Ministère de l’enseignement supérieur et de la recherche scientifique

Université Abderahmane Mira de Béjaia

Département des Sciences Biologiques de l’Environnement

Module: Techniques de laboratoire II:

Cours n°05:

Chargée du module: Mme AYOUNI. Z

 Plan

1. DEFINITION

2. PRINCIPE

3. TYPES D’ÉLECTROPHORÈSES

(Électrophorèse , immunoélectrophorèse, Immunobuvardage (Westernblot)

4. CARACTÉRISTIQUES DES SUPPORTS

 L'électrophorèse est une technique séparative.

Elle consiste à soumettre un mélange de molécules à un

champ électrique ce qui entraine leur migration : les
molécules chargées positivement (cations) vont migrer vers
la cathode (-) et les molécules chargées négativement
(anions) vont migrer vers l’anode (+).

Elle est utilisée le plus souvent dans un but analytique (E.

analytique) mais, également, pour purifier des molécules
solubles* (E. préparative).

Elle n'est donc pas adaptée à la séparation des lipides.

La vitesse de migration de ces différentes molécules va être variable en fonction de
plusieurs paramètres:
 liées aux molécules (en plus de la charge, la masse moléculaire, la forme 3D)
 Liées au milieu de migration (nature du support, conditions physico-
chimiques).
Après la séparation, lorsqu’il s’agit de molécules qui sont incolores telles les
protéines, vient l’étape de révélation des tâches (correspondant aux molécules
séparées)sur les supports d'électrophorèse qui s'effectue par des procédés
histochimiques qui permettent de colorer les produits de dénaturation de la
protéine ou une partie chimique qui leur est associée (coloration : au bleu de
coomassie, au rouge ponceau, au vert de lissamine, par nitrate d'argent, par
substrats enzymatiques…)
Etapes d’une électrophorèse

Préparation du gel
Préparation de la cuve et introduction du tampon
électrolyte
Dépôt des échantillons
Migration par application d’un champ électrique
Révélation
III.1. Électrophorèse en veine liquide:

La méthode la plus ancienne (utilisée par

Tiselius en 1926)

Réalisée dans un tube à section carré (pour

pouvoir effectuer à travers des mesures
optiques)

Le support de ce champ est, de ce cas,

liquide et est constitué par une solution
tampon de pH et de concentration
convenables dont les ions conduisent le
courant d'un pôle à un autre (le champ
électrique étant fourni par un générateur de
courant continu).
III.2. Électrophorèse capillaire :
Elle constitue un développement récent des techniques traditionnelles
d’électrophorèse.

La principale modification c’est l’utilisation de tubes capillaires très fins en

silice fondue de 20 à 200 µm de diamètre , de 20 à 100 cm de long et l’utilisation
de hauts voltages (15-30 kV).
 Les tubes peuvent être remplis de tampon (comme l’électrophorèse
classique sur papier ou sur acétate de cellulose) ou de gels de polyacrylamide
(comme l’électrophorèse classique sur gel);
Dans ce type d’électrophorèse, les molécules atteignent des vitesses de migration
très élevées. La résolution des séparations effectuées est grandement améliorée et
le temps est très réduit.

L’identification et le dosage des molécules séparées est faite grâce à un

détecteur (d’absorbance, de fluorescence…) qui permet d’établir un tracé
(l’électrophorégramme) où chaque pic correspond à une espèce moléculaire
distincte (Contrairement donc aux méthodes traditionnelles qui utilisent des
colorants ou substrats spécifiques pour détecter les molécules séparées)
III.3. Électrophorèse de zone:

Les différents types d'électrophorèses de zones sont souvent nommés en

fonction du type de support (papier, acétate de cellulose, gel, etc.) :

 électrophorèse sur papier;

 électrophorèse sur acétate de cellulose;

 électrophorèse sur gel (amidon, agar, agarose, polyacrylamide, etc….)

 A) Electrophorèse sur gel
Constitue la technique parmi les plus
puissantes et les plus faciles à utiliser dans la
séparation des macromolécules - les gels
d’usage commun, l’agarose et le
polyacrylamide, possèdent des pores de la
taille des protéines à séparer.
L’électrophorèse sur gel est utilisée pour
séparer les macromolécules biologiques en
fonction de leur taille et de leur charge
électrique.
- les gels d’électrophorèse retardent les molécules
de taille plus grande
Caractéristiques des supports (pour électrophorèse de zones) :

 Caractéristiques des gels :

- C’est à travers les espaces libres entre les mailles « les pores » que les
molécules vont migrer. Plus les molécules sont encombrantes, plus leur
progression sera difficile donc lente;
De plus :
- Les grosses molécules qui dépassent une certaine taille elles seront
empêchées de migrer.
- Les molécules trop petites ne seront pas du tout freinées ;
Pour réaliser des séparations efficaces, on indique une fourchette de masses
moléculaires des molécules à séparer en fonction de taille des pores
(concentration du gel) :
Exemple pour le gel de polyacrylamide :
Un gel à 7% d’acrylamide (concentration) permet de séparer des protéines de
45 à 400 kDa (fourchette de masses moléculaires)

Lorsqu’on a une idée sur les molécules qu’on souhaite séparer (la fourchette
de masses moléculaires) il suffit de choisir le gel qui convient le plus;

Dans le cas contraire, soit :

on prépare un gel avec un gradient de concentrations.
 Le choix du support :

Il est dicté par la nature des molécules à séparer :

 Le gel d’agarose, peu réticulé, utilisé pour séparer des molécules de

grandes masses moléculaires : ADN, ARN

 Le gel polyacrylamide, beaucoup plus réticulé, utilisé pour séparer des

molécules de masses moléculaires moins élevées : les protéines, les
peptides, les fragments d’ADN/ARN…

 Le papier ou l’acétate de cellulose conviennent à la séparation de

molécules de petites masses moléculaires : acides aminés, … (sauf que
d’autres méthodes telles la chromatographie sont préférables à cause de la
résolution limitée de l’électrophorèse sur ses supports).
a) Électrophorèse sur gel d'agarose :
L'agarose est utilisé à des concentrations de 0,5% à 2% et permet de séparer des

molécules de très grande taille, principalement de l'ADN ou de l'ARN ;

b) Électrophorèse sur gel de polyacrylamide (ou PAGE pour Poly-Acrylamide Gel

Electrophoresis) :
Le polyacrylamide est utilisé à des concentrations de 4% à 20% et permet de séparer

des molécules plus petites : protéines, peptides et des fragments d'acides

nucléiques.
 Conditions de réalisation de l’électrophorèse sur gel :
Pour les deux types de polymères (agarose et polyacrylamide), le gel peut se
faire soit

I. En conditions natives : on parle d’électrophorèse sur gel en conditions non

dénaturantes;
II. En conditions dénaturantes : on parle d’électrophorèse sur gel en
conditions dénaturantes. Dans ce cas, on ajoute un agent dénaturant dans le
tampon :

- Un détergent, le SDS pour la séparation des protéines (on parle alors de SDS-
PAGE),
- Un agent chaotropique, l'urée, pour les acides nucléiques.
 L’électrophorèse sur gel en conditions non dénaturantes
Électrophorèse Standard
Les molécules sont
séparées dans leur état
le plus proche possible
de leur état natif.
La focalisation isoélectrique
Créer un gradient de pH dans lequel pourront
se déplacer les protéines soumises à un champ
électrique; Les protéines migreront dans ce
champ électrique;
Lorsqu’elles arrivent au pH qui correspond à
leur pI, elles s’immobilisent; Ainsi, on sépare les
protéines d’une préparation selon leur pI.
 L’électrophorèse sur gel en conditions dénaturantes

Avant leur séparation électrophorétique, les molécules subissent un traitement

dénaturant qui détruit la structure tridimensionnelle native et ce par
l'utilisation différents agents tels que l'urée ou le SDS (sodium dodécyl sulfate).
 Particularités du SDS :
 Le nombre de molécules de SDS qui se fixe sur une protéine est
approximativement proportionnel au nombre d'acides aminés qui la
composent.Donc le nombre de molécules de SDS qui se fixe sur une protéine
est approximativement proportionnel à sa masse moléculaire.

 Le SDS est une molécule chargée négativement:

En présence du SDS, toutes les protéines vont
adopter la même forme (déroulées) avec une
charge négative
 La forme n'intervient plus (puisque les protéines
sont dénaturées) et la charge native non plus.

Conclusion: Donc en présence de SDS, la seule variable qui différencie les protéines est
la masse moléculaire.
 L’électrophorèse bidimensionnelle
Combine la SDS-PAGE et la FIE : elle les applique successivement comme suit

Etapes
o Elle commence par une SDS-PAGE (verticale) :
sépare les protéines en fonction de leur masse moléculaire

o On élimine le SDS par lavage :

Pour que les protéines reprennent leurs charges natives.

o On réalise une FIE À 90°de la première migration (horizontale)

sépare les protéines selon leurs pI.

Cette méthode est principalement utilisée en génomique

 L’immunoélectrophorèse
C’est une technique ingénieuse qui combine l’électrophorèse et l’immunodiffusion.
L’électrophorèse permet de séparer les molécules de protéines en les plaçant dans un
champ électrique.

Première étape

Réalisation d’une électrophorèse en milieu gélifié à pH 8,2. Pour cela :

 On introduit une solution d’Ag dans un puits creusé dans le gel d’agarose
puis
 On applique un courant électrique pendant une période de 30 à 60 mn.
 Placées dans ce champ électrique, les protéines migrent vers l’anode et elles
se séparent les unes des autres selon leur mobilité électrophorétique.
 Deuxième étape

Lors de la deuxième étape, le courant électrique est coupé et on dépose un

antisérum(AC) dans une gouttière centrale, creusée parallèlement au sens
de la migration électrophorétique.
On laisse les réactifs diffuser pendant 18 à 24h.

Au cours de cette période, les Ag et les Ac de l’antisérum diffusent librement et

forment des arcs de précipitation. Chaque arc de précipitation, révélé par
coloration, correspond à une fraction protéique particulière.
L’immunoélectrophorèse est d’un grand intérêt clinique car elle permet de mettre en
évidence plusieurs pathologies .
 Est une technique qui permet de rechercher dans le sérum des Ac
dirigés contre différentes protéines.

Ce test sert notamment à l’identification de plusieurs agents infectieux

présents dans le sérum dont le VIH de type I, le virus de l’hépatite C…
Cette technique se réalise en deux temps :
I- On effectue d’abord une séparation des protéines sur gel de polyacrylamide
en conditions dénaturantes (SDS-PAGE en présence de -mercaptoéthanol);

II- On transfert ensuite les protéines séparées en appliquant une plaque de

nitrocellulose (ou de PVDF, de nylon …) sur la plaque de gel.
Les molécules présentes sont ensuite détectées :
On imprègne la plaque de nitrocellulose dans une solution contenant les Ac
spécifiques des protéines à détecter (Ac I);

Les complexes Ag-Ac I formés sont mis en évidence indirectement par des Ac II
marqués par un isotope radioactif ou par une enzyme.
Après élimination des Ac non fixés, on révèle la radioactivité (par application
d’un papier photographique sur la plaque de nitrocellulose) ou l’activité
enzymatique (par spectrophotométrie).
Il existe des méthodes similaires : le Southern blot (pour l’ADN), le Northern blot
(pour l’ARN)…

Les termes "Western" et "Northern" sont des jeux de mots : les premiers blots étaient
sur l'ADN, et comme ils ont été faits par Edwin Southern, ils ont pris le nom de
"Southern" (southern veut dire "du sud" en anglais ; tandis que western signifie "de
l'ouest" et northern, "du nord").
 Les marqueurs moléculaires :
Sont des protéines standards de masses
molaires connues qui servent à déterminer la
masse molaire des protéines séparées (voir
les exemples de marqueurs sur la figure).

Pour déterminer la masse

molaire d’une protéine, on
utilise une courbe standard :
Qui est une droite : log (masse
molaire)= f(mobilité relative)