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Spectromtrie de masse : en avoir ou pas ?

La spectromtrie de masse
La spectromtrie de masse est une mthode danalyse qui permet la dtermination de la masse molculaire des composs analyss, ainsi que leur identification et leur quantification.
Le spectromtre de masse est un instrument qui comprend plusieurs parties, disposes en srie, permettant successivement : lintroduction de lchantillon ; lvaporation et lionisation des molcules dans un lment appel source (transformation des molcules ltat naturel en ions ltat gazeux) ; lacclration des ions forms ; la sparation de ces ions dans un lment appel analyseur de masse, en fonction de leur rapport m/z (masse sur charge) ; la dtection, cest--dire lobtention du spectre de masse.

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Les analyseurs de masse

a) Les analyseurs temps de vol (TOF = time of flight) Lapplication dun champ lectrique fait que la distance parcourue par un ion jusquau dtecteur (temps de vol) dpend du rapport m/z (les ions lgers frappent le dtecteur avant les ions lourds). b) Les analyseurs utilisant un champ lectrique oscillant : les analyseurs filtre quadripolaire : systmes assurant la slection des ions ayant un rapport m/z dtermin, qui peuvent parvenir au dtecteur sans tre dchargs au contact des barres du quadriple. les analyseurs piges ions ou trappe ions. Dans ces systmes, les champs lectriques assurent le confinement dans lanalyseur, des ions de diffrents rapports m/z ; le spectre est obtenu en expulsant ces ions en fonction du rapport m/z.

Les sources utilises en fonction des composs analyss

Sous faible pression

Spectromtrie de masse en tandem

La spectromtrie de masse en tandem (MS/MS) combine en gnral deux analyseurs. Les ions forms dans la source entrent dans le premier analyseur MS1, do seuls les ions ayant un rapport m/z dtermin pourront sortir. Dans une cellule de collision, ces ions slectionns sont dissocis en ions fragments qui seront analyss dans le second analyseur MS2. Les quipements les plus souvent rencontrs dans les laboratoires sont des triples quadriples. La MS/MS offre trois avantages majeurs : capacit tudier de nombreuses molcules appartenant ou non la mme famille structurale ; capacit mettre en vidence des mtabolites spcifiques dune maladie ; automatisation offrant la possibilit de grandes sries danalyses.

1. Ionisation et fragmentation sous impact lectronique :

mthode adapte aux composs de masse molculaire infrieure 1.000 daltons, facilement volatilisables et stables temprature leve. 2. Ionisation chimique positive : mthode plus douce que la prcdente, convenant aux analytes du mme type. 3. Ionisation-dsorption par impulsion laser assiste par une matrice (MALDI = matrix assisted laser desorption ionisation) : mthode dite douce, utilisant une plaque mtallique recevant un mlange co-cristallis (molcule matrice + analyte), peu utilise pour lanalyse des molcules organiques de masse infrieure 500 daltons. NB : une technique proche dans son principe (SELDI-TOF : surface enhanced laser dsorption-ionisation en dtection par le temps de vol) est associe un systme de sparation des protines et peptides par chromatographie sur une surface plane (cette technique aurait une faible reproductibilit). A pression atmosphrique

Les couplages aux techniques sparatives

1. Couplage la chromatographie gazeuse
Il y a sparation de molcules vaporises par effet thermique et entranes par un gaz neutre pour tre diriges sur un MS ou un MS/MS. La prparation des chantillons est une opration lourde.

1. Ionisation par lectronbulisation (ESI = electrospray

nebulization) : mthode convenant pour un analyte introduit aprs chromatographie en phase liquide ou aprs lectrophorse capillaire, compatible pour de faibles dbits. Applications : liquides facilement ionisables. 2. Ionisation chimique pression atmosphrique (APCI) : mthode utilisable en aval dune chromatographie en phase liquide (complmentaire de la mthode ESI).

Spectromtrie de masse
2. Couplage la chromatographie liquide (ou llectrophorse capillaire)
En sortie de colonne analytique, lionisation est assure par des systmes ESI ou APCI. Ces techniques prsentent un norme potentiel ; les ions ne sont pas des fragments molculaires ; lefficacit dionisation est molcule-dpendante ; il y a un risque de transfert de charge entre composs.

Focus 30
ment utilis dans le traitement de la leucmie mylode aige : erufosine (acylphosphocholine), antihistaminiques, antirtroviraux.

4. Toxicologie (toxiques, dopage, stupfiants)

Toxiques : mtaux (jusqu 34 lments), cyanures. Dopage : dtection et identification de strodes anabolisants (nandrolone et mtabolites : norandrostrone et northiocholanolone). Stupfiants et soumission chimique : opiacs, cocaniques, buprnorphine et norbuprnorphine, cannabis, LSD, drivs de lecstasy, GHB, ktamine. Remarque : la spectromtrie de masse est aussi applicable en biologie vtrinaire ; elle est trs prsente dans le domaine de lagroalimentaire et de la protection de lenvironnement.

3. Electrophorse bidimensionnelle sur gel

Llectrophorse bidimensionnelle sur gel est le principal outil permettant de sparer des milliers de protines (cest lanalyse protomique). Les protines contenues dans lchantillon biologique sont spares dabord par isolectrofocalisation en fonction de leur point isolectrique, puis par lectrophorse dnaturante en gel de polyacrylamide (PAGE-SDS) en fonction de leur masse. Les spots dintrt sont dcoups des gels, puis traits par une protase. La masse des peptides est obtenue par MS de type ESI ou MALDI-TOF. Mais, cette technique ne convient pas aux protines faiblement exprimes, aux protines trs hydrophobes, ni aux protines membranaires.

Conclusion
Les avantages de la spectromtrie de masse sont : laccs (dans une situation de concurrence) des analyses importantes : les mdicaments (dont les immunosuppresseurs et les antirtroviraux), les drogues, les strodes et la vitamine D, les maladies hrditaires du mtabolisme, etc. ; cette technologie devrait galement tre indispensable certaines tudes cliniques ; en dehors de la biologie clinique humaine, elle pourrait se rvler un atout dans le domaine de la biologie vtrinaire, de lagroalimentaire et de lenvironnement. Ses inconvnients sont : son cot, car elle ncessite un budget dquipement important. Il nexiste pas de systmes polyvalents, comme nous lavons vu : en amont de laffichage du rsultat, la chane analytique peut varier en fonction de la molcule tudie (GC-ou LC-MS, type dionisation, travail en faible pression ou pression atmosphrique, analyse de masse en temps de vol ou en champ lectrique oscillant, SM ou SM en tandem). son excution doit tre confie des techniciens hautement spcialiss.
Jacques Ingrand, comit scientifique Biomnis

Applications en biologie mdicale

Remarque : lanalyse protomique repose galement sur lemploi de la spectromtrie de masse ; elle ne sera pas traite ici car ses buts sont moins directement associs des besoins cliniques de routine ; en effet, il sagit plus de collecter des donnes utiles en biologie fondamentale, didentifier des marqueurs spcifiques et sensibles de maladies ou de cibles dintervention thrapeutique.

1. Applications en bactriologie-mycologie
Lidentification rapide des microorganismes par MS-Maldi-Tof repose sur lanalyse des protines ribosomales et des protines associes aux membranes, aprs transfert dune colonie ou extraction des protines. Elle passe par une comparaison des spectres obtenus avec des spectres de rfrence valids. Au niveau des performances, les publications font tat dau moins 90 % de concordance avec les mthodes didentification conventionnelles.

2. Applications en biochimie
Il sagit pour la plupart de mthodes de rfrence. Vitamine D : mise en vidence possible de la forme D2 (mdicament) et de la forme D3 (synthse endogne et aliments). Strodes : formes non conjugues par GC-MS/MS ; formes conjugues par LC-MS/MS. NB : accs la forme biodisponible de la testostrone. Dsordres mtaboliques : la spectromtrie de masse fait partie des mthodes essentielles pour le diagnostic et le suivi des maladies hrditaires du mtabolisme : aminoacidopathies, dficits du cycle de lure, aciduries organiques, dficits de la -oxydation des acides gras (dont le profil des acylcarnitines). Acides biliaires, acides gras libres, strols.

Bibliographie
Baudin B. et al. Protomique, spectromtrie de masse et analyses multiples. Cahier de formation BIOFORMA n46,2010. Courcol R. Quelles utilisations de la spectromtrie de masse de type Maldi-Tof en microbiologie mdicale ? Rev Fr Lab 2009 ;416 :61-65. Vogeser M., Parkhofer KG. et al. Liquid chromatography tandem-mass spectrometry (LC-MS/MS)-techniques and applications in endocrinology. Exp Clin Endocrinol Diabetes 2007;115:559-70. Vogeser M. et al. Progress in automation of LC-MS in laboratory medicine. Clin.Biochem 2011;1,4-13. Cheillan D. et al. La spectromtrie de masse en tandem applique au dpistage nonatal des maladies hrditaires du mtabolisme ; le point sur les mthodes actuelles. Ann Biol Clin 2004,62 ;269-77. Lacroix C. Prparation en ligne couple la LC-MS/MS ; applications aux dosages des mdicaments et stupfiants. Colloque CORATA, Namur, 8-10 juin 2011.

3. Suivi thrapeutique-pharmacologie
Exemples : immunosuppresseurs (ciclosporine, tacrolimus, sirolimus, everolimus, acide mycophnolique), neuroleptiques (clozapine, haloperidol, penfluridol, thioridazine, flupenthixol, zuclopenthixol), hypnotiques dont les benzodiazpines (lorazepam, bromazepam, flunitrazepam, clonazepam, alprazolam, zopiclone, zolpidem), antimycosiques (posaconazole), mdica-