I Introduction

Les méthodes d’analyse instrumentale, permettant un accès rapide à une information

structurale et quantitative à travers l’hyphenation (hypernation) des méthodes
séparatives et spectroscopiques, constitue un pas de Goliath vers l’analyse holistique
Et l’acquisition des bases de données sur les produits naturels.
I.1 Nécessité des Méthodes hyphenées d’analyse des produits naturels

Bien avant l’introduction du paradigme ‘hyphenation’ par Hirschfield (1980), un

nombre impressionnant des techniques séparatives T_Sep et de spectroscopie

structurale T_Sy ont été mises en routine.

Cependant l’analyse des matrices complexes s’avère un défi insurmontable par ces

méthodes classiques.

I.1.1 Nature des produits naturels (matrices complexes) NP

 I.1.1 Nature des produits naturels (matrices complexes) NP (suite 1)
Généralement la matrice NP est extrêmement complexe avec une multiplicité des

classes chimiques et un nombre élevé des composés.

C’est pourquoi l’approche classique consistant à isoler tous les composés et ensuite à

les analyser, semble incapable de relever ce défi :

- Durée longue (6 mois-plusieurs années)

- Couts élevés

- En plus de la très fréquente probabilité d’isoler un composé déjà étudié

I.1.2 Avantages des MTC

A l’opposé des méthodes classiques, les méthodes modernes d’analyse qui couplent

T_Sep (généralement chromatographique) avec une/ plusieurs techniques T_Sy

rapides (MTC) permettent une deréplication ou identification rapide (en ligne)

 I.1.2 Avantages des MTC (suite 1)
Les techniques hyphenées ou couplées font combiner une technique de séparation
avec une technique analytique rapide à l’aide d’une interface
Le paradigme de ‘’Hyphenation’’ a été introduit par Hiershfield (1980) pour signifier la
combinaison en ligne d’une technique de séparation avec une ou plusieurs techniques
spectroscopiques d’analyse
Récemment la méthode a été étendue au couplage de plusieurs techniques de
séparation ou de détection spectroscopique
Cette combinaison de séparation avec des techniques spectroscopiques rapides est à
l’origine d’une puissant instrument analytique appelée Méthodes des Techniques
Couplées MTC
Ex LC-DAD-MS; LC-MS-MS; LC-UVDAD-NMR etc.
Elle a été appliquée à l’analyse des ressources complexes
o Ressources végétales (matrices)
o Ressources marines
o Ressources pharmaceutiques et industrielles
L’application des méthodes MTC permettent la deréplication et éventuellement
l’identification de nouveaux composés
 I.1.2 Avantages des MTC (suite 1)
- la deréplication : identification des composés déjà étudiées
- et de plus en plus, l’identification de nouveaux composés
- à l’opposé des méthodes classiques (plusieurs mois-plusieurs années), la résolution
des matrices complexes en plusieurs heures voir plusieurs minutes [5A-9A].
I.2 Interfacing T_Sep/T_Sy
Le couplage entre les appareils T_Sep et T_Sy est le défi majeur des plateformes MTC :
- généralement le débit de T_Sep ne correspond pas au flux analysable par T_Sy (Ex LC
1000 µL/min et MS  5 µL); T Technique ou appareil
- incompatibilité de détection T_Sy/débit_T_Sep
- il faut éliminer ou changer de solvant
- Souvent il faut enrichir ou changer de phase
Alors pour réadapter T_Sep/T_Sy (rendre compatible les deux processus de Séparation et de
détection Spectroscopique), il faut nécessairement interposer un appareil capable de
réadapter l’analyte sortant de la séparation à la technique spectroscopique T_Sy.
 I.2 Interfacing T_Sep/T_Sy (suite 2)
Comparaison des conditions/paramètres de LC (T_Sep) et MS (T_Sy)
 I.2 Interfacing T_Sep/T_Sy (suite 3)
Le couplage LC avec T_Sy ressemble au marriage du Poisson avec l’Aigle
 I.2 Interfacing T_Sep/T_Sy (suite 3)
Alors pour coupler ces deux techniques il faut introduire un appareil capable de réadapter la
matrice aux conditions des Techniques Spectroscopiques (spectromètre de Masse, NMR, etc.)

LC Interface analyseur de masse

enregistrement

I.2.1 développement des interfaces LC_MS

Les 2 premiers interfaces introduites les années 60-80x était le Rubant Passant MBI (Moving
Belt) et le Pulvériseur Thermique (ThermoSpray).
Interface Moving Belt Interface
L’interface MBI consiste à déposer l’effluent sortant de LC sur un ruban (Moving Belt) avec
évaporation du solvant et passage du ruban à travers une porte de vide et ensuite dans la
chambre d’ionisation l’analyte est flash-evaporé pour être prêt l’ionisation, à ce stade les
fragments ionisés rentrent dans l’analyseur MS.
 I.2 Interfacing T_Sep/T_Sy (suite 3)
Interface Moving Belt Interface
 I.2 Interfacing T_Sep/T_Sy (suite 3)
Interface Moving Belt Interface
 I.2 Interfacing T_Sep/T_Sy (suite 3)
Interface ThermoSpray TSP

Cette interface consiste à envoyer l’effluent LC à travers un capillaire chauffé puis introduit
dans la chambre d’ionisation. L’excès du solvant est évaporé sous l’effet du chauffage et la
pompe à vide.
 I.2 Interfacing T_Sep/T_Sy (suite 3)
D’autres interfaces plus récentes (plus modernes) sont actuellement
en usage, comme par exemple, ESIms ; APCI ; APP ; FAB etc. ;

elles selon abordées ulterieurement pour chaque spécifique couplage

LC_MS, LC_UVDAD ; LC_NMR etc.
 II analyse classique des produits naturels
Les techniques d’analyse en NP se divisent en 4 étapes: collection, extraction
et/ou préparation, séparation puis détermination qualitative et/ou quantitative.
II.1 collection/ échantillonnage NP
La collection a pour but essentiel d`amener au laboratoire une quantité
représentative suffisante sans contamination par d`autres phytocomposés
II.2 Extraction/préparation préliminaire
Après collection; comminution; homogénéisation le conditionnement sous
forme adéquate pour l`analyse /traitement ultérieur (isolation, analyse
phytochimique et bioessais)
L’objectif : extraction du maximum des phytocomposés d`intérêt, tout en évitant
de les perdre ou de les altérer (en particulier volatiles et/ou thermolabiles)
II.2.1 Techniques classiques d’extraction
Classiquement , la partie intéressante du NP est soit:
- solubilisée sélectivement à l’aide d’un solvant approprié (apolaire ou polaire)
- entrainée à l’aide des vapeurs d’eau (huiles essentielles)
Figure I.1A : Schéma habituel de préparation pré-extraction du phytomatériel (d’après [10A-11A])
 II.2.1 Techniques classiques d’extraction (suite 1)
Tableau I.3A: Caractéristiques des systèmes d’extraction classique (d’après [11A, 31A])
 II.2.2 Techniques modernes d’extraction du phytomatériel
L’extraction classique par solubilisation Soxhlet et par hydrodistillation, utilisées
historiquement pour l’épuisement des phytomatériels, se caractérisent par:
-une longue durée
-des conditions drastiques d’extraction.
Cependant , les techniques récentes permettent une alternative aux méthodes classiques
- MAE (extraction assistée par micro-onde)
- UAE (extraction assistée par ultrasons)
- PLE (liquide haute pression)
- SFE (fluide supercritique)
- SPE (adsorption sur fibre solide), en plus de
o procédés d’extraction "sans solvant" -solventless extraction- (ex extraction sur
membranes , cryopiégeage ‘cryogenic trapping’ [24A-25A])
 Techniques d’extraction (suite 1)
Actuellement les techniques d’extraction modernes les plus utilisées sont donc MAE, PLE,
SC_CO2
Extraction assistée par micro-ondes MAE
La desintegration puis l’extraction des NP est basée sur l’interaction des composés de la
matrice avec les micro-ondes
Le dipole du composé/solvant orienté au hasard, prend la direction du Rayonnement EM
qui change alternativement, car le le pole negatif s’aligne sur la crete positive du REM, ce
qui chauffe et desintegre uniquement les composés polaires de l’echantillon
 Techniques d’extraction (suite 1)
De ce fait l’extraction MAE est impossible pour les composés apolaires dans une
matrice Apolaire
Le choix de solvant ou mélange de solvants joue donc un rôle important dans le succès de
l’extraction;
Le système solvatant doit assurer:
-une grande capacité d’absorption des micro-ondes (ex. H2O) et en même temps
-un pouvoir solvatant supérieur ( et  suffisantes)

La matrice est exposé à des micro-ondes (ondes électromagnétiques EM environ

3.45 GHz,  qqs m)
 Extraction assistée par micro-ondes MAE

Principe instrumental de la technique MAE

 Extraction assistée par micro-ondes MAE (suite 2)
Contrairement à la solubilisation conventionnelle où le chauffage se fait par
conduction/convection thermique, le chauffage par micro-onde est apporté de manière
ciblée et sélective par conduction ionique/rotation dipolaire [25A]
 Techniques d’extraction MAE (suite 3)
La technique MAE se caractérise par:
- une durée réduite d’extraction
- une quantité minime de solvant
- un contrôle facile (durée, puissance, pression)
Cependant, elle est limitée par les difficultés d’extraction des phytocomposés non polaires
dans une matrice non polaire
Extraction assistée par ultrasons UAE
La technique d’extraction UAE, très semblable à MAE, utilise les ultrasons pour accélérer la
désintégration de la matrice par son exposition aux ondes ultrasons 0.016-1 GHz:
-La durée d’extraction varie de quelques minutes à 70 minutes
-le recouvrement est comparable à l’extraction Soxhlet durant une 12H
-l’extraction à la température ambiante (utile pour les composés thermolabiles)
-extraction en batterie (plusieurs échantillons en même temps).
Cependant, les 2 méthodes MAE et UAE partagent un inconvénient de taille : la nécessité
de séparer l’extrait de la matrice initiale à la fin du processus [11A, 46A].
 Extraction sur phase solide SPE

L’extraction sur phase solide SPE consiste à adsorber sélectivement les composés sur la

surface d’un sorbant solide, par exemple octadecyl ou aminopropyl fixé sur gel de Silice

La SPE est basée sur l’affinité des analytes pour la phase mobile (solvant liquide) et

stationnaire (sorbant solide), à travers laquelle la solution passe

Le passage ou élution de la solution à travers la phase stationnaire sépare le phytomatériel

en produits désirés et impuretés

 Extraction sur phase solide SPE
La SPE est très utilisée pour concentrer/purifier l’analyte et parfois pour l’isoler les analytes

aussi bien volatiles que non volatiles.

Le choix parmi une large gamme des phases sorbantes permet une grande sélectivité pour

isoler l’analyte ou pour éliminer les interférences

A cause de sa simplicité , elle trouve de plus en plus d’application en analyse phytochimiq.

Elle peut etre être couplées avec LC ou CE en utilisant des solvants polaires d’élution

comme le méthanol, l’acétonurie, l’eau, l’acétone

Ses avantages principaux sont:

-une consommation réduite des solvants

-une courte durée du processus (5-15min)

Cependant, 3 inconvénients proéminents handicapent sa généralisation:

- résolution incomplète des pics chromatographiques

- insolubilité des produits en phase mobile exigeant le changement du solvant

- coût de l’équipement est relativement élevé

 Extraction par liquide à haute pression PLE
La technique d’extraction par liquide à haute pression PLE ou sa variante SWE (extraction
par eau surchauffée) consiste à solubiliser le phytomatériel par les mêmes solvants utilisés
en extraction classique mais à des températures dépassant l’ébullition (50-200°C) sous
pression élevée du liquide (100-140Atm)
 Extraction par fluide supercritique SFE/SFC
La technique d’extraction par SFE est basée sur le comportement des substances pures au
delà du point critique (t tC et P PC ) où le fluide devient supercritique

Le fluide SC présente les propriétés à la fois du liquide et du gaz; en faite:

-il pénètre dans la matrice comme un gaz
-en même temps il a le pouvoir solvatant du liquide
 Extraction par fluide supercritique SFE/SFC

Le Fluide SuperCritique (CO2) après ajout du modulateur de polarité est pompé pour

passer à traver le cilyndre containant la matrice en entrainant les analytes selon leur

polarité, ils sont precipités dans des flacons successifs.

Les flacons contiennent les analytes separés selon leur polarité et peuvent etre envoyés

sur un separateur chromatographique couplé à une technique spectroscopique rapide

(UVDAD; MS; NMR etc.)

Comme le montre le schéma

d’instrumentation la polarité du fluide
est modulée par l’ajout des co-solvants
plus souvent le Methanol ou eau
 Extraction par fluide supercritique SFE/SFC
L’extraction SFE présente des avantages indéniables pour l’extraction douce du
Phytomateriel:
-une modulation continue de polarité par ajout de solvant polaire (ex méthanol) et donc
solubilisation sélective des phytocomposés
-une extraction sans élévation de température (élimination de dégradation)
-Facilité de couplage avec GC, LC et SFC
Plusieurs solvants critiques ont été étudiées pour l'extraction superfluide (Ex. CO2 ;
Hexane; N2O; SF6; Xe; CH3OH; CH3CH(OH)CH3 ;H2O etc..);

Cependant CO2 est actuellement utilisé

à plus de 98%, à cause notamment de:

-bas paramètres critiques (T et P)

-sécurité

-coût réduit
 Extraction par fluide supercritique SFE/SFC
Le processus d’extraction SFE-CO2 consiste à charger le phytomatériel profondément séché
dans le récipient-extracteur ; puis le gaz SC-CO2 (supercritique) coule à travers une vanne
de dépression vers un séparateur dans lequel l’extrait se libère de SC-CO2 et se précipite
dans les collecteurs
plusieurs séparateurs mis en série et régulés de façon décroissante à différentes
températures permet la séparation en fractions plus ou moins pures (de polarité voisine).
L’ajout d’un modificateur (p.ex Méthanol) permet une modulation de la solvatation et une
séparation programmée des différents phytocomposés selon leur polarité
Le méthanol est le modificateur le plus utilisé mais aussi des éthers cycliques, l'eau et
l'acide formique
Ainsi le Phytomateriel est fractionné en même temps que l’extraction
Cependant, l’affinité de CO2 pour les composés apolaires a pour conséquence la
co-extraction des impuretés apolaires (cires cuticulaires, acides gras et colorantes)
l’extraction efficace des huiles essentielles par SF-CO2 exige une déshydratation
Profonde par une technique douce (lyophilisation, zeodratation etc..), car la présence de
H2O empêche l’extraction par CO2 de certaines huiles essentielles
Le prix du gaz CO2 de qualité superfluide est élevé et assez élevé pour l’appareillage
d’extraction.
 Comparaison des techniques d’extraction modernes et conventionnelles

En comparaison avec les techniques classiques, elles se caractérisent par

-un temps d’extraction plus réduit
-une consommation réduite des solvants toxiques.
 II.3 Techniques séparatives de base (rappel

Plusieurs TSB, telles que les techniques chromatographiques (GC, LC, SFC, CCC, CE etc.), ont

été couplées avec des techniques spectroscopiques TS, comme UVDAD; IR; MS; NMR etc.,

et l’application de ces couplages en MTC à l’analyse des matrices complexes (produits

naturels et pharmaceutiques ) a donné des résultats spectaculaires.

II.5.1 Techniques de Séparation chromatographique

Bien que les Techniques de Séparation chromatographique TSC soient pléthoriques, Les 3
éléments essentiels de l’instrument TSC se ressemblent: une colonne contenant une phase
stationnaire sur laquelle est réalisée la séparation des espèces chimiques selon leurs
propriétés physico-chimiques, une phase mobile qui entraine les phytocomposés à travers
la phase stationnaire

Chaque espèce est entrainée à une vitesse qui dépend de ses caractéristiques et de celles
des deux phases en présence
 II.3 Techniques séparatives de base (rappel

Actuellement les techniques de chromatographie gazeuse GC, liquide

LC, superfluide SFC, à contrecourant CCC et l’électrophorèse capillaire
CE constituent les principaux procédés chromatographiques utilisés
pour la séparation des Produits Naturels NP [137A].
II.5.1.1 Chromatographie gazeuse
La chromatographie en phase gazeuse GC est une technique chromato.
permettant de séparer les composés vaporisables sans décomposition
Deux types de colonnes sont utilisées:
-colonne remplie (maximum 2 m de longueur)
-colonne capillaire (15-100 m de longueur)
 II.3 Techniques séparatives de base (rappel

Dans la ‘’Colonne Remplie’’ la phase stationnaire est constituée grains de silice sur
lesquels repose un film liquide image
 II.3 Techniques séparatives de base (rappel

Dans la colonne capillaire un film est déposé directement sur les parois de la
colonne
 II.3 Techniques séparatives de base (rappel

La phase mobile utilisée est généralement un gaz inerte (hélium, azote, argon) ou
l’hydrogène

La technique GC est appliquée à l’analyse des NP, principalement à travers son couplage
avec la Technique MS

L’entrave majeur à la réussite de la plateforme GC_MS est la ‘non résolution’ des pics
chromatographiques, plus particulièrement pour la caractérisation des composés volatiles.

II.5.1.2 Chromatographie liquide LC

LC est la technique la plus universelle et se décline en plusieurs versions: PC, CC (Contre-

courant), HPLC, SFC (SuperFluide Chromato.)

II.5.1.3 Chromatographie supercritique

Introduite en 1982, la SFC (Technique de Chromato. Supercritique) utilise un fluide

supercritique comme phase mobile et et d’extration, generalement CO2
 II.3 Techniques séparatives de base (rappel

La phase mobile utilisée est généralement un gaz inerte (hélium, azote, argon) ou
l’hydrogène

LA SFC peut etre couplée comme LC-T_Sy ou GC-T_Sy

Dans le montage SFC_LC deux pompes alternatives entraine une phase mobile mixte
(généralement CO2 + solvant polaire), à travers une colonne thermo-controlée avec
contrôle T, P et débit image
 II.3 Techniques séparatives de base (rappel

Dans le montage SFC_GC une pompe-seringue alimente une colonne capillaire à l’intérieur
d’un four GC et un détecteur Spy.

La SFC présente certains avantages par rapport à HPLC et GC :

-plus rapidité

-meilleur résolution

-analyse à T presque ambiante, preservant les composés thermolabiles

II.5.1.4 Chromatographie à Contre-Courant

La chromatographie à contre courant CCC est une chromatographie de partage liquide-

liquide où les phases mobiles et stationnaires sont des liquides non-miscibles image
 II.4 Techniques Spectroscopiques de base (rappel

Plusieurs Techniques spectroscopiques T_Sy ont été couplées avec T_Sep telles que LC; GC;
SFC; CCC; CE

Comme dejà signalé, les Techniques T_Sy les plus utilisées en couplage sont la
spectroscopie UVDAD; MS; IR; NMR

II.4.1 UVDAD

La spectroscopie UVDAD consiste à detecter et analyser le pic sensé correspondre à un

composé bien separé avec un detecteur UV à Barrette de Diode (Diode Array Detector)
capable de realiser un scan rapide du pic sur l’intervalle des longueurs d’onde
programmées (200-800 nm) et donc d’avoir le spectre UV sur cet intervalle
 II.4.2 Spectroscopie infrarouge
Plusieurs
 III.4 Techniques d’acquisition RMN
En analyse classique RMN:
- la fraction (pic) est collectée avec évaporation des solvants d’élution (si nécessaire), suivi de
dissolution dans un solvant deutéré (D2O, D3COD ..) et transfert dans un tube rotatif avec la sonde
RMN
- la solution reste dans le tube et donc dans la bobine d’excitation pendant un temps long sans
sortir du tube
En analyse couplée LC_RMN
- Un tube en U inversé fixe et à flux continu.
- la solution coule à l’intérieur d’un tube en forme de U inversé avec t réduit (qqs secondes)
 III.4 Techniques d’acquisition RMN (suite 1)

Les solvants courants (RP18) sont protonés, ainsi gênant l’interprétation du spectre RMN,

donc soit :

- élimination du solvant protoné et remplacement par un solvant deutheré (ex D2O)

- Suppression des signaux des protons issus du solvants à l’aide des séquences (NOESY-

présaturation, WET, Sofft Pulse ..)

o A cause de la basse sensibilité de la RMN, le volume de détection doit être

suffisamment grand pour une détection acceptable; cependant,

o Le volume optimal de la colonne est relativement faible

o Les valeurs supérieures de volume de détection Vd correspondent à une sensibilité

supérieure mais au détriment d’un élargissement des pics chromatographiques

 III.4 Techniques d’acquisition RMN (suite 1)

o L’optimisation passe par un compromis entre le volume exigé par la sonde RMN et une

résolution suffisante des pics chromatographiques

o Le volume de la sonde Vd peut varier 40-120µL

Vd/L Mode d’ sensibilité Qualité du pic Chr. remarque
acquisition

120 1D 100 ng Elargissement 20 Le volume augmenté, sensibilité

% augmenté mais pic chrom.
2D 1000 ng degradé
60 1D Forte Meilleure Donc 120 µl = Vd optimum
degradation performance [205A-206A]
2D

o Donc, comme le montre le tableau ci-dessus, le volume optimal

est 120µL
 III.4 Techniques d’acquisition RMN (suite 1)

Deux techniques LC sont utilisées: LC isocratique (composition d’eluant constante) et LC à gradient

[composition d’eluent variable =f(t)]
o en isocratique LC_hNMR le déplacement  (ppm) de l’eluant est constant, car composition des
solvt const.
o En gradient LC_hNMR, ɛr = f(composition éluant ) et donc δ (ppm) des solvants change
 III.4.1 suppression du signal des solvants

On peut supprimer les signaux dùs aux solvants (de concentration très grande),

mais ceci peut masquer les signaux des analytes)

Comme dejà signalé, cette suppression est réalisée efficacement à l’aide de:

o WET sequence (Water Enhancement through T1)

o NOESY-présaturation

o SPMI (Soft Pulse Multiple Irradiation)

III.4.1 suppression du signal des solvants (suite 1)
 III.4 modes d’acquisition RMN
Actuellement 4 types d’acquisition de spectre sont utilisés en LC_RMN:
- acquisitions à flux continu OnFlow (flux direct)

- StopFlow (LC est arrêtée durant l’acquisition RMN)

- boucle de stockage LSU

(collection des pics) ‘’Loop storage’’

- stockage en SPE
(cartouche solide d'extraction)

III.4.1 NMR mode On Flow

Le mode ‘OnFlow’ est le plus simple, cependant:
o Incompatibilité avec LC à gradient (souvent nécessaire)
o Difficile de réaliser 2D spectres
o Limitation donc aux pics majeurs ( 1%)
III.4.2 NMR mode Stop Flow
En mode ‘StopFlow’; interruption LC pour des pics sélectionnés par UV/MS et acquisition NMR de ces Pics.
Ce mode permet toute sorte de spectre 1D/2D, cependant
o Diffusion du pic durant l’arrêt de LC
o Donc élargissement de pic
o Contamination des pics
 III.4.3 NMR mode Loop Storage
En mode stockage en boucle LSU (Anglais: Loop Storage), stockage des pics sélectionnés par UV/MS dans
LSU, puis transfert indépendant à la sonde d’analyse RMN
Ce mode pallie aux inconvénients onFlow et StopFlow, cependant il exige une interface assez complexe et
détection primaire UV ou MS, en particulier:
o Hypernation avec UV ou MS pour destiner les pics ciblés à l’analyse par RMN
o La séparation n’est pas influencée par le procédé global (pas de perturbations démarrage/arrêt, pas
de diffusion due au temps d’attente)
o Le processus de transfert est complètement indépendant des mesures RMN
o La contamination inter-pics est évitée (phénomène fréquent en mode StopFlow)
o Le volume stocké peut être réglé proche du volume de la cellule de détection
o Le volume est stocké dans des boucles séparées qui peuvent être lavées avant le stockage
III.4.4 NMR mode SPE
Dans la variante de collection en cartouche SPE, les pics sont stockés en cartouches en fibre.
En plus des avantages de stockages LSU, SPE a les avantages suivants:
- possibilité de substituer facilement les solvants protonés par des solvants deutérés (petites quantités)
- pré-concentration du pic avant l’entrée en sonde RMN [482A].
 III.5 Application de la plateforme LC_RMN en analyse phytochimique
L’application de la plateforme LC_NMR permet de façon rapide et économique :
- la déréplication des composés connus (bibliothèques NIST, Wiley ..)
- L’identification préliminaire rapide des composés inconnus et, en plus
- dans la majorité des cas, les résultats d’identification en ligne ont été corroborés par analyse
spectroscopique sur des substances isolées
III.5.1 Analyse en mode OnFlow (phytochimique)
Les premières analyses des composés par LC_RMN ont été réalisées en mode à flux continu "onFlow " et
"StopFlow ".
Ces études avaient en commun l’utilisation d’une sonde RMN 500MHz.
Ce mode a permis l’identification des composés majeurs , cependant vu la faiblesse de la sensibilité et la
durée très courte de l’acquisition les composés mineurs sont difficilement détectables.
Ainsi Spring et al en 1995 [210A] ont identifié par LC_NMR-OnFlow le composé ‘’guaianolide zaluzanin
C’’ et ‘’15-hydroxy- costunolide’’ dans la plante Zaluzania grayana
Un an plus tard Cavin et al 1998 [214A] identifia les polyacétylènes majeurs (Lignans et tocophérols) ds la
plante Orophea enneandra. Cependant l’identification définitive a nécessité l’isolation ciblée, suivie de
L’analyse par RMN conventionnelle.
Ce mode a aussi permis à Hocher et al en 1999 [216A], la déréplication des phenylphenalenones et
stilbene dimer, en plus de l’identification d’un nouveau phenylphenalenone, à partir d’ extrait
d’Anigozanthos flavidus.
III.5.1 Analyse en mode OnFlow/phytochimique (suite 1)
 III.5. 2 Analyse en mode stopFlow (phytochimique)
Le mode StopFlow a permis l’analyse rapide d’une large classe des phytocomposés:

Ce mode utilise LC_RMN StopFlow, sans recourir à une analyse préliminaire par LC_RMN OnFlow
o ds la majorité, une colonne RP18 avec sonde RMN 500MHz ou 600MHz
o L’arrêt du système LC pour permettre l’analyse RMN en mode stopflow est généralement déclenché par
détection UV ou rarement par MS
o Utilisation de CH3CN/MeOH) et une phase aqueuse deutérée D2O, permettant la suppression des signaux 1H
- L’étude publiée par Hansen et al en 1999 [252A] est une illustration typique des applications LC_RMN stopFlow
o ds cette etude l’espèce Hypericum perforatum a été analysée par RP18 _LC_UV_RMN Stopflow
o arrêt du système LC contrôlé par un détecteur UV_254nm et MS
o Pour faciliter l’identification des mineurs, l’extrait a été fractionné en Fr. flavonoïde et une Fr. apolaire
(hypericin)
o Utilisation RP18 et sonde RMN 600 MHz
o Résolution des composés mineurs 0.5% du pic principal au bout de plusieurs minutes à plusieurs heures en
fonction de la concentration de l’analyte
o L’hypernation LC_MS_NMR a permis l’identification aussi bien de la partie aglycone que les fonctions
glucosyl rattachées (flavonoides)
o Ces auteurs concluent qu’une concentration des analytes mineurs et l’utilisation des appareils à champs plus
fort (  500MHz ), en plus d’une optimisation plus approfondie de la séparation LC auraient un impact d’un
ordre de magnitude sur la sensibilité.
 III.5.3 analyse en mode OnFlow/Stop (phytochimique)
La combinaison de deux modes Onflow et StopFlow s’est avéré plus efficace avec analyse préliminaire
(holistique ) en OnFlow -1D (identification pics majeurs) et identification ciblée par mode StopFlow en
hypernation UV ou MS.
 III.5.4 analyse en mode Loop Storage (phytochimique)

Le mode Loop Storage (collection des pics) a été introduit pour éviter la

Contamination par diffusion remarquée lors d’application du mode stopflow

Malgré l’intérêt évident du stockage indépendant pour l’efficacité de

l’analyse RMN, l’application de ce mode à l’analyse phytochimique est pour le

moment limitée à 3 études [222A, 230A, 239A] bien que son application

date de 2000.
 III.5.5 analyse en mode Stockage sur cartouche SPE (phytochimique)

La première publication date de 2003 (Exarchou et al 2003 [231A])

Ces auteurs ont caractérisé en ligne l’extrait à l’acétone de la plante Origanum

vulgare en utilisant efficacement la méthode LC_SPE_RMN

La séparation sur colonne C18 est suivie par collection des pics sur cartouches

SPE puis ensuite évaporation à l’azote des solvants d’élution

La dernière opération prépare les cartouches SPE à l’élution par des solvants

deutérés

L’instrument 600MHz ou 400 MHz est utilisé par la plupart des auteurs,

permettant une acquisition 1D/2D pour les majoritaires et minoritaires, grâce

à la concentration des pics dans les cartouches SPE

III.5.5 analyse en mode Stockage sur cartouche SPE –phytochimique (suite 1)
 III.5.5 exemples d’analyse On/Stop, Loop/SPE

Le Spectre h_RMN parfois très chargé, mais on distingue facilement Protons

Methine(CH), méthylène (CH2), or méthyl (CH3) par traitement inform. du spectre
Le dévelopment des techniques multi-impulsions (2D) a facilité cette distinction:
*mesure selective des signaux methine, methylene et methyl:
-CH:d; CH2: t; CH3:q
*on utilise un detecteur UV ou MS pour selectionner le pic/composé ciblé
Ex . Interface stockage Loop/SPE (21Gebretsadik)
 III.5.5 exemples d’analyse On/Stop, Loop/SPE (s1)

Stockage_pics (composés) :a) Cassette/36 tubes, b) 2 unités SPE/Hollande_96

cartouches géré par PC
 III.5.5 exemples d’analyse On/Stop, Loop/SPE (s1)

Caractéristiques stockage LS/SPE

2 avantages : pas de diffusion, consommation moindre de Solv.D

2 inconvénients : nécessité de séjour allongé donc risque d’altérations PN labiles,
nécessité d’élution des pics du stockage temporaire (pompe additionnelle/solvants)
 III.5.5 exemples d’analyse On/Stop, Loop/SPE (s1)

Exemples OnFlow vs StopFlow

Sweroside/sp Swertia calycina: Spectre on/Stop-Flow du composé Sweroside
Ex H anomérique R/S de 15/StopFlow alors 4-5/onFlow, tous les H (1 à 8) ont été
facilement identifiés et les carbones anomerique, methine, méthylène et méthyl; aussi
Mais, pour obtenir les connectivités 1H-1H, pour ce secoiridoide, on a recouru à COSY
sequence-stop–flow WET (Fig. 5) avec 35min pour 2D  absence de diffusion
d’analyte
Ces données, ont permis de lier les protons de la partie glucosyl de 1 (Fig. 5).
 III.5.5 exemples d’analyse On/Stop, Loop/SPE (s1)

S/F WET_Cosy Sweroside, 30 min, (8 scans, 220 increments)

 III.5.5 exemples d’analyse On/Stop, Loop/SPE (s1)

S/F WET_Cosy Sweroside, 30 min, (8 scans, 220 increments)

Ex identification de Secoiridoide par O/F et S/F LC_NMR

Le chromatogramme
de l’extrait méthanoïque
de G. ottonis
est présenté sur la figure 6x
 III.5.5 exemples d’analyse On/Stop, Loop/SPE (s1)

Ex : MeOH Extract of ecorce_racine ER de Croton membranaceus (chrom xx )

Fig XX rpHPLC-UV Chrom. Detected UV t 300 nm (MeOH extr. ), et

Le Pic 1 à 14.3 min, domine et il est inconnu ?
 III.5.5 exemples d’analyse On/Stop, Loop/SPE (s1)

L’analyse rpHPLC_UV_NMR, donne pour le pic 1 (14.3min) le RMN spectre xx2

(S/N=287 à 3-8 ppm)
le piégeage multiple (10 fois) a permis
une excellente qualité du spectre, même
sans Suppression des Résonnances
résiduelles des solvants

fig XX2: assignements des protons de pic 1

 III.5.5 exemples d’analyse On/Stop, Loop/SPE (s1)

Aussi d’excellents 2D spectres (NOESY, gHSQC et gHMBC) ont ete obtenus (fig xx3)

L’utilisation de CD3CN sans suppression WET est possible car le signal du solvant
apparait à Résonnance 8 ppm, donc hors de la région des pics intéressants (2-40 min)