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Stratégies en protéomique: outils, limites et développement

Article · January 2001

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Jérôme Garin Myriam Ferro

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Norbert Rolland
French National Centre for Scientific Research
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 1

Stratégies en protéomique : outils, limites et développement

Jérome GARIN1, Myriam FERRO1, Norbert ROLLAND2 & Jacques JOYARD2
(1) Laboratoire de Chimie des Protéines, Département de Biologie Moléculaire et Structurale,
CEA-Grenoble, 17 rue des Martyrs, 38054 Grenoble-cedex 9
Email : jgarin@cea.fr ; mferro@cea.fr
(2) Laboratoire de Physiologie Cellulaire Végétale, UMR 5019 (CNRS/CEA/Université Joseph
Fourier), Département de Biologie Moléculaire et Structurale
CEA-Grenoble, 17 rue des Martyrs, 38054 Grenoble-cedex 9
Email : nrolland@cea.fr ; jjoyard@cea.fr

Introduction
Le protéome se définit comme l’ensemble des
protéines codées par un génome. La protéomique
offre la possibilité nouvelle d'identifier et de
quantifier les protéines exprimées par une cellule à
un moment donné, dans un tissu donné et un
environnement donné, à divers états de
développement, dans des contextes physiologiques
et pathologiques variés (Dutt & Lee, 2000 ;
Godovac-Zimmermann & Brown, 2001 ; Mann &
Pandey, 2001 ; Rossignol, 2001). Un organisme
possède donc une très grande diversité de
protéomes alors qu'il ne renferme qu'un seul
génome. C'est une différence fondamentale entre
protéome et génome qui doit conduire à une
approche réaliste de l'analyse protéomique. Chez
les procaryotes, le protéome est une notion assez
simple (un seul compartiment, un nombre restreint
de protéines, peu de modifications post-
traductionnelles). A l'opposé, un vertébré supérieur
renferme environ 200 tissus différents, dans une
dizaine de contextes développement aux et
physiologiques, sans compter les situations
pathologiques, ce qui se traduit par l'existence de
milliers de protéomes. Le cas des plantes est a
priori plus simple car le nombre de tissus semble
plus restreint. Cependant, l'extrême dilution des
ressources nutritives dans l'environnement (CO2,
ions minéraux, et souvent eau) fait que la plupart
des cellules de la plante sont directement
confrontées aux conditions environnementales,
contrairement à leurs homologues du monde
animal, protégées par l'homéostasie du milieu
intérieur. Les cellules des plantes supportent les
conditions agressives d'un milieu extérieur
continuellement fluctuant grâce à des adaptations
aux stress environnementaux variés et fréquents
(carences en nutriments, stress hydrique, excès ou
défaut de lumière, fluctuations brutales de la
température, agressions par une grande diversité
d'agents pathogènes, etc.). Ces adaptations sont
une marque distinctive du métabolisme végétal. La
lumière est un autre facteur de l'environnement
ayant un impact majeur non seulement sur le
métabolisme général mais aussi sur la croissance et
le développement de la plante. Dans toutes ces
conditions, l'expression du génome varie
considérablement, conduisant à une grande
diversité des protéomes cellulaires et subcellulaires
en réponse à ces modifications de l'environnement.
L'analyse protéomique est un outil extraordinaire-
ment puissant qui peut être utilisé dans de très
nombreux domaines, tant au niveau d’études
fondamentales qu’au niveau d’études appliquées
en particulier en biologie végétale et pour
l'agriculture. Le but de cette approche holistique
consiste à avoir une vision plus globale et donc
plus juste du fonctionnement de la cellule (pour
une revue, voir Godovac-Zimmermann & Brown,
2001). Cependant, une approche de type
protéomique ne désigne aujourd’hui plus
seulement des travaux visant à caractériser le
protéome d’une cellule ou d'un tissu, mais plutôt
une étude utilisant les outils de la protéomique
(électrophorèse, chromatographie et spectrométrie
de masse) dans le but de réaliser une analyse
systématique des protéines contenues dans un
échantillon plus ou moins complexe ; on parle
ainsi d’approche protéomique pour des études qui
visent à caractériser les protéines d’un
compartiment subcellulaire, les constituants d’un
complexe multi-protéique ou encore les acteurs
protéiques d’une voie de signalisation. D'autre
part, l’identification de nouvelles protéines par une
approche protéomique représente un moyen
d’identifier de nouveaux gènes, en particulier pour
les organismes dont le génome n’a pas été
séquencé et pour ceux pour lesquels les
programmes automatiques de prédiction de
séquences codantes sont peu fiables. De plus, une
analyse fine des informations obtenues sur chaque
protéine peut permettre de repérer avec précision

Ecole thématique Biologie végétale - 2001

 2
les bordures d’exons. En cela, la protéomique
constitue un puissant outil pour l’annotation des
génomes (pour une revue, voir Mann & Pandey,
2001). Enfin, il faut souligner que si l'intérêt
manifesté actuellement pour la protéomique n'est
pas propre aux modèles végétaux, de nombreuses
équipes de cette discipline ont contribué de
manière significative à son développement
(Thiellement et al., 1999 ; Rossignol, 2001).
(1) Séparation des protéines
(par ex. par électrophorèse 2D)
(2) Digestion des protéines par la trypsine
Mélange de peptides
(3) Analyse par spectrométrie de masse
Maldi-TOF MS/MS
Carte peptidique Séquences
massique peptidiques
(4) Analyse des banques de données
Identification
Figure 1. Les différentes étapes de l'analyse
protéomique.
Les outils de la protéomique
L’analyse protéomique se décompose en plusieurs
étapes (Figure 1). La première est une étape de
séparation des protéines (classiquement en utilisant
l’électrophorèse 2D), permettant idéalement
d’obtenir des polypeptides individualisés, puis une
étape de caractérisation permettant d’identifier les
polypeptides d’intérêt. Les protéines sont repérées
sur le gel à l’aide d’une coloration appropriée
avant d’être analysées par microséquençage ou par
spectrométrie de masse. Nous reviendrons plus
loin sur le problème de la séparation des protéines
en prenant l'exemple de l'analyse des protéines
membranaires. L’identification des protéines a
longtemps été réalisée par le biais du
microséquençage chimique (chimie récurrente
d’Edman). Aujourd’hui, cette approche a été
remplacée par les techniques de spectrométrie de
masse, techniques beaucoup plus sensibles et
rapides (environ 104 fois plus que le micro-
séquençage selon Edman), qui ont littéralement
révolutionné la microanalyse des protéines. Dans
une dernière étape, les données obtenues (carte
peptidique massique, microséquences) sont alors
comparées (BLAST) aux informations de séquence
protéiques ou nucléiques des bases de données
pour identification de la protéine.
Spectromètres de masse et protéomique. Il existe
plusieurs types de spectromètres de masse
utilisables pour l'analyse protéomique: Maldi-TOF,
MS/MS, etc... Un appareil de type MALDI-TOF
(pour "Matrix Assisted Laser Desorption/
Ionization Time-of-Flight mass spectrometry")
permet d'obtenir une carte peptidique massique
représentant la distribution des masses des
fragments peptidiques obtenus par digestion
trypsique d'une protéine (voir ci-dessous). Le
fonctionnement d'un MALDI-TOF est décrit sur le
site Web du Centre de Biophysique Moléculaire du
CNRS à Orléans (voir références en fin d'article).
Le MALDI est une méthode d'ionisation
permettant d'analyser des molécules de hautes
masses moléculaires (peptides, protéines,
oligonucléotides,...). Les ions formés sont
accélérés grâce à une haute tension appliquée sur
une grille et envoyés dans un tube de vol où ils
volent jusqu'au détecteur. Les ions ayant une
masse élevée voleront plus lentement que les ions
ayant une masse plus faible.
Dans un spectromètre de masse en mode tandem
(ou MS/MS), comme le spectromètre de masse de
type ESI-MS/MS (ESI : electronspray ionisation),
ou Q-TOF-MS/MS (pour Quadrupole-TOF) il est
possible d'obtenir des informations de séquence.
Le fonctionnement d'un ESI-MS/MS est décrit sur
le site Web du Centre de Biophysique Moléculaire
du CNRS à Orléans (voir références en fin
d'article). Au départ, on crée un electrospray
(formé de micro-gouttelettes hautement chargées)
à partir de l'échantillon à analyser. Il est produit en
appliquant un fort champ électrique, à pression
atmosphérique, à un liquide passant à travers un
tube capillaire avec un faible débit. Les
microgouttelettes formées permettent la désorption
de molécules multichargées. Ces espèces multi-
chargées rendent possible l'analyse de molécules
de haut poids moléculaire sur des analyseurs
quadripolaires conventionnels (spectromètre de
masse MS/MS) (Wilm et al., 1996).
Etablissement de cartes peptidiques massiques.
Concrètement, la protéine est digérée par une
protéase spécifique (en général la trypsine, figure
Ecole thématique Biologie végétale - 2001
 3
2), les masses des peptides obtenus sont mesurées
avec une grande précision (50 ppm) par spectro-
métrie de masse MALDI-TOF ; l’ensemble de ces
masses constitue la carte peptidique massique de la
protéine, carte qui s’avère être une véritable
empreinte digitale (Figure 3). La protéine peut être
identifiée en comparant la carte peptide massique
obtenue expérimentalement aux cartes peptidiques
massiques théoriques déduites de chacune des
séquences présentes dans les banques de données
protéiques (en effectuant une digestion in silico de
chacune de ces protéines par la trypsine).
Lys Arg Arg
Trypsine
m1 m3
m4
m2
Figure 2. Obtention de peptides à partir d'une protéine
par digestion par la trypsine. La trypsine coupe après
une lysine ou une arginine si l’acide aminé suivant n’est
pas une proline. Chaque fragment trypsique a une masse
différente (m1,m2, m3, m4…) qui peut être déterminée à
l'aide d'un spectromètre de masse de type Maldi-Tof
(voir figure 3). Chaque peptide obtenu par digestion
trypsique peut être fragmenté (par collision avec de
l'argon) dans un spectromètre de masse en tandem, il est
alors possible de déterminer sa séquence (voir figure 4).
100
X
X
X 0
Figure 3. Spectre obtenu par Maldi-Tof à partir du
transporteur de malate/oxoglutarate de l'enveloppe des
chloroplastes. Les pics indiqués par correspondent aux
masses des peptides obtenus par digestion trypsique.
Les pics indiqués par X correspondent à des peptides
dérivés de la trypsine. Cette carte peptidique massique
permet d'identifier la protéine de manière non ambiguë
en comparant les masses des peptides avec celles des
peptides dérivés des protéines présentes dans les bases
de données protéiques.
L’intérêt d’une telle approche réside bien entendu
dans le potentiel énorme de la spectrométrie de
masse MALDI-TOF, tant en terme de sensibilité
qu’en terme de rapidité d’analyse : en dehors de
toute automatisation il est possible d’identifier en
routine une vingtaine de protéines par jour à partir
de quantités aussi faibles que 200 à 500
femtomoles.
Séquençage peptidique par spectrométrie de
masse en mode tandem (MS/MS). Dans le cas de
protéines inconnues, c’est à dire non répertoriées
dans les banques de données protéiques, l’identi-
fication par carte peptidique massique est inopé-
rante. On utilise alors un spectromètre de masse en
mode tandem (MS/MS) de type Q-TOF. Il permet
de sélectionner un à un les peptides provenant de
la digestion trypsique de la protéine étudiée (voir
figure 2). Chaque peptide est alors fragmenté (par
collision avec de l'argon) dans le spectromètre de
masse ; l'analyse des fragments (spectre MS/MS)
permet de déterminer des éléments de la séquence
en acides aminés du peptide (Figure 4), séquence
qui sera utilisée pour chercher à identifier la
protéine dans les banques protéiques et
génomiques (voir figure 1). Toutefois, l’interpréta-
tion des spectres MS/MS ne permet de déterminer
qu’une séquence partielle du peptide analysé ;
celle-ci, complétée à la fois par la mesure de la
masse du peptide analysé et la position de cette
séquence sur le peptide, constitue un "Peptide
Sequence Tag" (PST). Les PSTs permettent de
sonder avec une grande efficacité les banques
protéiques et d’ESTs (Neubauer et al., 1998).
R P Q G P M W E (158.10)
159.09
554.33
% 288.14 685.37
272.17
871.46
1000.49 1157.57
100 500 1000 1200
M/z
Figure 4. Spectre MS/MS permettant de déterminer la
séquence d'un peptide. Le spectre obtenu permet de
déterminer la séquence suivante : RPQGPMWE.
Analyse protéomique et compartimentation
cellulaire
Les approches protéomiques classiques (analyse
d’extraits cellulaires totaux) présentent des limites
liées à des problèmes biologiques et technologi-
ques inhérents à l’analyse des protéines. L'analyse
des compartiments cellulaires est une réponse
efficace, mais partielle, à ces contraintes.
Les limites de l'analyse protéomique à partir
d'électrophorèse 2D. L’hétérogénéité chimique
Ecole thématique Biologie végétale - 2001
 4
des protéines est le premier grand problème de
l’analyse protéomique. En général, le point
isoélectrique (pI) des protéines varie de 1 (par
exemple pour la pepsine) à plus de 12 et la masse
moléculaire de moins de 5 000 à plus de 300 000
daltons (Figure 5). Cette hétérogénéité constitue un
premier défi au niveau de l’analyse des protéines
par des méthodes électrophorétiques utilisant pI et
masse moléculaire comme critères de séparation. Il
est donc nécessaire de développer de nouvelles
méthodes d’analyse pour les protéines qui ne sont
pas résolues par les techniques d’électrophorèse
bidimensionnelle classiques (pI <3 ou >8, poids
moléculaire < 10 kDa ou > 100 kDa). Un stratégie
mise en œuvre par certains groupes est d'élargir le
spectre de l’analyse en gel 2D en cherchant à
étendre la fenêtre d’analyse en pI et Mr (Chevallet
et al., 1998).
4.0 pH 8.0
Mr
(kDa)
97.4
66.2
45.0
31.0
21.5
14.4
Figure 5. Séparation par électrophorèse bidimension-
nelle des polypeptides de l’enveloppe des chloroplastes
d’épinard. Les polypeptides de l’enveloppe sont séparés
selon le point isoélectrique et la masse moléculaire sur
un gel 2D. Malheureusement, une partie seulement des
polypeptides de l’enveloppe sont séparés par cette
méthode. D’une part, la gamme de pH utilisée (4,0 à
8,0) élimine les polypeptides basiques de l’enveloppe et
en particulier deux des polypeptides majeurs de
l’enveloppe, IE30 et IE37 (ils représentent à eux deux
plus de 25 % des protéines de l’enveloppe). IE30 est le
transporteur de phosphate/triose phosphate et IE37 est
une méthyltransférase. D’autre part, les protéines de
l’enveloppe les plus hydrophobes ont tendance à
précipiter dans la première dimension (Adessi et al.,
1997). De fait, cette première dimension concentre les
contaminants solubles du stroma présents dans la
préparation. Il est alors impossible de les retrouver sur
le gel. Ainsi, un tel gel, apparemment satisfaisant sur le
plan technique, ne permet pas d'analyser de nombreuses
protéines membranaires de l'enveloppe.
La seconde limite réside dans les différences de
solubilité des protéines qui découle de leur
hétérogénéité chimique. Par rapport à une
solubilité quasi-idéale dans l’eau, tous les cas de
figures se rencontrent à l’intérieur de la cellule,
depuis les protéines très solubles jusqu’aux
protéines à domaines transmembranaires multiples
enchâssées dans les bicouches lipidiques. Ce
problème de solubilité biaise la représentation des
protéines faiblement solubles dans les cartes
d’électrophorèse bidimensionnelle. En fait, les
protéines membranaires sont très difficilement
analysables par les techniques classiques
d’électrophorèse bidimensionnelle (Adessi et al.,
1997 ; Chevallet et al., 1998 ; Wilkins et al.,
1998). En particulier les protéines hydrophobes,
qui ont fortement tendance à précipiter lors de
l’étape d’électrofocalisation, alors que les
protéines solubles sont facilement séparées par ces
techniques protéomiques classiques. Ainsi, les
techniques disponibles ne conduisant en effet qu’à
identifier des protéines membranaires périphéri-
ques (Santoni et al., 1998 ; Peltier et al., 2000 ;
voir aussi pour une discussion Santoni et al.,
2000a ; Rossignol, 2001). En conséquence, les
protéines régulatrices de la cellule, qui sont
présentes en faible quantité et sont souvent de
solubilité limitée dans l’eau (protéines
membranaires, protéines nucléaires), échappent
très largement à l’analyse protéomique. Ces
protéines constituent un véritable défi.
Le dernier grand problème est lié à la dynamique
de l’expression des protéines dans la cellule
(Wilkins et al., 1998). En effet, les protéines les
plus rares sont présentes à des taux de l’ordre de
50 à 100 molécules par cellule, alors que les
protéines les plus abondantes sont présentes à des
taux de l’ordre de 107 molécules par cellule. Cette
gamme d’expression très étendue (5 ordres de
grandeur) fait qu’il est à peu près illusoire de
vouloir visualiser et caractériser les protéines
minoritaires dans un extrait cellulaire total. Seules
les protéines les plus abondantes (plus de 10 000
copies par cellule) peuvent être analysées par les
techniques classiques.
Intérêt de l'analyse protéomique de comparti-
ments cellulaires. Les diverses limitations que
nous venons de décrire font que la réalisation de
sous-protéomes, utilisant la compartimentation
intracellulaire ou des critères physico-chimiques
apparaît comme une voie prometteuse pour
accéder aux protéines minoritaires dont l'identi-
fication est rendue possible par l’enrichissement
résultant du fractionnement subcellulaire. Or la
cellule végétale se prête assez bien à de tels
Ecole thématique Biologie végétale - 2001
 5
fractionnements. Il est possible d'obtenir des
chloroplastes (Douce & Joyard, 1982 ; Mourioux
& Douce, 1980) ou des mitochondries (Douce et
al., 1987) extrêmement propres. Dans le cas de la
membrane plasmique ou du tonoplaste, il est plus
délicat d'obtenir des fractions très propres et seules
certaines méthodes permettent de parvenir à un
niveau de pureté satisfaisant : utilisation de la
technique de partition de phase pour la membrane
plasmique, préparation de protoplastes pour le
tonoplaste (voir par exemple Lurin et al., 2000).
Enfin, il est possible de préparer des complexes
divers (ribosomes, protéasomes…) qui sont
désormais accessibles à l'analyse protéomique.
De plus, ces études protéomiques ciblées
s’inscrivent totalement dans le concept de la
génomique fonctionnelle. Elles sont en effet
susceptibles d’apporter des informations sur la
fonction des protéines caractérisées : par exemple,
une protéine très hydrophobe localisée dans la
membrane plasmique a toutes les chances d’être un
transporteur transmembranaire. De plus, ces études
spécifiques de compartiments intracellulaires
apportent des informations importantes concernant
la localisation subcellulaire des produits de ces
gènes ou des transcrits dont sont issus les ESTs
lorsqu’ils existent.
Un exemple d'analyse protéomique de
compartiments cellulaires : cas des membranes
de la cellule végétale. Environ 18 % des 25 498
protéines prédites dans le génome d'Arabidopsis
contiennent au moins deux hélices transmem-
branaires potentielles, 5 à 10 % représentent des
protéines de transport. L'analyse protéomique des
protéines membranaires représente donc un bon
exemple pour évaluer l'intérêt d'analyser le
protéome de compartiments subcellulaires.
Pour relever le défi posé par l'analyse de ces
protéines par les gels 2D, plusieurs stratégies sont
actuellement mises en œuvre. Il est intéressant de
souligner que ces tentatives impliquent fortement
des laboratoires français travaillant sur des
membranes végétales. Certains groupes se sont
ainsi focalisés sur les problèmes de solubilité des
protéines en cherchant à préparer des détergents
susceptibles d'éviter la précipitation de ces
protéines dans la première dimension de
l'électrophorèse (Chevallet et al., 1998 ; Santoni et
al., 1999, 2000a,b).
Pour notre part, nous avons mis en œuvre une
stratégie pragmatique, à savoir sélectionner les
protéines membranaires qui ne sont solubles que
dans les solvants organiques. Nous avons cherché
à définir un protocole d'extraction permettant
l'analyse systématique des protéines hydrophobes,
même mineures, de l'enveloppe des chloroplastes.
Cette méthode devait aussi être compatible avec
les techniques de microséquençage et afin de
conduire à l'identification de nouvelles protéines.
Ce travail, mené initialement sur l’enveloppe du
chloroplaste dans le but de caractériser de
nouveaux systèmes de transport (Seigneurin-Berny
et al., 1999), a été étendu à d'autres systèmes
membranaires comme les thylacoïdes (Ferro et al.,
2000). Dans le cadre de Génoplante, nous réalisons
une analyse de diverses membranes de la cellule
végétale, les travaux sur l'enveloppe des
chloroplastes et la membrane plasmique (réalisé
par le groupe d'Hélène Barbier-Brygoo, ISV, Gif
sur Yvette) étant actuellement les plus avancés. La
qualité d'une telle analyse nécessite la mise en
œuvre de plusieurs étapes.
Tout d'abord, une analyse réalisée sur un
compartiment intracellulaire n’a d’intérêt que si
tous les critères objectifs de pureté de ce
compartiment sont réunis. Identifier une protéine
de la membrane plasmique dans une fraction
mitochondriale peut conduire à des interprétations
fonctionnelles complètement fausses. Aussi, dans
le cas de l'enveloppe des chloroplastes, des
analyses systématiques de sa composition ont
montré que si elle était exempte de contaminations
membranaires (thylacoïdes, membranes
extraplastidiales), elle renfermait quelques
protéines solubles du stroma (voir Douce &
Joyard, 1982). D'excellents marqueurs de pureté de
l'enveloppe sont l'absence de chlorophylle
(pigment marqueur des thylacoïdes) ou de
phosphatidyléthanolamine (lipide marqueur des
systèmes membranaires extra-plastidiaux). Par la
suite, nous avons montré que cette stratégie était la
bonne, puisque nous avons pu vérifier (par
immunocytochimie et analyse par microscopie
confocale de la localisation de fusions
protéine::GFP) que toutes les protéines ainsi
caractérisées correspondaient bien à des protéines
de l'enveloppe des chloroplastes.
Dans une seconde étape, nous avons mis au point
les conditions d’extraction des protéines les plus
hydrophobes de l’enveloppe dans des mélanges
chloroforme/méthanol (Figure 5). Les solvants
organiques permettent en effet de fractionner les
protéines de l'enveloppe en deux catégories : les
protéines solubles dans les solvants organiques, et
donc hydrophobes, et les protéines insolubles dans
ces mêmes solvants (Seigneurin-Berny et al.,
1999). Les protéines les plus hydrophobes
représentent moins de 10 % des protéines de
l’enveloppe du chloroplaste, nous les avons
Ecole thématique Biologie végétale - 2001
 6
analysées par électrophorèse sur gel de
polyacrylamide en présence de SDS (gel 1D, voir
figure 5). Des microséquences (séquences N-
terminales, séquences internes) ont alors été
obtenues pour de nombreuses protéines. Nous
avons analysé les banques de données pour tenter
d'identifier ces protéines. La plupart des
polypeptides de l'enveloppe solubles dans des
mélanges chloroforme/méthanol présentent une à
12-13 hélices transmembranaires potentielles. La
capacité qu'ont ces protéines à être solubilisées
dans de tels mélanges est directement corrélée au
rapport entre le nombre de résidus d'acides aminés
et le nombre d'hélices transmembranaires
potentielles (rapport Res/TM), qui doit être
inférieur à 100 (Ferro et al., 2000). Ainsi, la
kDa
I S A B
112
84
53
IE45
34.9
IE37
28.7 IE30
20.5 IE18
IE16
Ainsi, plus d’une quarantaine de protéines
transmembranaires ont été caractérisées dans
l'enveloppe des chloroplastes, dont une vingtaine
qui n’avaient encore jamais été identifiées
(Seigneurin-Berny et al., 1999 ; Ferro et al., 2000).
La protéomique apparaît ici encore comme un outil
capable de détecter de nouveaux gènes. A partir
d'une analyse protéomique réalisée sur des
protéines d'épinard, nous avons pu identifier les
gènes correspondants chez Arabidopsis grâce aux
données du séquençage systématique
d'Arabidopsis. Si plusieurs protéines caractérisées
ne correspondent pas à des protéines connues, il
s’avère que les séquences de certaines des
protéines caractérisées présentent de très fortes
homologies avec celles de transporteurs bactériens
ou de levure dont les fonctions sont connues. De
fortes présomptions existent donc quant à la
fonction de ces protéines dans l’enveloppe du
chloroplaste. La protéomique ciblée que nous
avons mis en place pour étudier les protéines
protéine majeure présente dans la fraction
analysée, de 30 kDa, correspond au transporteur de
phosphate/trioses-phosphate de l'enveloppe du
chloroplaste. L'autre protéine, de 45 kDa,
correspond à un transporteur de malate/oxogluta-
rate (voir figure 5). Le transporteur de phosphate/
triose-phosphate contient 6-7 hélices transmem-
branaires et présente un rapport Res/TM de 49.
Pour sa part, le transporteur de malate/oxoglutarate
présente 12-13 hélices transmembranaires et un
rapport Res/TM de 38). D'autre part, le point
isoélectrique basique (supérieur à 9,0) de la plupart
des protéines identifiées confirme l'importance
d'utiliser une séparation en SDS-PAGE à une
dimension, l'analyse par électrophorèse 2D étant
plus aléatoire dans les zones de pH alcalin.
Figure 5. Exemple d'un trans-
porteur (le transporteur de malate/
oxoglutarate), extrait de l'enveloppe
des chloroplastes à l'aide de
chloroforme/méthanol et identifié
par MS/MS. A (à gauche). Analyses
SDS-PAGE des protéines de
l'enveloppe séparées sur la base de
leur solubilité (S) ou insolubilité (I)
dans le chloroforme/ méthanol. B (à
droite). Profil d'hydropathie de la
protéine IE45 (le transporteur de
malate/oxoglutarate). Ce transporteur
est une protéine de 45 kDa, situé dans
la membrane interne de l'enveloppe.
Son point isoélectrique est de 9,7. Il
présente 12 à 13 hélices α transmem-
branaires potentielles.
membranaires de l’enveloppe du chloroplaste
montre clairement le potentiel de la protéomique
dans le domaine de la génomique fonctionnelle.
Protéomique quantitative. L’étude comparative de
protéomes est un moyen puissant d’analyser, au
niveau moléculaire, la réponse dynamique à un
stress, à la fixation d’un ligand sur son récepteur, à
l’expression d’un transgène. Il s’agit alors de
comparer les quantités respectives des protéines
présentes dans tel ou tel compartiment de cellules
normales et stressées. Actuellement, une telle
approche n'est possible (avec de nombreuses
limites) qu'à travers la séparation des protéines par
gel 2D. Une approche extrêmement prometteuse
consiste à marquer les cystéines présentes sur les
protéines avec un agent alkylant (ICAT), cet agent
pouvant éventuellement être alourdi (de 8 unités de
masse) par la présence d’atomes de deutérium
(Gygi et al., 1999). Il suffit d’utiliser le ICAT
((d0)ICAT) et le ICAT alourdi ((d8)ICAT) pour
Ecole thématique Biologie végétale - 2001
 7
marquer respectivement les protéines des cellules
de référence et des cellules stressées. Il reste alors
à mélanger les deux échantillons protéiques, à
digérer les protéines par la trypsine, et à comparer
en couplage LC-MS/MS, pour chaque peptide, le
rapport peptide(d0)ICAT/peptide-(d8)ICAT. Le
développement de telles approches est
indispensable dans le cadre d'approches de
protéomique fonctionnelle. C'est en particulier le
cas pour les protéines membranaires car aucune
approche quantitative n'est actuellement
disponible.
Nouvelles approches méthodologiques et
technologiques en protéomique
En terme de développements technologiques, de
nouvelles méthodologies pour l’analyse
protéomique haut débit et haute sensibilité sont
actuellement mises en œuvre dans divers
laboratoires. L'objectif est de générer des quantités
extrêmement importantes de données de séquence
et de masse de peptides à partir d’échantillons
biologiques ciblés ; ce qui implique le
développement de nouveaux outils bioinforma-
tiques dédiés à la protéomique. Ces outils
permettront de confronter directement les données
de séquence protéique et de masse avec les
informations de séquence d’ADN contenues dans
les banques génomiques ce qui nous permettra, à
terme, de participer à la mise en place d’une
véritable synergie entre les informations apportées
par le séquençage systématique des génomes et la
connaissance des protéines.
Protéomique haut débit et haute sensibilité. Des
robots, capables de réaliser toutes les étapes de
préparation des échantillons en vue de l’analyse
par spectrométrie de masse, sont commercialisés
depuis peu. Cette technologie doit permettre
l’analyse d'une centaine de protéines par jour en
utilisant un spectromètre de masse MALDI-TOF
compatible avec ce type d’instrumentation.
Cependant, c'est probablement avec la mise en
place de la nano-chromatographie liquide (nano-
LC) couplée à un spectromètre de masse de type
Q-TOF (MS/MS) que l'on peut espérer répondre
aux nécessités de l'analyse protéomique à haut
débit et haute sensibilité. Ce type de dispositif
répond à une triple exigence : gain de sensibilité,
gain d’informations et gain de temps.
- Le couplage nano-LC/MS permet des analyses
plus sensibles. Le mélange de peptides résultant de
la digestion trypsique d’une protéine est injecté sur
une micro-colonne capillaire de phase inverse
perfusée à très faible débit (100-200 nl/min).
Schématiquement, un peptide donné sera retenu
sur la colonne avant d’être élué (par l’éluant
organique) dans un très faible volume. En
permettant une concentration du peptide, cette
configuration aboutit à un gain en sensibilité
important (facteur 5 à 10) qui permet de repousser
encore les limites des études protéomiques.
- Le couplage nano-LC/MS/MS permet de
séquencer un plus grand nombre de peptides.
Lorsque l’analyse par MS/MS est directement
réalisée sur le mélange non fractionné des peptides
issus de la digestion d’une protéine par la trypsine,
il arrive qu’une partie seulement des peptides
puissent être fragmentés avant la nébulisation de la
totalité de l’échantillon. Par contre, dans une
configuration où le Q-TOF est couplé à la nano-
LC, chaque peptide peut être systématiquement
analysé par MS/MS du fait qu’il est élué à un
temps de rétention qui lui est propre. Un grand
nombre de peptides peut donc être analysé, ce qui
permet d’obtenir un gain d’informations de
séquence sur la protéine étudiée. Il devient même
possible d’analyser les peptides résultant de la
digestion trypsique d’un mélange de protéines,
sans séparation électrophorétique préalable de
celles-ci. La puissance d’un tel outil vient d'être
montrée puisque près de 1500 protéines ont pu être
identifiées chez Saccharomyces cerevisiae sans
aucune étape d’électrophorèse (Washburn et al.,
2001) !
- Le couplage nano-LC/MS/MS permet d’au-
gmenter le débit des analyses. La mise en place du
couplage nanoLC-MS/MS permet d’augmenter
considérablement le débit des analyses du fait de
l’automatisation qui lui est associée ; l’analyse
peut en principe se dérouler 24h/24h.
Nouveaux outils bioinformatiques pour la
protéomique. La plupart des constructeurs de
spectromètres de masse fournissent des logiciels
permettant de localiser les étiquettes peptidiques
ou PSTs (peptide sequence tags) sur des banques
protéiques ou sur des banques d'ESTs. Ceci
constitue un problème relativement simple dans la
mesure où le logiciel doit repérer dans ces banques
une séquence compatible avec les informations de
séquence et de masse contenues dans chaque PST.
Par contre, il est bien plus complexe de chercher à
localiser directement les PSTs sur des données de
séquences génomiques, notamment dans le cas des
génomes eucaryotes du fait de l’existence des
introns et, plus généralement, de grandes régions
de séquences non codantes. De tels outils sont en
cours de développement à Grenoble (collaboration
avec l'INRIA et Génome Express).
Ecole thématique Biologie végétale - 2001
 8
Conclusion
La limite importante des analyses protéomiques
réside dans l’incapacité à résoudre la totalité des
protéines présentes dans cette cellule avec un
simple gel 2D. Une autre difficulté découle de
l’extrême diversité des protéines en termes de
dynamique d'expression et de nature chimique.
L’étude protéomique d'un compartiment
intracellulaire donné ou d'un ensemble de
protéines présentant une propriété ou une
localisation particulière permet de contourner ces
difficultés de manière satisfaisante. Un autre
moyen de cibler une étude protéomique sur un
sous-ensemble de protéines cellulaires consiste à
sélectionner ces protéines sur la base de propriétés
physico-chimiques particulières. L’identification
de protéomes membranaires est un bon exemple de
l'intérêt de ce type de stratégie. Les techniques
disponibles ne conduisant en effet qu’à identifier
des protéines périphériques de la membrane. C'est
dans cet esprit que plusieurs études ont été menées,
en particulier sur l'enveloppe des chloroplastes
(Seigneurin-Berny et al., 1999 ; Ferro et al., 2000).
L'intérêt de ce type d'approche réside dans
l'identification de nouvelles séquences protéiques,
identification rendue possible par l’enrichissement
en protéines mineures résultant du fractionnement
subcellulaire. De plus, ces études de sous-
protéomes s’inscrivent totalement dans le concept
de la génomique fonctionnelle (voir article de M.
Rossignol dans ce volume).
Les méthodologies disponibles actuellement en
protéomique sont incapables de prétendre au haut
débit qui est rendu nécessaire par développement
de la génomique. Dans cette perspective, le
développement de la spectrométrie de masse
comme outil d'analyse des protéines a été une
véritable révolution, cette révolution continue avec
le couplage de la MS/MS aux techniques de
chromatographie liquide et devrait se poursuivre
afin de répondre aux exigences de débit et de
sensibilité. Tous ces développements technologi-
ques impliquent en parallèle le développement
d'une bioinformatique spécifiquement adaptée aux
problématiques de la protéomique. La recherche en
protéomique est donc totalement pluridisciplinaire,
rassemblant sur un même projet scientifique des
équipes de biologistes, de chimistes des protéines
et de bioinformaticiens. Cette pluridisciplinarité est
actuellement en train de s'étendre à des domaines
encore plus complexes et devrait conduire à des
développements technologiques encore plus
pointus. Il existe ainsi des projets visant à la
réalisation de laboratoires protéomiques sur puce.
Ainsi, la miniaturisation, l’intégration, et la
parallélisation des étapes qui se trouvent en amont
de l’analyse par spectrométrie de masse devraient
rendre l’approche protéomique encore plus
sensible et rapide. Cependant, malgré l'importance
et la rapidité de ces développements
technologiques, la complexité même des questions
à résoudre est singulièrement vaste.
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