydrique HCl (son excès forme des ulcères) dans la lumière de l’estomac, l’hyperacidité est à
l’origine de la dégradation des tissus. Les médicaments contre les ulcères sont des inhibiteurs de cette
pompe à protons.
Bloqueurs de la H+/K+-ATPase :
§ Oméprazole (Mopral ®, Losec ®, Logastric ®), disponible en générique depuis 2002 ;
§ Lansoprazole (Dakar ®, Prevaci ®) ; disponible en générique depuis 2007 ;
§ Ésoméprazole (Inexium ®, Nexium ®) ;
§ Pantoprazole (Pantoloc ®) ;
§ Rabéprazole (Pariet ®).

§ Les transporteurs de type F
Les pompes à protons de type F.
Cette pompe à protons à la forme complexe est régulatrice du pH des cellules. Elle possède de
multiples sous-unités différentes. Ces sous-unités diffèrent par leur structure des pompes ATPasiques
de types P, et sont trouvées dans la membrane plasmique de la bactérie, la membrane interne de la
mitochondrie (où elles ont un rôle clé dans la respiration cellulaire et la formation d’ATP) et la
membrane thylakoïde des chloroplastes. Au lieu d’hydrolyser l’ATP, elles utilisent le gradient de
protons H+, à travers la membrane pour synthétiser de l’ATP à partir d’ADP et de phosphate. Ces
pompes sont donc directement reliées à la régulation du pH intracellulaire.
§ Les transporteurs ABC
Les transporteurs ABC.
ÙÙ
Transporteurs ABC (ATP Binding Cassette). – Protéines insérées dans la membrane plasmique
qui transportent des AA, des sucres, des polysaccharides, des peptides et même des protéines.
Les transporteurs ABC (« ATP Binding Cassette »), dont plus de 50 sortes ont été décrits,
transportent des acides aminés, des sucres, des polysaccharides, des peptides et même des protéines.
Très nombreux chez les procaryotes mais aussi les eucaryotes.
MDR (« Multi Drug Resistance » protein) : pompent les molécules hydrophobes à l’extérieur de
la cellule, d’où la résistance, par exemple, de certaines cellules aux anticancéreux.
CFTR (donc la mutation entraîne la mucoviscidose) est aussi membre des transporteurs ABC.
7. Les aquaporines et la perméabilité à l’eau des membranes de la cellule

Les aquaporines sont des protéines faisant passer de l’eau sans transport d’ions. Elles sont
impliquées dans la perméabilité de la cellule.
195 Année 2017 - 2018

8. Les canaux ioniques
Les vannes des canaux ioniques.
IV. Signalisation via des récepteurs transmembranaires

Ligands des récepteurs :
§ Agoniste : composé, souvent une hormone ou son analogue qui se lie à un récepteur et
entraine une réponse.
§ Antagoniste : composé, souvent un analogue d’une hormone qui se lie à un récepteur sans
entraîner de réponse.
A. Signalisation via des récepteurs couplés aux protéines G
Récepteur couplé aux protéines G.
§ Considérable diversité des ligands : hormones, neurotransmetteurs, médiateurs

chimiques à action locale, etc.
§ Considérable variété de structure de ces ligands : protéines, petits peptides,

aminoacides, dérivés d’acides gras, etc.
§ Plusieurs récepteurs pour un même ligand : 9 pour l’adrénaline, 5 pour l’acétylcholine,

15 pour la sérotonine, etc.
Conclusion : la plus grande famille de récepteurs (> 700 chez l’Homme).

1. Structure et localisation des protéines G sous forme de trimère
Structure d'une protéine G inactive (transducine) sous forme de trimère.
Le récepteur couplé aux protéines G est formé de 7 hélices transmembranaires. Il lie une protéine
G, qui elle-même lie le GTP. La protéine G est formée de 3 sous-unités : une α, une β et une γ. La sous-
unité α possède une activité GTPasique, capable d’hydrolyser le GTP en GDP.
Les sous-unités α et γ sont couplées de façon covalente à des composés lipidiques pour leur
ancrage dans la bicouche lipidique. Les SU β et γ interagissent principalement uniquement entre les 2.
La liaison d’un signal extracellulaire à un récepteur couplé aux protéines G modifie la conformation du
récepteur, ce qui modifie à son tour la conformation de la protéine G qui y est liée. Le récepteur reste
actif tant que la molécule de signalisation externe y est liée, et il peut donc catalyser l’activation de
nombreuses molécules de protéines G qui se dissocient du récepteur une fois activées.
2. Relais de la signalisation du GPCR activé par le trimère de protéines G
Activation d'une protéine G par une GPCR activé.
§ Activation des protéines cibles par la sous-unité α et le complexe βγ activés ;
§ Hydrolyse du GTP et inactivation du trimère de protéines G.
B. Production de l’AMPc par régulation de l’activité de l’adénylyl-cyclase

L’adrénaline active la glycogène phosphorylase responsable de la dégradation du glycogène en
glucose. Le traitement de membranes isolées d’hépatocytes entraîne la libération d’un médiateur
thermostable qui peut activer la phosphorylase présente dans un extrait cellulaire sans membrane. Ce
médiateur est l’AMPc.
197 Année 2017 - 2018

1. Synthèse et dégradation de l’AMPc
Synthèse et dégradation de l'AMPc.
La synthèse de l’AMPc est catalysée par l’adénylyl cyclase (protéine transmembranaire, site
catalytique du côté intracellulaire).
Adénylyl cyclase. – Protéine plusieurs fois transmembranaire au domaine catalytique dans le

cytosol, dont il existe au moins 8 isoformes chez les mammifères et dont l’activité est régulée à la
fois par les sous-unités α des protéines G sous forme de trimères et la concentration en ions Ca2+.
2. Protéines Gs de stimulation et Gi d’inhibition
Activation et inhibition de l'adénylyl cyclase dans les adipocytes.
Les récepteurs β adrénergiques activent l’adénylyl cyclase via une protéine Gs (αs). Les
récepteurs α2 adrénergiques inhibent l’adénylyl cyclase via une protéine Gi (αi).

Les Gs et Gi sont des cibles de toxines bactériennes :
§ la toxine du choléra est une enzyme qui catalyse le transfert de l’ADP ribose sur la sous-
unité αs de Gs à partir du NAD+ intracellulaire. Ainsi modifiée, αs ne peut plus hydrolyser
le GTP et reste constamment activée. L’élévation prolongée du taux d’AMPc dans les
cellules de l’épithélium intestinal entraîne une fuite de Na+ et d’eau, cause de la diarrhée
sévère qui caractérise le choléra, conséquence d’une infection par le vibrion cholérique
(identifié par Koch en 1883).
§ la toxine pertussique est synthétisée par la bactérie qui donne la coqueluche (Bordetella
pertussis ou bacille de Bordet-Gengou responsable de 400 000 décès par an). La toxine
catalyse l’ADP-ribosylation de la sous-unité αi de Gi ce qui empêche l’échange du GDP par
le GTP et ne permet pas l’inhibition de l’adénylyl cyclase.
3. Activation de la protéine kinase A (PKA) par l’AMPc

§ Effets immédiats de l’élévation de la concentration de l’AMPc
La fixation de l’AMPc sur les sous-unités régulatrices de PKA induit une modification de PKA, qui
dissocie ces dernières des sous-unités catalytiques et active ainsi leur activité kinase. Les sous-unités
catalytiques se dirigent alors vers le noyau (elles peuvent phosphoryler des protéines régulatrices de
gènes). La liaison d’une molécule de signalisation extracellulaire sur son récepteur couplé aux
protéines G active l’adénylyl cyclase via Gs et aboutit à l’augmentation de concentration en AMPc dans
le cytosol. L’augmentation d’AMPc dans le cytosol entraîne l’activation de la PKA.
Activation de la protéine kinase dépendante de l'AMPc (PKA).
§ Effets à plus long terme sur l’expression génique
Une fois les sous-unités catalytiques dans le noyau, elles phosphorylent la protéine régulatrice de
gènes CREB. Une fois phosphorylée, CREB recrute le coactivateur CBP qui stimule la transcription
génique. Cette voie contrôle de nombreux processus cellulaires.
La PKA activée peut phosphoryler des résidus sérines et thréonines.
199 Année 2017 - 2018

Activation de la transcription génique à la suite de l'élévation de la concentration d'AMPc.
C. Voie d’activation des inositol-phospholipides via une phospholipase C-β

Réponse de quelques cellules dans lesquelles les récepteurs couplés aux protéines G activent la
voie des inositol-phospholipides.
Tissu cible Molécule de signalisation Réponse principale

Foie Vasopressine Dégradation du glycogène
Plaquette Thrombine Agrégation des plaquettes
Pancréas Acétylcholine Sécrétion d’amylase
Muscle lisse Acétylcholine Contraction du muscle
1. Origine des inositol-phospholipides

Les poly-phosphoinositides PI(4)P et PI(4,5)P2 sont produits respectivement par la phosphorylation
du phosphatidylinositol (PI) et de PI(4)P. C’est la dégradation de PI(4,5)P2, qui prédomine et est la plus
importante car elle génère deux médiateurs intracellulaires. Néanmoins PI(4,5)P2 est le moins
abondant dans la membrane plasmique.
Synthèse du PI 4,5-bisphosphate [PI(4,5)P2] à partir du phosphatidylinositol.
2. Activation de la phospholipase C-β par des protéines Gq

Deux petits médiateurs sont produits par l’hydrolyse de PIP2 : IP3 qui diffuse à travers le cytosol
et libère le Ca2+ du RE, et le diacylglycérol qui reste dans la membrane et facilite l’activation d’une
enzyme, la protéine kinase C.

Hydrolyse du PIP2 en IP3 + DAG par la phospholipase C-β.
3. Deux branches sur la voie inositol-phospholipides, IP3 et DAG

§ Augmentation du Ca2+ à la suite de la libération d’IP3 ;
§ Activation de la PKC par le DAG et le Ca2+.
2+
Activation de la PKC par le DAG et le Ca .
4. Mécanismes d’arrêt de l’élévation du calcique après libération d’IP3

Nous retrouvons trois possibilités :
§ Déphosphorylation d’IP3 par des phosphatases pour former IP2.
§ Phosphorylation d’IP3 en IP4.
§ Pompage du Ca2+ principalement en dehors de la cellule, mais aussi à l’intérieur de
compartiments spécialisés.
Le Ca2+ est activement pompé du cytosol vers l’extérieur de la cellule. Le Ca2+ est pompé du cytosol
vers le RE et les mitochondries et diverses molécules lient étroitement le Ca2+ libre.
Pompage du calcium à l'intérieur de la cellule.
201 Année 2017 - 2018

5. Élévation de la [Ca2+] relayée par des CaM-kinases intracellulaires

§ Calmoduline protéine de liaison du Ca2+ : elle a la forme d’un haltère, avec 2 extrémités
globulaires qui peuvent se lier à de nombreuses protéines cibles. Les 2 extrémités sont
reliées par une chaîne α. Chacune des extrémités à un domaine de liaison avec le Ca2+.
§ Activation de la CaM-kinase II par la Ca2+/calmoduline : complexe protéique de 12 sous-

unités. La liaison au Ca2+/calmoduline modifie la conformation de la protéine l’activant
partiellement. L’autophosphorylation du complexe complète l’activation de l’enzyme et
prolonge son activité de deux façons.
§ CaM-kinase II décodeur des oscillations de [Ca2+] : la CaM-kinase est un décodeur des

fréquences des oscillations du Ca2+. Aux basses fréquences des pics de Ca2+, l’enzyme
devient inactive après chaque pic car l’autophosphorylation induite par la liaison de
Ca2+/calmoduline ne maintient pas l’activité enzymatique assez longtemps pour que
l’enzyme reste active jusqu’à la survenue du pic suivant. En revanche, si la fréquence est
supérieure à l'augmentation de l’activité jusqu’à ce qu’elle soit auto-phosphorylée sur
toutes ses sous-unités, l'activité enzymatique est maintenue.
6. Rôle d’activation des sous-unités βγ

Cas du récepteur muscarinique de l’acétylcholine : hyperpolarisation de la membrane et
réduction de la fréquence des contractions du muscle cardiaque = participe à la réponse du malaise
vagal. Une sous-unité, fixée à la membrane, est capable d’interagir physiquement avec un canal
potassique. Ces SU n’ont pas d’activité enzymatique mais peuvent avoir des effets dans la cellule.
Ouverture d'un canal K+ par les sous-unités βγ lors de l'activation du récepteur muscarinique de l'acétylcholine.

D. Odorat et vision dépendent de récepteurs couplés aux protéines G

1. Les photorécepteurs : mécanismes de la vision
Structure de la rétine.
Un seul photon interagit avec la cellule réceptrice de l’œil, et modifie ces propriétés des
photorécepteurs (= capteur très sensible). La rétine est composée de 2 types de photorécepteurs :
§ les cellules en cônes responsables de la vision de jour et des couleurs ;
§ les cellules en bâtonnet responsables de la vision de nuit et monochromatique.
Couplage de l'abs. de lumière par la rhodopsine à l'activation de la phosphodiestérase du GMPc dans les cellules à bâtonnet.
La photoréception se passe au niveau du segment externe, qui porte des disques composés de
rhodopsine. La rhodopsine est une protéine à 7 passages transmembranaires. Elle contient en son
centre le rétinol isomérisé lorsqu’un photon tape dessus. L’interaction entre la rhodopsine et un
photon entraîne un changement de conformation de la rhodopsine et l’ouverture d’une crevasse pour
fixer et activer la protéine G. Cela est amplifié au niveau de la cellule. Il y a production de GMPc, qui
active un canal cationique laissant rentrer le Ca2+ et le Na+ de façon constitutive dans le noir. Quand
un photon tape sur la rhodopsine, cela active la transduction qui elle-même active une
phosphodiesterase. Cela entraîne une diminution de la concentration de GMPc puis la fermeture du
canal et enfin la diminution de la concentration de Ca2+ pompé vers l’extérieur ; tous ces mécanismes
résultent en une hyperpolarisation de la membrane des cellules.
203 Année 2017 - 2018

Amplification.
E. Signalisation par l’intermédiaire de récepteurs associés à une enzyme

§ Récepteurs à activité tyrosine-kinase : phosphorylent des tyrosines sur eux-mêmes et
sur un petit groupe de protéines de signalisation intracellulaires.
§ Récepteurs associés à des tyrosine-kinases : s’associent à des protéines intracellulaires
qui possèdent une activité tyrosine kinase.
§ Tyrosine-phosphatases ressemblant à des récepteurs : hydrolysent des phosphates sur
des tyrosines de protéines de signalisation intracellulaires (leurs ligands supposés n’ont
pas encore été identifiés).
§ Récepteurs à activité sérine/thréonine kinase : phosphorylent des sérines ou des
thréonines sur des protéines associées de régulation latente de l’expression génique.
§ Récepteurs à activité guanylyl-cyclase : catalysent directement la production de GMPc
dans le cytosol.
2.
3. Les récepteurs à activité tyrosine-kinase
§ Structure des récepteurs à activité tyrosine-kinase
Le domaine tyrosine kinase est parfois interrompu par une région d’insertion de la kinase dans
certaines de ces sous-familles. Ces récepteurs phosphorylent les tyrosines des protéines de
signalisation intracellulaires.
§ Association des récepteurs en dimères pour l’auto-phosphorylation
Les récepteurs normaux se dimérisent en réponse à la liaison du ligand. Les deux domaines
kinases se phosphorylent mutuellement, ce qui augmente l’activité des domaines kinases qui peuvent
ensuite phosphoryler d’autres sites sur le récepteur.

Activation des RTK par formation de dimère.
Si nous mutons le domaine d’activation tyrosine kinase sur un monomère, nous aurons formation
d’un dimère avec une molécule normale. Cela bloque la transphosphorylation. Nous aurons donc
formation d’un récepteur sans activité tyrosine kinase.
ÙÙ
Dominant. – Se dit d'un allèle ou d'une mutation qui conditionne le phénotype à l'état hétérozygote.
ÙÙ
Récessif. – Se dit d'un allèle ou d'une mutation qui n'influence pas le phénotype à l'état
hétérozygote.
ÙÙ
Dominant négatif. – Se dit d’un allèle ou d’une mutation qui affecte le phénotype de façon
dominante par l’intermédiaire d’une protéine ou d’une molécule d’ARN qui interfère avec la
fonction du produit d’un gène normal dans la même cellule.
§ Inhibition de la transduction par des récepteurs dominant négatifs
Le récepteur mutant, s’il est en excès, bloquera donc la signalisation par le récepteur normal
(régulation dominante négative).
§ Arrimage au récepteur activé de protéines intracellulaires de signalisation
Arrimage des protéines de signalisation intra-cellulaires sur le récepteur à activité tyrosine kinase activé.
§ Cas particulier des récepteurs de l’insuline et de l’IGF-1
205 Année 2017 - 2018

4. Arrimage des protéines à domaine SH2 aux P-Tyr des récepteurs activés
Complexe de signalisation spécifique formé grâce à des domaines d'interaction modulaires.
§ Structure des domaines SH2
Les SH2 reconnaissent les tyrosines phosphorylées dans un contexte de séquence d’AA. SH2 peut
s’insérer n’importe où dans une protéine sans perturber son repliement ou la fonction protéique. Ces
extrémités sont proches, donc nous pouvons insérer ce type de domaine globulaire facilement dans
une protéine pour lui conférer une activité P-Tyr.
Nota Bene. – SH2 est une structure identifiée dans les sarcomes (tumeurs du conjonctif) qui
provoque la transformation cellulaire et la différenciation cellulaire (=oncogène).
§ Autres domaines (SH3 et PTB) et différentes modalités de couplage
§ Rôle du domaine PH : fixe des lipides, fixe des PIP2 et permet une interaction régulée
à la membrane avec phospholipides inositol. Ce sont des modules distribués sur
différentes protéines qui sont assemblées à la membrane.
§ SH3 a tendance à fixer des séquences riches en prolines.
§ PTB fonctionne comme SH2 et reconnaît les phosphotyrosines.
5. Ras activée par le récepteur phosphorylé

Protéines Ras. – Appartiennent à la superfamille des GTPases sous forme de monomère, associées
à la membrane par un groupement myristyle. Chez l’être humain, trois sortes de Ras : H-Ras, K-Ras
et N-Ras qui fonctionnent de la même façon.
La superfamille contient aussi quatre autres familles :

§ la famille Rho qui relaye la signalisation à partir des récepteurs de la surface jusqu’à
l’actine du cytosquelette et ailleurs ;
§ la famille ARF qui régule l’assemblage des protéines de la couverture des vésicules
intracellulaires ;
§ la famille Rab qui régule le trafic des vésicules de transport intracellulaire ;
§ la famille Ran qui régule l’assemblage du fuseau mitotique et le transport de l’ARN et
des protéines à travers les pores du noyau.

Ras possède une fonction on/off : inactive liée au GDP et active liée au GTP. Cette activité est
contrôlée par un GEF et une GAP.
Cycle de fonctionnement des protéines Ras membres des petites protéines G.
L’activation de Ras est essentielle et sans la voie de signalisation qui permet de recruter GEF près
de Ras, nous ne pouvons pas l’activer. L’activation de Ras par le RTK Sev, chez la drosophile : l’activation
de RTK Sev, à la surface de la cellule, par une molécule de signalisation dans le cytosol, active la Ras-
GEF Sos par l’intermédiaire de la protéine Grb-2. La protéine Ras est alors phosphorylée et active.
Activation de Ras par un récepteur à activité tyrosine kinase via Grb2/Sos cette dernière possédant aussi un domaine PH.
6. Activation par Ras de Ser/Thr- et de Thr/Tyr-kinases en cascades
Voie de phosphorylation par des MAP-kinases activées par Ras.
ÙÙ
Mitogène (agent mitogène). – Toute molécule extracellulaire, telle qu'un facteur de croissance,
qui promeut la prolifération cellulaire.
§ Activation d’une MAP-kinase via deux autres kinases ;

§ Deux groupes de substrats phosphorylés par la MAP-kinase ;
§ Au moins cinq modules à trois composants dans les cellules de mammifère ;
§ Inactivation des MAP-kinases par des protéines phosphatases.
Le module à trois composants commence par une MAP-kinase-kinase-kinase appelée Raf. Ras
recrute Raf sur la membrane plasmique et facilite son activation. Raf active la MAP-kinase-kinase Mek,
qui active alors la MAP- kinase appelée Erk. Erk à son tour phosphoryle diverses protéines en aval, y
compris d’autres kinases, ainsi que des protéines régulatrices de gènes dans le noyau.
207 Année 2017 - 2018

Ce système est varié car il y a 12 MAPK, 7 MAPKK et 7 MAPKKK. Cela donne une grande modularité
dans les possibilités de signalisation qui ne doivent pas se faire au hasard. Nous n'avons pas de substrat
très strict pour passer de l’un à l’autre. C’est pourquoi nous avons besoin d’échafaudages couplés à la
signalisation : cela permet le ciblage de la MAPK qui doit être activée.
7. Fabrication de dites d’arrimage à la membrane plasmique par la PI 3-kinase
Arrimage de nombreuses prot. (environ 200 chez l'être humain) au PI 3,4,5-triphophosphate [PI(3,4,5)P3] par leur dom.PH.
PI 3-kinase : phosphatidyl inositol 3-kinase (nombreuses PI3-kinases), phosphoryle les inositol-

phospholipides. Elle est activée par les récepteurs à activité tyrosine-kinase et par de nombreux autres
récepteurs y compris ceux couplés aux protéines G via le complexe βγ et ceux qui activent Ras qui
active directement la PI 3-kinase.
§ Origine des substrats de la PI3-kinase.

§ Phosphorylation des PI, PIP et PIP2 par la PI3-kinase.
§ Activation de la PI3-kinase par des récepteurs de plusieurs types.
§ Élimination du 3-phosphate par des inositol phospholipides phosphatases.
Le domaine PH interagit avec des résidus P3 présents au niveau de la membrane. C’est une
interaction avec des lipides. La PIK contrôle l’abondance des lipides pour permettre ou non le
recrutement de ces molécules de signalisation. Son activité est de phosphoryler les molécules inositol.
Nous pouvons phosphoryler en position 3 le PI pour faire du PIP3. La PI3K est activée par des SU
régulatrices et récepteurs à tyr-K par des protéines G. PI3K a un rôle dans la survie des cellules.
Exemple. – Utilisée dans le récepteur à insuline : PDK1 et Akt (PKB) recrutée par PIP3 puis
phosphorylation et activation d’Akt par PDK1 et mTOR provoquant la libération d’Akt activée une
fois qu’elle est totalement phosphorylée pour activer l’apoptose en aval. Bad est inhibée par une
protéine spécifique, sa phosphorylation (de Bad) inactive l’apoptose.
Réseau de signalisation mTOR.

La quantité en AA disponibles peut contrôler directement l’activation de Reb pour aller activer
rapTOR ou mTOR. Nous avons une cascade de signalisation et nous avons donc l’existence de boucles
de rétrocontrôle négatif de SBK sur IRS/PI3K. Le complexe RapTOR II va stimuler PAKT. Un GPCR peut
activer un PKA et la PKC la MAPK. Les récepteurs Tyr-K peuvent activer la phospholipase C.
Nous avons des connexions entre la voie Ras et les sorties au niveau de l’Akt. Chaque protéine
peut porter des sites de phosphorylation qui sont reconnus par des MAP différentes ayant des effets
différents ou égaux.
8. Croissance et survie des cellules stimulées par la voie des PI 3-kinase/Akt

§ Survie des cellules sous la dépendance de systèmes qui inhibent l’apoptose ;
§ Rôle de la PI3-kinase dans la survie des cellules ;
§ Croissance simultanée induite par la PI3-kinase et la kinase de S6.
9. Les voies de signalisation intracellulaire interconnectées
10. Récepteurs sans activité tyrosine-kinase associés à des tyrosine-kinases

§ Tyrosines kinases cytoplasmiques de la famille Src
Src appartient à la plus grande famille des protéines à activité tyrosine kinase localisées dans le
cytoplasme.
Cette famille comprend Src, Yes, Fgr, Fyn, Lck, Lyn, Hck et Blk.
Toutes ces protéines présentent des domaines SH2 et SH3 et sont localisées contre la membrane
plasmique, maintenues là par les récepteurs avec lesquels elles interagissent et par des chaînes
d’acides gras auxquels elles sont liées de façon covalente.
§ Tyrosines kinases cytoplasmiques associées aux intégrines
Les intégrines sont des récepteurs avec un passage transmembranaire qui s’associent avec la
matrice extracellulaire. L’interaction des intégrines avec des composants de cette matrice peut
entraîner une activation de différentes voies de signalisation intracellulaire ce qui influence le devenir
de la cellule. Lorsque des intégrines se rassemblent à des sites de contact avec la matrice
extracellulaire, elles contribuent à former des points d’adhérence focalisée.
Fak (« Focal adhesion kinase ») est l’une des protéines du cytosol qui interagit avec ces intégrines
par leur queue intra-cytosolique. Elle informe ainsi la cellule, en association avec d’autres protéines à
209 Année 2017 - 2018

activité tyrosine kinase dont Src, qu’une surface sur laquelle elle peut poursuivre sa croissance est
maintenant disponible.
11. Récepteurs à activité sérine/thréonine kinase
§ Famille des protéines du type du TGF-β
- TGF-β = « Transforming Growth Factor β » ;

- BMP = « Bone Morphogenic Protein » ;
- Activines.
Les TGF-β agissent sous forme de dimère, comme hormone ou comme médiateur agissant
localement. Au cours du développement, ils régulent la formation des organes et influencent le devenir
de nombreuses cellules avec le contrôle de leur prolifération et de leur différenciation, ainsi que la
formation de la matrice extracellulaire et la mort des cellules. Chez l’adulte TGF-β est impliqué dans
la réparation des tissus, dans la régulation du système immunitaire, etc.
§ Mode d’action du TGF-β via les protéines Smad
TGF-β utilise un mécanisme passant par des facteurs Smad : domaine à activité sérine/thréonine
kinase porté uniquement par le type II. Nous avons une homo-dimérisation des récepteurs et donc
Phosphorylation croisée. Un récepteur TGF-β de type II s’associe avec un type I. Cette phosphorylation
permet la phosphorylation d’un facteur Smad qui va se détacher du récepteur et s’hétéro-dimériser
avec smad4 pour constituer un facteur transcriptionnel capable d’induire la réponse transcriptionnelle.
12. Récepteurs à activité guanylyl-cyclase

Les récepteurs à activité guanylyl cyclase sont des protéines à un seul passage à travers la
membrane, avec un domaine extracellulaire pour une molécule de signalisation et un domaine
intracellulaire qui présente un domaine catalytique à activité guanylyl-cyclase. La liaison de la
molécule de signalisation entraîne l’activation du domaine catalytique et la production de GMPc.
Le GMPc active à son tour une protéine kinase G dépendante de la GMPc (PKG) qui phosphoryle
de façon spécifique des protéines cibles sur des sérines et des thréonines.
13. Voies de signalisation qui mettent en jeu une protéolyse régulée de protéines
de régulation latente de l’expression génique
§ Voie Notch / Delta ;
§ Voie Wnt / β-caténine ;
§ Voie Hedgehog ;
§ Voie NF-kB impliquée surtout dans le développement et la réponse inflammatoire.

Division et cycle de division de la cellule, apoptose

Rédigé à partir du cours du Pr SCHAEFFER et du Pr BESSEREAU
I. Mécanismes de division de la cellule

A. Introduction
Toute cellule provient d’une autre cellule. Ceci assure la continuité de la vie depuis trois milliards
d’années (que la cellule constitue un être unicellulaire ou qu’elle fasse partie d’un organisme
multicellulaire).
Le taux de renouvellement est très variable selon le type cellulaire : pas de division des cellules
nerveuses et musculaires, une fois par an pour un hépatocyte, deux fois par jour pour les cellules de la
muqueuse intestinale.
Les caractéristiques de la division des cellules sont universelles, même si quelques détails varient
selon le type et l’origine de la cellule, avec une réplication de l’ADN et un doublement de la masse de
la cellule.
La division de la cellule est nécessaire pour créer un nouvel individu à partir d’un ovocyte fécondé
et pour maintenir l’intégrité de l’organisme par remplacement des cellules mortes de sénescence,
nécrose ou apoptose. Les cellules sont programmées pour un certain nombre de divisions.
Tout être humain fabrique des millions de cellules chaque seconde. Il faut procurer aux deux
cellules filles l’ensemble du matériel génétique. Pour doubler le matériel génétique, il y a plusieurs
origines de réplication (ORI). Une fois le matériel génétique doublé, elle le sépare en deux. Les étapes
du cycle cellulaire :
§ Croissance de la cellule et réplication des chromosomes ;
§ Ségrégation des chromosomes ;
§ Division de la cellule en deux pour créer deux nouvelles cellules.
Les cellules filles sont identiques à la cellule de départ, et vont elles-mêmes se diviser.
Cycle de division simplifié d'une cellule eucaryote.
211 Année 2017 - 2018

Interphase. – Phase pendant laquelle la cellule ne se divise pas. Lors de cette phase, il y a
expression génique et réplication des chromosomes. L’interphase est plus longue que la phase M.
La phase M correspond à la mitose et la cytodiérèse. Une fois la cellule divisée (cytodiérèse), elle
retourne en interphase.
La phase M contient six étapes :

§ cinq pour la formation des deux noyaux ;
§ une pour la division (cytodiérèse).
Chacune de ces étapes est très importante, et doit être contrôlée.
Vue simplifiée du cycle de division d'une cellule eucaryote.
B. Les différentes phases du cycle de division de la cellule
Les quatre phases successives d'un cycle de division d'une cellule eucaryote.

Dans un cycle cellulaire, nous définissons quatre phases successives :

§ une phase G1 ;
§ une phase S pour la réplication ; Interphase
§ une phase G2 pour vérifier le contenu.
Les cellules restent en G0 pour celles qui ne se divisent plus, qui retourneront ensuite en G1 si
nécessaire : neurones et muscles.
§ une phase M correspondant à la mitose et la cytodiérèse. Les protéines qui régulent le

cycle diffèrent entre les différentes phases.
C. Division de la phase M en six phases

1. Cinq premières phases = mitose = division du noyau
ÙÙ
Mitose. – Division du noyau d’une cellule eucaryote, qui implique la condensation de l’ADN en
des chromosomes visibles et la séparation des chromosomes dupliqués pour former deux jeux
identiques de ces chromosomes.
§ Prophase : formation de microtubules ;
§ Pro-métaphase (début de la métaphase) + Métaphase : migration de chromosomes,

alignement sur la plaque équatoriale ;
§ Anaphase : séparation des chromosomes au niveau des centromères et déplacement

des chromatides aux extrémités. La cellule peut se bloquer très longtemps au niveau de
la métaphase, si les chromosomes ne sont pas alignés correctement.
§ Télophase : une enveloppe nucléaire va se reformer et former deux nouveaux noyaux.
Les événements qui rythment le cycle de division d'une cellule eucaryote tels qu'on peut les observer au microscope.
213 Année 2017 - 2018

2. Sixième phase = cytodiérèse = division du cytoplasme

La cytodiérèse correspond à la division du cytoplasme, et la séparation en deux cellules filles
suivie de l’entrée en interphase.
Les phases du cycle de division de la cellule.
D. Préparation des chromosomes à la mitose

1. Réplication de l’ADN en phase S et duplication des chromosomes
Une fois les chromosomes répliqués, il faut les condenser pour leur donner une taille cohérente
avec la taille du noyau.
Les chromosomes sont compactés, pour pouvoir bien répartir l’ADN dans les deux cellules filles.
Pendant la mitose, les chromosomes sont dans leur état de compaction maximale.
2. Condensation des chromosomes et des deux chromatides sœurs

Au microscope électronique, nous pouvons visualiser les chromatides sœurs.
3. Rôle des condensines et cohésines dans la condensation de la chromatine

Condensine (complexe de condensines). – Complexe de protéines impliquées dans la
condensation des chromosomes préalablement à la mitose. Cibles de Cdk-M.
Les condensines forment des pinces capables de faire tenir plusieurs boucles d’ADN ensembles.
Elles sont donc impliquées dans la condensation de l’ADN, préalablement à la mitose.

Structure du complexe des condensines constitué de 5 SU et leur rôle dans la condensation de la chromatine et des chr.
L’empilement de ces boucles permet de former les structures chromosomiques. Les condensines
s’associent en anneaux, qui vont eux même s’empiler les uns sur les autres.
Complexe des condensines constituant de l'armature de la chromatine.
Les cohésines coincent les chromatides sœurs entre elles au niveau du centromère. Une fois les
chromosomes sur la plaque équatoriale, cela peut être long. Le signal de séparation des chromatides,
est l’hydrolyse des cohésines.
Structure des cohésines constituées de quatre sous-unités et leur rôle dans l'association des chromatides sœurs condensées.
215 Année 2017 - 2018

E. Mise en place d’une machine du cytosquelette pour assurer la division

1. Deux systèmes du cytosquelette mis en œuvre en phase M
Les deux systèmes du cytosquelette mis en œuvre en phase M.
Les éléments du cytosquelette sont mobilisés :

§ les microtubules émanent du centrosome ; les cellules contiennent dans ce cas deux
centre d’organisation des microtubules (MTOC) qui se mettent chacun d’un côté de la
cellule, et créent un réseau de microtubules : le fuseau mitotique. Les chromosomes se
déplacent le long de ces microtubules.
§ il y a formation d’un anneau de contraction sous la membrane, au niveau de la plaque
équatoriale, composé d’actine et de myosine. Cette contraction entraîne la séparation
des deux cellules.
2. Centrosome = centre d’organisation des microtubules (MTOC)

Le centrosome commence par se dédoubler à deux MTOC pendant le début de la prophase.
Pendant ce temps, les chromosomes sont en train d’être condensés (le maximum de condensation est
arrivé au niveau de la prophase).
Le centrosome est formé de deux tubes perpendiculaires (nommés centrioles) entourés d’une
matrice de tubuline γ. Les microtubules démarrent du MTOC et croissent par leur extrémité +.
L’extrémité dirigée vers le centriole croît moins vite que l’extrémité +.
Le centrosome ou centre d'organisation des microtubules.

Le mouvement des centrosomes après leur duplication.
3. Formation du fuseau mitotique entre les deux pôles

Les microtubules partent des centrosomes. Il en existe de trois types différents :
§ les microtubules de l’aster partent en direction de la membrane. Ils s’attachent à la

membrane de la cellule ce qui permet de déplacer les deux centrioles vers les extrémités
de la cellule.
§ les microtubules du pôle forment le fuseau mitotique et écartent les centrioles les uns
des autres.
§ les microtubules du kinétochore qui s’attachent directement au niveau du centromère

des chromosomes. Cette liaison est indispensable car sinon le raccourcissement des
microtubules ne séparerait pas les chromatides sœurs.
Les trois groupes de microtubules du fuseau mitotique.
ÙÙ
Kinétochore. – Structure complexe formée de protéines sur un chromosome en mitose, à
laquelle les microtubules sont attachés et qui joue un rôle actif dans les mouvements des
chromosomes en direction des pôles du fuseau. Le kinétochore se forme sur la partie du
chromosome appelée centromère.
217 Année 2017 - 2018

F. Les étapes de la mitose

1. Prophase lors de la transition de G2 à M (environs 20-30 mn)
§ Disparition des nucléoles ;
§ Organisation des chromosomes dupliqués en deux chromatides sœurs ;
§ Début de formation du fuseau mitotique.
Dissociation, dislocation, assemblage et fusion des nucléoles à chaque mitose.
2. Pro-métaphase (environs 5-10 mn)

§ Rupture de l’enveloppe du noyau ;
§ Pénétration du fuseau dans la région du noyau ;
§ Association des microtubules aux kinétochores ;
§ Mise en tension des chromosomes entre les kinétochores.
Remarque. – Nous gardons les membranes des noyaux au cours de la mitose qui sont reformés
après la mitose. À la fin de la mitose, les lamina (présentes à la face interne du noyau) se remettent
autour des chromosomes, afin d’attirer des bouts de membrane ; les bouts de membrane
fusionnent ensuite pour former de nouveau la membrane nucléaire complète.
3. Métaphase (environs 20-30 mn)

§ Alignement des chromosomes à mi-chemin entre les deux pôles ;
§ Chromosomes en tension sur la plaque équatoriale.
À la fin de cette étape, il y a un point de contrôle. La cellule ne continuera pas la division si les
chromosomes ne sont pas bien alignés le long de la plaque équatoriale.
4. Anaphase (quelques mn)

L’anaphase est déclenchée uniquement si les chromosomes sont bien répartis et est déclenchée
brutalement par un signal spécifique (hydrolyse des cohésines fournissant ainsi de l’énergie).
§ Déclenchée brutalement par un signal spécifique ;

§ Séparation des chromosomes tirés par les pôles du fuseau ;
§ Migration des chromosomes à la vitesse de 1 μm/min.
La séparation se fait en deux étapes :

§ Anaphase A : raccourcissement des fibres des kinétochores ;
§ Anaphase B : élongation des fibres des pôles.

À la fin de cette anaphase, nous obtenons les deux sets de chromosomes. Il manque juste
l’enveloppe nucléaire.
5. Télophase (environs 30-30 mn)

§ Arrivée aux pôles des chromatides sœurs séparées,
§ Disparition des fibres des kinétochores,
§ Allongement des fibres des pôles,
§ Formation d’une nouvelle enveloppe du noyau,
§ Décondensation de la chromatine,
§ Réapparition des nucléoles,
§ Fin de la mitose.
À la fin de chaque mitose, l’enveloppe nucléaire diminue de moitié, heureusement elle est
resynthétisée pendant l’interphase.
Les étapes de la mitose et de la cytodiérèse de la cellule d'un animal.
G. Dynamique des microtubules au cours de la mitose

1. Mise en place des microtubules des trois classes
Les trois classes de microtubules d'un fuseau de cellule animale en mitose.
Les microtubules sont synthétisés à partir des centrioles, qui sont composés de tubuline γ. Il existe
trois types de microtubules :
§ les microtubules de l’aster : traction des centrosomes vers la membrane.
219 Année 2017 - 2018

§ les microtubules des pôles formant le fuseau qui relie les deux centrioles.
§ les microtubules des kinétochores attachés au niveau des centromères.
2. Interaction des microtubules avec des protéines agissant comme moteurs
Dynéines : transport rétrograde (du + vers le – des MT).
Kinésines : transport antérograde (du – vers le + des MT).
Organisation et fonction de la chromatine qui forme les centromères de l'être humain.
Les microtubules de l’aster sont attachés à la membrane par une molécule de dynéine. La dynéine
tire le microtubule vers la périphérie, ce qui écarte les centrosomes.
Les microtubules des pôles sont attachés entre eux par une molécule de kinésine. Les kinésines
vont relier deux microtubules de deux pôles différents et se déplacent le long des microtubules. Ces
molécules vont avoir tendance à écarter les microtubules des pôles.
Les microtubules du fuseau : une molécule de kinésine attache les chromosomes aux
microtubules du fuseau. Ces moteurs moléculaires permettent de déplacer les chromosomes vers la
plaque équatoriale.
3. Attachement des kinétochores aux microtubules
Organisation et fonction de la chromatine qui forme les centromères de l'être humain.

La composition de la chromatine est particulière au niveau du centromère (les histones sont

spécifiques, l’histone H3 est remplacé par un variant particulier CENP-A (vu dans le cours sur les
histones), permettant l’attachement du cytosquelette au kinétochore.
4. Séparation des chromatides sœurs au cours de l’anaphase

§ Forces mises en jeu :
- anaphase A : elle correspond au raccourcissement des microtubules du
kinétochore. Ce raccourcissement déplace les chromosomes vers les pôles. Le
kinétochore forme un anneau qui bloque le microtubule à l’intérieur. Son
raccourcissement ne détachera pas le microtubule du kinétochore. Une force de
glissement est engendrée entre les microtubules à partir des pôles opposés, puis
une force d’étirement par le raccourcissement des microtubules des asters.
- anaphase B : dépolymérisation par l’extrémité + et déplacement des
kinétochores en direction des pôles. Puis enfin, séparation des chromatides
sœurs par une protéase clivant les cohésines.
Résumé.
§ Dépolymérisation des microtubules du kinétochore au pôle + ;

§ Séparation des chromatides sœurs par une protéase clivant les cohésines.
H. La cytodiérèse
ÙÙ
Cytodiérèse. – Division du cytoplasme d’une cellule animale ou végétale en deux, distincte de la
division associée de son noyau (qui est la mitose). Fait partie de la phase M du cycle de division de
la cellule.
§ Formation du sillon de division ;

§ Anneau de contraction fait de filaments d’actine et de myosine. Le glissement de l’actine sur
la myosine à l’aide de calcium et de l’ATP. Ce glissement permet la contraction de la membrane
plasmique et la rupture de la membrane en deux, pour former deux cellules filles.
Formation de l'anneau de contraction au sillon de division.
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II. Cycle de division de la cellule (cycle cellulaire)

A. Constituants du système de régulation du cycle de division de la cellule
1. Étapes majeures déclenchées par le système de régulation du cycle
Le contrôle du cycle cellulaire s’exerce en trois points de contrôle (= checkpoint). Ils contrôlent donc la
progression dans le cycle cellulaire :
§ À l’entrée de la phase S ;
§ Lors de la transition G2/M (entrée M);
§ À la fin de la phase M ;
Régulation du cycle de division de la cellule.
2. Points de contrôle spécifiques susceptibles de bloquer le cycle de division

§ Premier point de contrôle
Le premier point de contrôle est l’entrée en phase S. La cellule intègre avec des facteurs liés à
l’environnement, des informations concernant la nécessité ou non de répliquer son matériel génétique
afin de se diviser. Une fois ce point passé on est engagé dans la division cellulaire. Ce point de contrôle
est le point R pour restrictif.
§ Deuxième point de contrôle
Le deuxième point de contrôle est la transition G2-M (avant la mitose). La cellule doit vérifier si :
- l’ADN est complètement répliqué ;
- l’ADN n’est pas endommagé ;
- l’environnement est favorable.
§ Troisième point de contrôle
Le troisième point de contrôle est la transition métaphase-anaphase. La cellule doit vérifier si tous
les chromosomes sont bien attachés au fuseau. Si nous ne vérifions pas cela, nous risquons d’avoir une
division avec des événements anormaux, et donc d’avoir des cellules anormales, qui peuvent donc
dériver vers des cellules cancéreuses.

Points de contrôle dans le système de régulation du cycle de division de la cellule.
3. Système de régulation fondé sur l’activation cyclique de protéine-kinases

Le contrôle du cycle cellulaire repose sur l’activation cyclique de Cdk, qui est de la famille des
sérine/thréonine kinases fonctionnant en partenariat avec une cycline. Toute seule, cette Cdk est
inactive ; mais quand elle se lie à une cycline, elle passe sous forme active.
Les deux constituants clés du système de régulation du cycle de division de la cellule.
Différents couples cycline-cdk sont actifs selon la phase du cycle cellulaire. En fonction de
l’activité des cyclines, nous donnons une nomenclature avec comme indication la phase. Par exemple,
les cyclines impliquées en phase S sont appelées Cdk-S.
Pour le premier point de contrôle, une fois que la concentration en cdk G1/S est accumulée en
quantité suffisante nous passons ce point de point de contrôle. Après, nous avons l’expression de Cdk-
S, puis de Cdk-M qui en augmentant induit la chute de Cdk-S. Le complexe APC/C, provoque par la suite
l’effondrement de l’activité de la cycline M au moment de la métaphase/ anaphase.
Complexe Cdk-cycline du système de contrôle du cycle de division de la cellule.
223 Année 2017 - 2018

4. Activation des Cdk par liaison aux cyclines suivie d’une phosphorylation
Base structurale de l'activation des Cdk.
Cdk seule est inactive. Quand elle se lie à une cycline, Cdk subit un changement de conformation
qui la rend partiellement active. Cette interaction cdk-cycline permet la phosphorylation des
thréonines d’une boucle de la protéine cdk (boucle T) par CAK (une kinase). Cette phosphorylation
permet d’activer complètement le complexe Cdk- cycline.
5. Répression de l’activité des Cdk par

§ Phosphorylation
Ce complexe actif est contrôlé de plusieurs façons :
- en sur-phosphorylant la Cdk : une kinase (Wee 1) phosphoryle Cdk sur un site ce

qui inhibe l’activité de cdk.
- En déphosphorylant par une phosphatase Cdc25 qui permet de repasser à un état
actif en contrant l’effet de Wee 1.
Si nous regardons juste le taux de phosphorylation de la cycline, nous ne pouvons pas prédire
l’activité résultante de la cycline, car la phosphorylation possède des effets inverses.
Répression de l'activité des Cdk par phosphorylation additionnelle du site actif.
§ Liaison à une protéine d’inhibition
Inhibition de l'activité du complexe Cdk-cycline par une CKI qui bloque le site actif de Cdk
(contrôle des phases G1 et S).
La protéine p27 (CKI), se lie au complexe Cdk-cycline. En début de phase G1, CKI inhibe
complètement l’activité de Cdk.

6. Cycles de protéolyses pour réguler le cycle de division de la cellule

Le contrôle du cycle résulte aussi de protéolyse contrôlée de composants essentiels du contrôle
cellulaire :
§ la protéine CKI peut être phosphorylée et devient alors le substrat d’une ubiquitine-ligase. Le
complexe SCF peut interagir avec CKI uniquement sous sa forme phosphorylée, nous avons
donc une ubiquitylation, et une dégradation de CKI par le protéasome.
Régulation de la protéolyse de CKI par SCF (au cours des phases G1 et S).
§ le complexe APC (complexe de promotion de l’anaphase) est le composé essentiel permettant

de passer de la métaphase à l’anaphase une fois les vérifications d’alignement et
d’attachement des chromosomes effectué. Le passage de la métaphase à l’anaphase est donc
sous l’activité du complexe APC qui est lui-même contrôlé.
Le complexe APC est de base inactif, et devient actif lorsqu’il se lie à une sous-unité d’activation
cdc20. Cette interaction entre le complexe APC et la protéine cdc20 rend possible l’ubiquitinylation de
cdk et la dégradation par le protéasome.
Régulation de la protéolyse de la cycline M par APC/C en fin de mitose.
225 Année 2017 - 2018

B. Régulation intracellulaire des événements du cycle de division cR.

1. Amorçage de la réplication une seule fois par cycle contrôlé par Cdk-S
Contrôle de la duplication des chromosomes.
Le complexe cycline S-Cdk phosphoryle des protéines au niveau des origines de réplication de
l’ADN, induit la synthèse d’histones et initie la réplication de l’ADN une seule fois par cycle. Tous ces
événements ne peuvent pas se produire en présence du complexe cycline M-cdk.
Une fois que nous avons passé le check-point métaphase, nous avons activation du complexe
APC/cdc20 et une inactivité de la Cdk-cycline M. Il est donc possible de faire de nouveaux assemblages
de nouveaux complexes de pré-réplication aux origines de réplication.
2. Activation des complexes Cdk-M pour l’entrée en mitose
Régulation de l'activation de Cdk-M pour l'entrée en mitose en fin de G2.
La cycline M se lie au Cdk 1. Le complexe cycline M-Cdk est phosphorylé par CAK (une kinase
activatrice) et par Wee1 (une kinase inhibitrice). Le complexe est alors doublement phosphorylé et
inactif. Cdc25 est une phosphatase, qui se fixe au complexe cycline / M-cdk inactive. Cdc25 active donc
le complexe en le déphosphorylant.
Le complexe cycline M-cdk active exerce un rétrocontrôle positif sur la phosphatase cdc25 (en la
phosphorylant) et la kinase Wee1.

Remarque. – En fait le complexe va inhiber Wee1, ce qui entraîne une inhibition de l’inhibition
engendrée par Wee1, c'est-à-dire que ce rétrocontrôle augmente la formation de complexe actifs.
3. Réplication complète de l’ADN nécessaire à l’entrée en mitose
Pour entrer en mitose, il faut que la réplication ait été complète.
§ Si nous traitons avec de la caféine, nous avons une mitose normale.
§ Si nous traitons les cellules avec de l'hydroxy-urée, nous bloquons la synthèse

cellulaire : arrêt en phase S.
§ Si nous traitons avec de l'hydroxy-urée et de la caféine en forte concentration, nous

allons observer une mitose suicide.
La caféine a la capacité de contourner le point de restriction, il y a alors une division cellulaire

mais anormale, ce qui enclenche le programme d’apoptose.
4. Préparation à la séparation des chromosomes répliqués par Cdk-M

§ Phosphorylation directe des lamines par Cdk-M et rupture de l’enveloppe nucléaire : en
effet, la phosphorylation des lamines fait qu’elles se détachent, ce qui entraîne la rupture
de l’enveloppe nucléaire. Puis la déphosphorylation des lamines entraîne la fusion des
fragments du noyau, pour reformer les deux noyaux.
§ Condensation des chromosomes par les cohésines et les condensines : la cycline M-Cdk
phosphoryle les condensines, et participe donc à la condensation des chromosomes.
§ Mise en place du réarrangement du complexe des microtubules : la cycline M-Cdk

phosphoryle les protéines qui régulent le devenir des microtubules permettant d’avoir
des chromosomes bien alignés sur la plaque équatoriale.
5. Séparation des chromatides sœurs déclenchée par protéolyse

§ Protéolyse de la sécurine pour activer la séparase qui coupe les cohésines
Le complexe cycline M-Cdk active le complexe APC, en contrôlant l’interaction entre le complexe
APC et Cdc20. Une fois que le complexe APC actif est en quantité suffisante, il entraîne la protéolyse
de la sécurine pour activer la séparase. Cette séparase coupe les cohésines et permet la dissociation
des chromosomes.
Déclenchement de la séparation des chromatides sœurs par APC/C.
227 Année 2017 - 2018

6. Protéolyse de la cycline M induite par APC/C en fin de mitose
Régulation de la protéolyse de la cycline M par APC/C en fin de mitose.
Le complexe APC-Cdc20 a en retour un effet sur le complexe cycline M-Cdk. Il entraîne

l’ubiquitinylation de la cycline M. Cette dernière est alors dégradée par le protéasome.
Le taux de complexe cycline M-Cdk diminue sous l’action du complexe APC-Cdc20. Mais comme
le complexe cycline APC-Cdc20 dégrade son précurseur, il y a également une baisse du taux de
complexe APC-Cdc20.
7. Cdk inactif de façon stable en phase G1

Cdh1 agit comme Cdc20 ; cependant, alors que Cdh1 et Cdc20 se lie à APC et l’activent, leur action
diffère car :
§ le complexe APC- cdc 20 est activé par le complexe cycline M-Cdk ;
§ le complexe APC-Cdh1 est inhibé par cycline M-Cdk qui phosphoryle Cdh1 directement.
Par conséquent :
- l’activité du complexe APC-cdh1 augmente en fin de mitose lors de la destruction
de la cycline M par le complexe APC-Cdc20.
- la destruction de la cycline M par APC-Cdh1 continue après la mitose.
Protéolyse de la cycline M par APC/C en fin de mitose Cdk inactif de façon stable en phase G1.

8. Frein exercé sur la transcription par la protéine Rb dans les cellules en G1
Mécanismes qui contrôlent l'entrée de la cellule dans le cycle de division et l'amorçage de la phase S dans les c. animales.
Les grandes voies d’activation de la mitose sont la voie Ras et la MAP kinase. Lorsqu’il y a
activation de MAP kinase, il y a activation de la transcription de protéines de régulation de l’expression
de gènes. La protéine Myc (protéine de régulation) est ainsi synthétisée. Cette protéine augmente
donc l’expression des gènes codant pour Cdk-G1 (cycline D-Cdk4).
Mécanismes qui contrôlent l'entrée de la cellule dans le cycle de division et l'amorçage de la phase S dans les c. animales.
En l’absence de stimulation mitogènes, l’expression des gènes dépendants de la protéine E2F est
inhibée par une interaction entre la protéine E2F et des membres de la famille des protéines Rb.
Remarque. – La protéine Rb a été identifiée initialement au cours de l’étude d’une forme

héréditaire de cancer de la rétine chez l’enfant (rb). La perte des deux copies du gène Rb entraîne
une prolifération excessive des cellules de la rétine immature ce qui suggère que Rb est
particulièrement importante pour contrôler le taux de division des cellules de la rétine. Elle a pour
rôle de freiner la division cellulaire en inactivant la protéine E2F.
229 Année 2017 - 2018

La stimulation de la division par des signaux exogènes entraîne l’accumulation de la cycline D et

l’activation de CdkG1.
Cdk-G1 active phosphoryle la protéine Rb. Cette phosphorylation inactive la protéine Rb et libère
la protéine E2F. Le facteur de transcription E2F stimule la transcription des cyclines de G1/S et de S,
ainsi que sa propre transcription.
La Cdk-G1/S active et la Cdk-S active induisent un rétrocontrôle positif pour continuer à avoir une
inhibition de la protéine Rb, et une activation de la protéine E2F.
Ce rétrocontrôle positif est important car si l’inhibition de la protéine Rb n’est pas suffisante, la
progression vers G1 est alors ralentie voire inhibée.
9. Coordination de la croissance et du cycle de division des cellules

Pendant les phases G1 et G2 la cellule grossit. Elle doit grossir suffisamment avant de se diviser.
Chez la levure, nous avons des mutants qui ont une perte de la division cellulaire. Lorsque nous
réduisons les nutriments, nous allongeons le temps entre deux divisions cellulaires : la vitesse de
synthèse des constituants de la cellule ralentit. Nous déclenchons la division lorsque la cellule sera à
taille requise.
Stimulation de la croissance des cellules par les facteurs de croissance et les nutriments.
Il y a un contrôle de l’apport en nutriment par un récepteur liant les facteurs de croissance. Ce

récepteur active une protéine PI3 kinase phosphorylant un PI ancré à la membrane.
Ce PIP3 ainsi que l’apport d’AA active la protéine Tor ainsi que d’autres facteurs protéiques ayant
une action phosphorylante et induisant la synthèse des protéines et la croissance de la cellule.
10. Point de contrôle de l’intégrité de l’ADN par p53
Point de contrôle de l'intégrité de l'ADN par p53.

Comment les lésions de l'ADN

arrêtent le cycle de division de la cellule en G1?
L’ADN endommagé initie une voie de signalisation en activant une protéine kinase d’une paire de
protéines kinases apparentées appelée ATM et ATR.
Les protéines kinases ATM/ATR activées entraînent l’activation de la protéine kinase Chk1/chk2.
Remarque. – Ces kinases, lorsqu’elles sont mutées, sont responsables de cancers ;

d’hypersensibilité aux radiations (provoquant cassures de l’ADN).
La protéine kinase Chk1/chk2 phosphoryle la protéine p53. Cela entraîne la dissociation de la

protéine p53 et de la protéine Mdm2.
À la base la protéine Mdm2 est la ligase de l’ubiquitinylation de p53 ce qui empêche son activité.
Mais une fois phosphorylée, la protéine p53 se dissocie de cette ligase et n’est plus dégradée par le
protéasome. Cette protéine p53 s’associe aux régions de régulation du gène de la protéine p21.
Remarque : une mutation de la protéine p53 entraîne une absence de contrôle donc une division
cellulaire peu importe l’état de l’ADN. Cette protéine modifiée est ainsi impliquée dans de nombreux
cas de tumeurs.
La protéine p21 a comme rôle l’inhibition de complexe Cdk-G1/S. La protéine p21 stoppe donc le
cycle de division de la cellule en G1.
11. Résumé du système de régulation du cycle de division des cellules
Résumé du système de régulation du cycle de division des cellules.
231 Année 2017 - 2018

III. Apoptose et mort de la cellule

A. Définitions : nécrose et apoptose
Une cellule peut se différencier en plusieurs types de cellule mais n’a qu’un seul destin cellulaire
qui est la mort. Ce processus est un processus de mort cellulaire programmé.
ÙÙ
Apoptose. – Forme de mort des cellules, appelée aussi mort cellulaire programmée, qui est la
conséquence de l’activation d’un programme de suicide à l’intérieur de la cellule. Cette activation
conduit à la fragmentation de l’ADN, à la contraction du cytoplasme, à des changements de la
membrane, sans qu’il y ait lyse ou atteinte des cellules du voisinage. L’apoptose est un phénomène
normal qui survient fréquemment dans un organisme multicellulaire.
Apoptose. – Importante pour l’individualisation des différents doigts (elle sert à des processus de
développement). Elle sert aussi dans le système nerveux où il y a production de trop de neurones,
une grosse quantité est dégradée lors de la croissance et lors des processus de remaniement des
circuits qui surviennent tout au long de la vie.
ÙÙ
Nécrose. – Mortification des tissus osseux et cartilagineux et, par extension, de tout tissu.
Nécrose Apoptose
Conditions de mort catastrophiques programmées
Modalités passives actives
Cibles groupe de cellules Cellules isolées
Perte de l'adhérence à la lame basale tardive précoce
Volume de la cellule augmenté diminué
Densité de la cellule diminuée augmentée
Organites lysés compacts
Libération du contenu des lysosomes oui non
au hasard, entre les nucléosomes,

Fragmentation de l'ADN
dernière étape étape 1
Noyau disparition fragmentation
Atteinte de la membrane plasmique première étape dernière étape
Évolution de la cellule désintégration en corps d'apoptose
Phagocytose par cellule voisine non oui
Inflammation oui non
Cicatrice oui non

B. Marqueurs biochimiques des cellules en apoptose

Pour mettre en évidence le noyau des cellules en apoptose on peut utiliser le marquage TUNEL (Tdt-
mediated dUTP nick end labeling) qui consiste en un marquage au dUTP des extrémités 3’-OH libres
de l’ADN grâce à la TdT (désoxynucléotidyl transférase terminale). Cela permet de mettre en évidence
des coupures double brin de l’ADN ; ainsi, en cas d’apoptose, où l’ADN se retrouve fragmenté, on
aura un marquage important.
C. Apoptose déclenchée par une cascade de protéolyses intracellulaires

1. Caspases : famille de protéases de spécificités multiples
ÙÙ
Caspases. – Protéases d’une même famille qui possèdent une cystéine à leur site actif et coupent
leurs protéines cibles sur des acides aspartiques spécifiques après qu’elles ont été activées par
d’autres caspases. Est définie comme caspase toute protéase de cette famille qui participe à
l’amorçage des événements qui vont conduire à l’apoptose.
Remarque. – Caspase : « C » pour la cystéine qui se trouve au site actif et « asp » pour le site de
coupure de la protéine cible.
2. Activation des caspases par protéolyse de pro-caspases
Activation de la procaspase au cours de l'apoptose.
Les caspases sont activées par protéolyse de procaspases. Les caspases présentent dans la cellule
doivent être contrôlées. C’est pourquoi elles sont présentes sous forme de procaspases (= inactives).
Pour activer les caspases, il y a formation d’un tétramère par dissociation des extrémités N-
terminale et C-terminale. La caspase est alors capable d’amplifier l’activité protéolytique. La première
caspase activée a comme cibles d’autres caspases. D’où le phénomène de cascade.
3. Auto-activation et activation irréversible de toutes les caspases
Activation de la procaspase au cours de l'apoptose.
233 Année 2017 - 2018

L’activation de procaspases au cours de l’apoptose a donc permis la formation de caspases

actives. Ces caspases en grand nombre vont avoir pour rôle de réaliser des coupures protéolytiques de
protéines cytosoliques ainsi que des coupures protéolytiques des laminines du noyau.
D. Activation initiale des pro-caspases

L’activation initiale de la cascade de protéolyse est très importante. Il y a deux grandes voies
d’activation initiale des procaspases.
1. Par la voie extrinsèque

La voie extrinsèque correspond à une apoptose d’origine immunitaire. Certains lymphocytes vont
provoquer l’apoptose de cellules, pour se débarrasser de cellules qui synthétisent des virus, ou des
cellules cancéreuses.
Il y a activation des récepteurs FAS (= récepteur de mort). Le ligand est présent sur le lymphocyte.
La liaison entre le ligand FAS et le récepteur FAS est à l’origine de l’activation du récepteur. Le
récepteur activé recrute des protéines adaptatrices (FADD) et dans un deuxième temps les
procaspases. Les procaspases sont clivées en caspases. L’ensemble protéine adaptatrice et caspases
forme le DISC. Les caspases d’amorçage enclenchent la réaction de mort cellulaire.
Activation extrinsèque de la voie de l'apoptose par l'intermédiaire des récepteurs de mort FAS.
2. Par la voie intrinsèque

Les cellules peuvent activer leur programme d’apoptose à partir de l’intérieur de la cellule en
général en réponse à une blessure (exemple : un dommage sur l’ADN).
La mitochondrie libère du cytochrome-C qui va se lier sur une protéine Apaf-1 ce qui l’active. Une
fois activée, son domaine CARD hydrolyse du dATP qui lui est associé en dADP. Ensuite, la cellule
assemble l’apoptosome, qui est induit par la libération de dADP échangé contre du dATP.
L’apoptosome recrute des caspases grâce à leur domaine CARD (dont la procaspase 9). La caspase 9
coupe et active des procaspases d’exécution. Au final, il y a formation d’une cascade de caspases
aboutissant à l’apoptose.

La voie intrinsèque de l'apoptose.
E. Protéines pro-apoptose et anti-apoptose

1. Structure conservée
Ce sont des protéines qui contrôlent la voie intrinsèque de l’apoptose. Les protéines pro-apoptose
et anti-apoptose possèdent une structure conservée. Il y a des domaines en commun suggérant qu’il
y avait un ancêtre commun.
2. Rôle des protéines pro et anti-apoptose

La protéine BH123 (surtout Bax et Bak) est une protéine de la membrane externe mitochondriale
qui, une fois activée, permet la sortie des protéines de l’espace inter-membranaire (cytochrome C). La
protéine BH123 est donc une protéine pro-apoptotique, car elle stimule la voie intrinsèque.
Rôle des protéines pro-apoptose BH123 (principalement Bax et Bak) dans la libération des protéines inter-membranaires de
la mitochondrie dans la voie intrinsèque de l'apoptose.
La protéine Bcl2 est une protéine anti-apoptotique. Elle inhibe l’action de la protéine BH123.
Régulation de la voie intrinsèque de l'apoptose par les protéines Bcl2 anti-apoptose.
235 Année 2017 - 2018

Une protéine activée à domaine BH3 inhibe la protéine Bcl2. Cela lève l’inhibition de la protéine
BH123. La voie intrinsèque de l’apoptose est donc stimulée.
Régulation de la voie intrinsèque de l'apoptose par les protéines pro-apoptose à domaine BH3 seulement et Bcl2 anti-
apoptose.
3. Voies mises en jeu par les facteurs de survie

§ Production augmentée de la protéine anti-apoptose Bcl2
Un facteur de survie se lie à la surface de la cellule activant un récepteur, et des protéines de

régulation de transcription des gènes, qui vont se lier au noyau et synthétiser la protéine anti-apoptose
Bcl2.
Augmentation de la production de la protéine anti-apoptose Bcl2.
§ Inactivation de la protéine pro-apoptose BAD
La protéine BAD est active quand elle est liée à Bcl2 rendant cette dernière inactive. Quand un
facteur de survie arrive à la surface de la cellule, en plus de l’augmentation de la synthèse de Bcl2 (qui
ne contient que le domaine BH3), nous allons avoir une phosphorylation de BAD induisant sa
dissociation de Bcl2 inactif, le rendant actif, cela permet un blocage de l’apoptose.
Inactivation de la protéine pro-apoptose BAD.

Fiche résumé division et cycle de division de la

cellule, apoptose
Nécrose Apoptose
Conditions de mort catastrophiques Programmées
Modalités passives Actives
Cibles groupe de cellules Cellules isolées
Perte de l'adhérence à la lame tardive Précoce
basale
Volume de la cellule augmenté Diminué
Densité de la cellule diminuée Augmentée
Organites lysés Compacts
Libération du contenu des oui Non
lysosomes
Fragmentation de l'ADN au hasard, entre les
dernière étape nucléosomes,
étape 1
Noyau disparition Fragmentation
Atteinte de la membrane première étape dernière étape
plasmique
Évolution de la cellule Désintégration en corps d'apoptose
Phagocytose par cellule Non Oui
voisine
Inflammation Oui Non
Cicatrice Oui Non
Formation Programme
Cyt c se lie à
Marqueur apoptose : TUNEL apoptosome intracellulaire
Apaf 1. Actif
par libération libère
domaine CARD
d'ADP produit. cytovchrome c
hydrolyse du
Formation Liberation de la
dATP
Ligand FAS sur Recrutement complexe caspase mitochondrie
recepteur FAS FADD
DISC
Procaspases
Caspases
Apoptose
Protéine pro apoptose : BH123 voie intrinsèque, BH3 et BAD
Protéine anti apoptose : Bcl2
237 Année 2017 - 2018

Remerciements et Remarques
§ Un grand merci aux personnes qui ont donné de leur temps à la rédaction du contenu :
- Antoine CHANZY
- Marie VILLARD
Responsable de la matière : Anaïs PELLISSIER
§ Responsables Supports Pédagogiques :
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- Julien CHABAUD-SASSOULAS
Pour toutes suggestions, remarques et corrections, vous pouvez vous rendre sur le forum dédié
aux Polys dans le module Spiral du Tutorat.
Il s'agit de la troisième année d’existence des Polys du Tutorat. Ce poly sera bien sûr amélioré
dans son contenu et dans sa forme au cours des années à venir.
Les Polys du Tutorat sont rédigés à partir des cours de l'année précédente. Ils n'ont aucune valeur
de référence de cours. Ils ne peuvent en aucun cas servir de référence opposable au concours PACES,
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PACES est le cours magistral donné en amphithéâtre par l'enseignant.
Le Tutorat déconseille fortement de se fier uniquement aux polys et de négliger les cours
magistraux. Une écoute active associée à une prise de notes efficace, puis un recopiage au propre reste
la méthode la plus appropriée à l'apprentissage des cours.
Informations de législations concernant les polycopiés

Ce polycopié est réservé à un usage personnel.
La copie, diffusion totale ou même partielle de ce polycopié est interdite

en dehors du cadre du Tutorat PACES Lyon-Est.

Remerciements et Remarques
239 Année 2017 - 2018

Polycopié UE2 2017-2018 (Définitif)

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ÉDITION 3

La parole du professeur au cours de la présente année universitaire fera toujours foi.

Informations concernant l'UE2 et son polycopié

3 Année 2017 - 2018

Tutorat PACES Lyon Est 4

B. Caractéristiques du code génétique............................................................................................................. 59

5 Année 2017 - 2018

B. Origines possibles de ces organites ............................................................................................................ 104

Tutorat PACES Lyon Est 6

VIII. Transport à partir de la membrane plasmique : endocytose ............................................................................ 156

7 Année 2017 - 2018

A. Introduction ............................................................................................................................................... 188

Tutorat PACES Lyon Est 8

De la cellule au noyau et à l’ADN, support de l’hérédité

§ 1928-1935. – Découverte de la liaison chimique par Linus Pauling.

II. Localisation de l’information génétique dans la cellule

9 Année 2017 - 2018

§ Nous prenons un noyau de cellule germinale d’une souris grise.

La souris naissante est alors de couleur grise.

Schéma de la première expérience.

Le noyau porte l’information génétique et a déterminé la couleur de la souris

receveuse (noire), n’ont pas eu d’inﬂuence dans la transmission des caractères

Tutorat PACES Lyon Est 10

Remarque. – correspond à la numérotation du schéma bilan de l’expérience ci-dessous.

Schéma de la seconde expérience.

La conclusion est identique à celle de l'expérience précédente, à savoir :

11 Année 2017 - 2018

B. Utilisation par la cellule de l’information contenue dans le noyau

§ Expérience 1. – Sections et régénérations.

§ Expérience 2. – Transplantation du noyau.

§ Expérience 3. – Greffe croisée des noyaux.

Schéma de l'expérience 3. – Greffe croisée des noyaux.

La cellule utilise l'information génétique contenue dans le noyau.

Deux noyaux identiques provenant de cellules issues de la division d'une cellule

Tutorat PACES Lyon Est 12

Il apparaît ici une autre notion importante qu'est la notion de clonage.

III. Nature chimique du matériel génétique

Nature de l’injection chez la souris Conséquence sur la souris

Souche S tuée par la chaleur SURVIE

Souche S tuée par la chaleur + souche R

Un principe actif transféré de la souche S, pourtant rendu inoffensif par la chaleur, a

13 Année 2017 - 2018

2. Recherche du principe actif transformant – Expérience d’Oswald T. Avery

§ Premièrement, la capside polysaccharidique de la souche S seule ne peut pas transformer

§ Deuxièmement, grâce au microscope nous identifions que la pathogénicité de la souche

B. Découverte de la fonction d’un gène

2. Expérience de Beadle et Tatum

Métabolisme AVANT rayons X Métabolisme APRÈS rayons X

Levures : plus capables de pousser dans un milieu

Tutorat PACES Lyon Est 14

Schéma du principe de l'expérience de Beadle et Tatum.

cellules de levures ce qui bloque la synthèse d'arginine à différents niveaux.

C. Redécouverte de la substance transformante

Revenons maintenant à l’époque de l’expérience du Blender. Pour connaître le rôle des

§ le soufre 35 (35S) va marquer radioactivement une protéine de la capside du phage. Si

15 Année 2017 - 2018

§ Les éléments les plus légers restent en surface et forment le surnageant.

Phosphore 32 (32P) OUI NON

Soufre 35 (35S) NON OUI

D. ADN support de l’information génétique

2. Découverte et composition chimique de la « nucléine »

Rappel. – Composition des acides nucléiques :

Tutorat PACES Lyon Est 16